朱忠誠 ，余昌俊，陳昌裕，鄭 強,3，康偉彪

自RNA被轉(zhuǎn)錄形成以后并不是以獨立的形式存在于細胞內(nèi)并發(fā)揮作用。細胞內(nèi)大量的蛋白質(zhì)與這些RNA相結合形成核糖核蛋白，在這一過程中，RNA結合蛋白(RNA binding protein,RBP)發(fā)揮了重要作用。Poly(rC)結合蛋白2 [Poly(rC) binding protein 2，PCBP2]是Poly(rC)結合家族的一種具有多功能適配蛋白，先前的研究主要集中于其參與病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯水平。近年來的研究[1]表明，PCBP2在腫瘤中既能促進腫瘤的生長，也可以在某些腫瘤中低表達，可能也扮演了抑癌基因的角色。但目前關于腸癌組織中PCBP2的表達水平及臨床意義的研究尚未見報道，PCBP2調(diào)控腸癌的進展和轉(zhuǎn)移的機制仍然未知。該研究檢測了腸癌組織及鄰近的腸黏膜中PCBP2中的表達，旨在探討PCBP2對腸癌細胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2014年2～6月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸外科三病區(qū)收治的腸癌患者50例，并隨訪4年。年齡：37～82(58.33±13.64)歲，男36例，女14例；直腸癌19例，結腸癌31例(右半結腸17例，乙狀結腸12例，橫結腸2例)；高分化9例，中分化27例，低分化14例；所有患者術前均未接受抗腫瘤治療，術后病理經(jīng)安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科醫(yī)師明確診斷。腫瘤學分型和分期均根據(jù)WHO(2006版)標準，本實驗經(jīng)安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 細胞與試劑腸癌細胞HCT116細胞由中國科學技術大學提供，DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、L-谷氨酰胺和無EDTA的胰蛋白酶均購自美國Life Technology公司；蘇木精染色液購自福州邁新生物技術有限公司，三氯甲烷、EDTA、無水乙醇、二甲基亞砜和異丙醇購自上海國藥集團化學試劑有限公司；6孔和96孔板購自上海圣納堡生物科技開發(fā)有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；HRP 標記的二抗和鼠來源的Actin一抗購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔來源的PCBP2一抗購自美國lifespan公司。

1.3 實驗方法

1.3.1免疫組化 腸癌組織及其鄰近的正常黏膜組織固定包埋后連續(xù)切片，將連續(xù)切片(5 μm厚)置于涂有10%聚賴氨酸的載玻片上。這些切片在二甲苯中脫蠟，然后通過梯度酒精重新水化。高溫和高壓可增強免疫反應性，故將這些切片在高壓滅菌器中的中煮沸20 min以回收抗原，過氧化氫(0.3%)封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。甩干多余的血清，滴加抗PCBP2抗體(1 ∶200)，4 ℃孵育過夜，使用過氧化物酶-抗過氧化物酶方法對所有載玻片進行處理。最后，將玻片用蘇木精復染色，脫水，然后固定在樹脂支架上。在奧林巴斯顯微鏡下觀察染色的切片。每張切片選取5個不同視野，由兩名主治以上的病理科醫(yī)師相互、獨立地根據(jù)染色強度和陽性細胞百分率來進行評分。半定量染色強度分析PCBP2的表達水平，0-4級分別為陰性、弱陽性(<30%)，中等陽性(30%～60%)，強陽性(>60%)。免疫組化結果評分定義為染色強度×染色陽性細胞百分率的評分所得；免疫組化評分≥3定義為表達， <3定義為不表達。

1.3.2細胞培養(yǎng) 腸癌細胞HCT116用DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，加入10%胎牛血清、鏈霉素100 μg/ml 和青霉素100 U/ml，置于5% CO2的加濕細胞培養(yǎng)箱中進行孵育培養(yǎng)，溫度控制在37 ℃。

1.3.3細胞轉(zhuǎn)染 用Lipofectamine 2000進行細胞瞬時轉(zhuǎn)染(根據(jù)試劑商提供的說明進行)，PCBP2 siRNA由上海生工合成，siRNA起始序列：CATCACTATTGCTGGCATT，空白對照組為：TTCTCCGAATGTCACGT。

1.3.4Western blot 腸癌細胞HCT116轉(zhuǎn)染72 h以后，用裂解液裂解細胞，提取細胞中的總蛋白并測出蛋白的濃度。取40 μg的蛋白樣品在的SDS-PAGE中進行電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，并置入的脫脂奶粉中常溫封閉1 h，再根據(jù)說明書要求的比例稀釋一抗，4 ℃的條件下孵育蛋白條帶過夜。至第2 d用TBST洗去多余的一抗，并加入稀釋過的HRP(1 ∶4 000)標記過的二抗在常溫下進行孵育2 h，最后再用化學發(fā)光法(ECL)檢測蛋白的表達量，驗證PCBP2轉(zhuǎn)染的有效性。本試驗重復3次。

1.3.5克隆形成實驗 HCT116細胞經(jīng)過瞬時轉(zhuǎn)染48 h以后用胰酶消化并計數(shù)，取6孔板細胞培養(yǎng)板一塊，每個孔接種細胞約1 000個，加入培養(yǎng)液為2 ml，為了減少誤差，每次設置3個平行孔，搖晃6孔板使細胞均勻分散，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔2天換1次培養(yǎng)基保證細胞生長所需營養(yǎng)并觀察細胞，連續(xù)培養(yǎng)2周。PBS清洗兩遍出去細胞殘渣和培養(yǎng)液，多聚甲醛固定細胞并過夜。用結晶紫染色1 h，計數(shù)細胞克隆的數(shù)量并且拍照，每次設置3個重復孔，本試驗重復3次。

1.3.6MTT實驗 HCT116細胞經(jīng)過瞬時轉(zhuǎn)染48 h以后用胰酶消化并計數(shù)，取96孔細胞培養(yǎng)板5塊，每個孔中加入轉(zhuǎn)染并計數(shù)的HCT116細胞大約1 000個，加入MTT試 劑( MTT：含10%的胎牛血清為1 ∶9) 100 μl，為了減少誤差設置6個平行孔，輕輕搖晃使細胞均勻鋪于底部。周圍加入PBS液減少水分蒸發(fā)對細胞生長造成的影響，置入培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后每隔24 h并且連續(xù)5 d檢測每個孔中570 nm波長的吸光度(optical density，OD) 值，作細胞增殖曲線，本實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。定量資料以K-S法進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均值±標準差描述集中趨勢，比較采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)描述集中趨勢，比較采用Wilcoxon秩和檢驗。定性資料采用卡方檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腸癌中PCBP2的表達及其與臨床病理特征的關系PCBP2在腸癌中的陽性率為72%，而在正常黏膜中的陽性率僅為40%(P=0.001)，見表1；PCBP2的表達與腸癌的淋巴結轉(zhuǎn)移情況(P=0.031)和病理分期相關(P=0.045)，與患者的年齡、腫瘤的大小以及腫瘤細胞的分化程度無明顯相關性(P>0.05)，見表2。

表1 PCBP2在結直腸癌和正常癌旁組織中的表達[n=50,n(%)]

與癌旁組織比較 ：*Z=10.390,P<0.05

表2 PCBP2表達水平與結直腸癌患者臨床病理特征相關性分析

臨床特征nPCBP2 陽性表達[n(%)]Z值P值年齡(歲) ≤ 55159 (60.0)1.5310.216 >553527 (77.1)腫瘤直徑 (cm) ≤53325 (75.8)0.6800.410 >51711 (64.7)淋巴結轉(zhuǎn)移 無3119 (61.3)4.6410.031 有1917 (89.5)腫瘤分化 高分化95 (55.6)1.6570.437 中分化2721 (77.8) 差分化1410 (71.4)腫瘤分期 Ⅰ+Ⅱ2817 (60.7)4.0200.045 Ⅲ+Ⅳ2219 (86.4)

2.2 PCBP2的表達與術后生存時間的關系術后4年隨訪發(fā)現(xiàn)，PCBP2表達陽性的患者，無論是無復發(fā)生存時間(P=0.039)還是總生存時間(P=0.037)均小于PCBP2表達陰性的患者，見圖1。

圖1 PCBP2在腫瘤組織和對應癌旁正常黏膜中的表達及生存時間 ×200

A:PCBP2在腸癌中表達陽性；B：PCBP2表達陽性的患者術后無復發(fā)生存時間小于PCBP2表達陰性的患者；C：PCBP2表達陽性的患者術后總生存時間小于PCBP2表達陰性的患者

2.3 PCBP2-siRNA的轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染了siPCBP2 的腸癌細胞HCT116中的PCBP2的表達量明顯下降(P<0.05)，見圖2A。

2.4 轉(zhuǎn)染siPCBP2對腸癌細胞增殖的影響腸癌細胞HCT116細胞中的PCBP2被抑制后第1至5天每天檢測OD值，顯示PCBP2的低表達抑制了HCT116細胞的增殖，對照組與實驗組結果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2B。

2.5 轉(zhuǎn)染siPCBP2對腸癌細胞克隆形成的影響HCT116細胞轉(zhuǎn)染了siPCBP2后，細胞的克隆形成能力明顯減低，細胞形成集落數(shù)明顯少于陰性對照組(P<0.05)，見圖2C。

圖2 PCBP2對腫瘤細胞增殖和克隆形成的影響

A:干擾了PCBP2后其蛋白量下降；B：干擾了PCBP2后細胞增殖能力受抑制；C：干擾了PCBP2后細胞克隆形成能力受抑制

3 討論

PCBP2是RNA結合蛋白家族的一員，參與了mRNA的穩(wěn)定、翻譯的沉默和加強。以往對于PCBP2的研究主要集中在與病毒的相互作用上，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，PCBP2在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也扮演了重要的角色。本研究顯示，PCBP2在腸癌中高表達，且高表達的患者無瘤生存和總生存時間均短于PCBP2不表達的患者，這表明PCBP2可以作為腸癌預后評估的因素。國內(nèi)外的一些學者也發(fā)現(xiàn)，PCBP2在大部分的實體瘤中高表達，且其高表達預示著不良的預后。他們發(fā)現(xiàn)PCBP2在胃癌[2-3]、肝癌[4]、腦膠質(zhì)瘤[5]、食道癌[6]、乳腺癌[7]等腫瘤中表達增加，可能扮演了癌基因的角色。但也有學者研究發(fā)現(xiàn)，PCBP2在口腔癌[8]中表達下調(diào)， 這與我們的研究結果及大部分的在腫瘤中的研究結果相反，這可能是由于基因的多功能性導致其在不同的腫瘤的功能不同。

在PCBP2的功能研究中，課題組發(fā)現(xiàn)，抑制PCBP2的表達可以有效地抑制腸癌細胞的增殖和克隆形成能力，提示內(nèi)源性的PCBP2對腸癌細胞的生長具有促進作用。在對其他腫瘤的研究中，Han et al[5]研究發(fā)現(xiàn)，PCBP2通過FHL3來促進膠質(zhì)瘤細胞的生長。Chen et al[2]通過對胃癌細胞的研究發(fā)現(xiàn)，PCBP2通過作用于CDK2來增強胃癌細胞的生存能力；同樣地在胃癌中，Hu et al[3]發(fā)現(xiàn)，同樣地促進胃癌細胞的生長，PCBP2是通過作用于miR-34a來發(fā)揮其癌基因的活性。