蘇 叢，徐方明，伍 婷，張鵬飛,，陳昊然，劉艷艷,,4，蘭燕虎，李家斌,,,4, 律 娜

CRISPR-Cas9基因敲除策略是目前最便利的一種基因編輯技術(shù)，其原理是將tracrRNA(trans-activating crRNA)和crRNA(CRISPR RNA)整合成一個(gè)復(fù)合體，即tracrRNA/crRNA復(fù)合體，一種具有引導(dǎo)功能的向?qū)NA (guide RNA, gRNA)；利用外源表達(dá)Cas9蛋白與人工設(shè)計(jì)的gRNA形成蛋白核酸復(fù)合物。其中，gRNA 5'端與靶DNA的20個(gè)核苷酸特異性結(jié)合，3'端可以結(jié)合并激活核酸內(nèi)切酶Cas9，引導(dǎo)Cas9對DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割，從而實(shí)現(xiàn)對目的基因的特異性剪切[1]。

巨噬細(xì)胞廣泛分布于人和動(dòng)物體內(nèi)，是一種重要的固有免疫細(xì)胞[2]。短鏈脂肪酸 (short-chain fatty acid, SCFAs)主要是腸道微生物群發(fā)酵的產(chǎn)物，可以抑制中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中促炎因子的產(chǎn)生，具有抗多種炎癥性疾病的治療潛力[3-4]。G-蛋白偶聯(lián)受體41(G protein-coupled receptor 41, GPR41)在中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞上均有表達(dá)。一般認(rèn)為，GPR41和GPR43的激活以及組蛋白去乙?；傅囊种剖荢CFAs抗感染作用的基礎(chǔ)[5-6]?，F(xiàn)利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建gpr41基因敲除的巨噬細(xì)胞系，為進(jìn)一步探討gpr41基因在巨噬細(xì)胞中的功能及機(jī)制研究提供細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株、菌種和質(zhì)粒 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞與HEK293T細(xì)胞由安徽省細(xì)菌耐藥性監(jiān)控中心保存；感受態(tài)細(xì)胞DH5α由安徽省細(xì)菌耐藥性監(jiān)控中心保存；真核表達(dá)載體pLenticrisprV2及pMD2.G、psPAX2慢病毒載體包裝質(zhì)粒均購自優(yōu)寶生物科技有限公司(上海)。

1.1.2材料與試劑 Bsmb I限制性內(nèi)切酶、T4 PNK、T4 DNA連接酶、酶切緩沖液均購自美國New England Biolabs公司；脂質(zhì)體2000(Lipofectamine 2000)購自美國Invitrogen公司；高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清均購自美國Gibco公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司；GPR41抗體購自英國Abcam公司；二抗山羊抗IgG/辣根酶標(biāo)記購自北京中杉金橋公司。引物和測序均由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 37 ℃水浴復(fù)蘇小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.2gRNA的設(shè)計(jì)和寡鏈核苷酸的合成 利用在線設(shè)計(jì)工具(http:∥www.rgenome.net/casdesigner/)，根據(jù)CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了靶向gpr41外顯子3的上下游的3對gRNA，分別命名為gRNA1、gRNA2、gRNA3。詳見表1。

1.2.3構(gòu)建含有g(shù)RNA的重組質(zhì)粒載體 BsmbI酶切pLenticrisprV2質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。見圖1。根據(jù)膠回收試劑盒說明書切膠后回收并純化，測定DNA濃度(大約50 ng/μl)。隨后將切膠后回收的DNA質(zhì)粒與退火形成雙鏈的gRNA混合，加入T4連接酶，室溫過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐抗性平板涂板篩選，挑取單菌落至氨芐抗性(100 mg/ml)的LB肉湯培養(yǎng)基中過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，送公司測序鑒定，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pLenticrisprV2-gpr41-gRNA。并將獲取的正確的質(zhì)粒分別命名為GPR41-gRNA1、GPR41-gRNA2和GPR41-gRNA3質(zhì)粒。

1.2.4慢病毒包裝與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取1 μg pLenticrisprV2-gpr41-gRNA質(zhì)粒、750 ng的psPAX2質(zhì)粒和250 ng的pMD2.G混勻，加入Lipofectamine 2000 5 μl，室溫放置25 min后病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48 h后收集HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)基，2 000 r/min、4 ℃離心10 min，吸取上清液并用0.45 mm過濾器純化病毒，于-80 ℃保存。取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種在6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度以鋪滿40%板面的飽和度適宜。細(xì)胞貼壁后，將純化的病毒呈梅花狀加至RAW264.7中，同時(shí)按1 ∶1 000的比例加入Polybrene，幫助病毒進(jìn)入細(xì)胞，1 h后更換新鮮培養(yǎng)基。第2天換液并用1×PBS洗2次，加入新鮮培養(yǎng)基。第3天起用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 d，每天以相同濃度進(jìn)行換液培養(yǎng)，殺死未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，用等量的空白質(zhì)粒做陰性對照。

1.2.5篩選穩(wěn)定敲除細(xì)胞株 經(jīng)嘌呤霉素篩選存活的細(xì)胞即為可能成功轉(zhuǎn)入pLenticrisprV2-gpr41-gRNA質(zhì)粒的細(xì)胞。經(jīng)胰酶消化后稀釋，接種至96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，每孔3～5個(gè)細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，挑單克隆細(xì)胞至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6Western blot檢測基因穩(wěn)定敲除細(xì)胞系 當(dāng)細(xì)胞長滿24孔培養(yǎng)板時(shí)，取部分細(xì)胞用RIPA裂解液提取蛋白，每個(gè)樣取30 μl和上樣緩沖液混合后金屬浴煮沸10 min變性，制備蛋白樣品后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至經(jīng)甲醇浸泡數(shù)分鐘且適當(dāng)大小的PVDF膜上，冰上轉(zhuǎn)膜1～2 h后用5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h。用β-actin抗體(1 ∶5 000)和GPR41抗體(1 ∶500)于4 ℃冰箱中過夜孵育，之后用洗脫液漂洗3次，再用相應(yīng)的山羊抗兔或山羊抗鼠的二抗(1 ∶10 000)孵育2 h，洗脫3次后用成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，觀察GPR41蛋白是否表達(dá)，以判斷gpr41基因是否敲除成功。

2 結(jié)果

2.1 gRNA寡鏈核苷酸的合成結(jié)果按照CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，利用在線設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)3對gpr41 gRNA上下游引物序列，見表1。

表1 gpr41 gRNA序列

2.2 pLenticrisprV2質(zhì)粒酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定利用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測pLenticrisprV2質(zhì)粒是否被酶切開，電泳結(jié)果顯示，對照組僅有一條沒有切開的條帶，而酶切成功的質(zhì)粒在相應(yīng)位置出現(xiàn)兩條明顯的亮條帶，見圖1。

圖1 pLenticrisprV2質(zhì)粒酶切圖

2.3gpr41基因敲除驗(yàn)證選擇野生型細(xì)胞系和敲除型細(xì)胞系在蛋白水平上檢測GPR41表達(dá)情況。

圖3 gpr41基因敲除RAW264.7細(xì)胞系的單克隆測序

Western blot結(jié)果顯示，野生型細(xì)胞中GPR41蛋白正常表達(dá)，而敲除型細(xì)胞中檢測不到GPR41蛋白的表達(dá)(圖2)。

圖2 GPR41蛋白水平檢測

2.4 單克隆測序檢測gpr41基因?qū)pr41基因中g(shù)RNA敲除靶點(diǎn)核苷酸序列測序(圖3)。gpr41基因缺失9個(gè)堿基，造成gpr41基因突變，證明對細(xì)胞進(jìn)行了成功敲除。

3 討論

巨噬細(xì)胞是形成先天免疫系統(tǒng)的骨干，幾乎存在于每一個(gè)組織中，在維持組織的穩(wěn)態(tài)和協(xié)調(diào)細(xì)胞對組織損傷的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[7-8]。

GPR41表達(dá)于巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞上，是SCFAs的受體蛋白。SCFAs是腸道微生物群發(fā)酵的最終產(chǎn)物，在減輕炎癥和改善宿主代謝方面發(fā)揮作用,是宿主重要的能量來源。SCFAs結(jié)合并激活GPR41，抑制cAMP的產(chǎn)生和ERK的級聯(lián)激活[9]。此外，SCFAs對T細(xì)胞的直接作用可以在自身免疫性腦炎中促炎，而缺乏GPR41的小鼠對自身免疫性腦炎發(fā)病機(jī)制更具抗性[10]。可見，短鏈脂肪酸及其受體對機(jī)體具有一定的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR-Cas9技術(shù)，通過慢病毒轉(zhuǎn)染，首先使RAW264.7細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白。通過凝膠電泳和測序結(jié)果可以看到，gRNA已成功連接到pLenticrisprV2載體上，證明已成功構(gòu)建了pLenticrisprV2-gpr41-gRNA載體。通過Western blot及核苷酸測序結(jié)果可以看出，經(jīng)過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，RAW264.7細(xì)胞中GPR41蛋白已不再表達(dá)，說明gpr41基因已經(jīng)被敲除。GPR41是將SCFAs與巨噬細(xì)胞相聯(lián)系的橋梁之一，但gpr41基因在巨噬細(xì)胞中的作用機(jī)制并不十分明確，且SCFAs能否通過gpr41調(diào)控巨噬細(xì)胞相關(guān)反應(yīng)以及gpr41基因敲除之后對巨噬細(xì)胞系功能的影響均不清楚，仍需進(jìn)一步的研究探索。采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建的gpr41基因敲除巨噬細(xì)胞模型更有利于探索以上科學(xué)研究。