黃建明，錢雷敏，仲衛(wèi)冬，錢建忠， 花 晨， 張 婷， 陳海姣

創(chuàng)傷性局灶性胰腺炎（post-traumatic focal pancreatitis， PTFP）為一種特殊類型的胰腺炎，臨床表現(xiàn)為血淀粉酶較低，腹水淀粉酶顯著升高，胰腺本身炎癥較輕，胰周組織炎癥水腫，常有包裹性積液及粘連，可有局限性皂性壞死，如不加干預，大部分患者可自愈，但少數(shù)患者可并發(fā)粘連性腸梗阻、腹腔出血、消化道瘺等重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）。 目前臨床針對PTFP 尚無確切有效的治療方法。 因此，尋找有效的治療方法對提高PTFP 患者治愈率、減少嚴重并發(fā)癥甚至死亡發(fā)生率至關(guān)重要。

醫(yī)用生物蛋白膠在國內(nèi)外被廣泛應用于外科手術(shù)中。 除發(fā)揮封閉組織缺損的物理作用，其還可通過新生血管形成或作為多種生長因子、前體細胞媒介促進創(chuàng)傷愈合。 本研究在建立大鼠PTFP 模型基礎上，觀察醫(yī)用生物蛋白膠對大鼠PTFP 不同時間點胰腺細胞及胰周組織的影響，為臨床PTFP 的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及處理 清潔級SD 大鼠（由南通大學動物實驗中心提供）30 只，體質(zhì)量范圍200 ～250 g，雄雌不限。 將大鼠隨機分為對照組和治療組，各15 只。

1.2 手術(shù)步驟 手術(shù)前12 h 禁食水，備皮，麻醉采用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）經(jīng)腹腔注射。 麻醉成功后，消毒，剖腹并解剖出胰腺組織，使用高頻電刀（CONMED SYSTEM 5000，模式:bipolar，功率:5 Ω）電凝胰腺被膜，選取胰腺組織較為集中區(qū)域（胃后方近脾門），灼傷面積約1 cm×1 cm。 電灼傷后治療組胰腺創(chuàng)面涂布生物蛋白膠（產(chǎn)品名稱:豬源纖維蛋白粘合劑；規(guī)格:2.5 ml；生產(chǎn)廠家:杭州普濟醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司），胰腺復位后關(guān)腹；對照組則用生理鹽水涂布胰腺創(chuàng)面。 術(shù)中注意補液，采用生理鹽水2 ml/100 g 皮下注射。 術(shù)后注意保暖，使用棉布包裹大鼠。 取材:在術(shù)后24、72 h 和7 d 3 個時間點進行解剖，每組每個時間點5 只大鼠，提取血清、腹水及胰腺組織并合理保存標本。

1.3 觀察指標 （1）手術(shù)過程中觀察試驗動物的一般狀況，監(jiān)測術(shù)后精神狀態(tài)、活動、進食、排便的變化。（2）剖腹大體觀察腹腔情況，包括腹水量。 （3）Elisa法檢測血清、腹水磷脂酶A2（PLA2）以及腹水中腫瘤壞死因子（TNF-α）水平。 （4）免疫組織化學染色及Western Blot 檢測胰腺組織PLA2 蛋白、自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1 和調(diào)控分子空泡膜蛋白1（VMP1）、磷脂酰肌醇三磷酸激酶（PI3K）、NF-κB 等表達情況。

1.4 統(tǒng)計學處理 用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，計量資料使用t 檢驗；計數(shù)資料使用卡方檢驗。 P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 2 組大鼠術(shù)后2 h 均精神萎靡，被動體位，僅頭部有間斷探索樣運動，對飲食刺激無反應。 治療組大鼠術(shù)后24 h 后均開始自由活動，主動進食，攝食量逐漸增加，在觀察點72 h 少數(shù)大鼠腹脹，均有排便行為，在3 個時相點均無大鼠死亡；對照組大鼠術(shù)后24 h 僅5 只開始活動及進食，活動遲緩，攝食少，在觀察點72 h 均主動進食，大部分大鼠腹脹，有排便行為僅2 只，在觀察點7 d，5 只大鼠攝食量增加，腹脹減輕，均有排便行為，但量少，同樣在3 個時相點均無大鼠死亡。

2.2 大體變化結(jié)果 術(shù)后24 h，2 組均有血性腹水形成，對照組明顯多于治療組；大鼠胃均有擴張，對照組胃壁及十二指腸系膜水腫明顯；對照組胰腺周圍的脂肪組織出現(xiàn)灰白色的脂肪壞死斑點，治療組則較少；胰腺腫脹，呈粉紅色，均散布細小出血壞死灶，治療組較明顯。 術(shù)后72 h，治療組大鼠胰腺呈淡紅色，輕度腫脹，創(chuàng)面面積縮小，與周圍脂肪組織界限清晰，腹腔內(nèi)液體為淡黃色，且明顯減少；對照組大鼠胰腺呈暗紅色，明顯腫脹，創(chuàng)面無明顯縮小，腹腔內(nèi)有較多暗紅色半透明滲出液。 術(shù)后7 d，2 組腹水量均較少；對照組胰腺與周圍組織界限不清，腸粘連致密，腸壁水腫；治療組胰腺與周圍組織界限清楚，易分離，腸粘連不明顯，胰腺呈粉紅色，創(chuàng)面幾乎消失。 結(jié)果見表1 和圖1。

表1 對照組和治療組大鼠術(shù)后不同時間腹水量比較（ml

表1 對照組和治療組大鼠術(shù)后不同時間腹水量比較（ml

注:與對照組比較aP ＜0.05

組別 動物數(shù) 24 h 72 h 7 d對照組 5 4.84 ±0.27 1.58 ±0.58 0.78 ±0.19治療組 5 2.26 ±0.18a 1.50 ±0.39 0.46 ±0.09a

2.3 胰腺組織鏡下病理變化 光鏡下，術(shù)后24 h，胰腺腺泡結(jié)構(gòu)改變:淺層胰腺腺泡、間質(zhì)均有充血水腫、凝固性壞死，核碎裂，核溶解等，可觀察到電灼傷所致的物理性損傷改變，可見較多充血壞死灶，以中性粒細胞為主的炎性細胞向壞死灶浸潤，治療組較對照組明顯；術(shù)后72 h，胰腺腫脹減輕，充血壞死灶少，壞死區(qū)炎性細胞浸潤減少，治療組較對照組明顯；術(shù)后7 d，呈慢性炎癥改變，充血壞死灶少見，以淋巴細胞浸潤為主，見較多組織細胞，間質(zhì)內(nèi)纖維細胞增多，治療組較對照組明顯。 見圖2。

2.4 血清和腹水PLA2 水平、腹水炎癥因子TNF-α水平 在3 個時相點治療組腹水PLA2 及TNF-α 水平均低于對照組（P ＜0.05）。 見圖3。

2.5 免疫組織化學染色檢測不同時相點胰腺組織PLA2 和自噬相關(guān)蛋白及調(diào)控蛋白 免疫組織化學染色結(jié)果顯示: PLA2 和自噬相關(guān)蛋白（LC3、Beclin1）及調(diào)控蛋白（VMP1、PI3K 和NF-кB）在胰腺組織中的表達部位相似，主要位于胰腺腺泡細胞胞漿內(nèi)。 此外，由于創(chuàng)傷后胰腺腺泡細胞的大量破壞，胞漿中的酶釋放到細胞外，腺泡細胞外的導管、纖維組織均可見PLA2 的高表達，而2 組腺泡細胞內(nèi)表達強度均較低。 除VMP1 在3 個時相點的表達對照組均高于治療組外，其他蛋白在術(shù)后24 h 和72 h 的表達強度2 組之間有特征性差異，表現(xiàn)為術(shù)后24 h 治療組胰腺細胞內(nèi)蛋白表達強度高于對照組；但術(shù)后72 h 則對照組高于治療組，且治療組術(shù)后72 h 表達強度下降，對照組則增強，隨之，表達強度均下降；術(shù)后7 d 2 組表達均呈弱陽性，但對照組的表達強度略高。 見圖4 ～9。

2.6 Western Blot 分析不同時間點胰腺組織中PLA2 和自噬相關(guān)蛋白及調(diào)控蛋白的表達變化 Western Blot 結(jié)果與免疫組織化學染色結(jié)果趨勢基本一致。 術(shù)后24 h，治療組PLA2 和自噬相關(guān)蛋白（LC3 和Beclin1）及調(diào)控蛋白（VMP1、PI3K 和NFкB）的表達高于對照組；但術(shù)后72 h，對照組上述蛋白的表達量高于治療組，治療組蛋白的表達呈下降趨勢，隨后2 組蛋白的表達量均下降；至術(shù)后7 d，對照組的蛋白表達量仍高于治療組。 見圖10。

3 討論

胰腺炎發(fā)生時，大量病理性激活的胰酶（包括胰蛋白酶、彈力蛋白酶、脂肪酶及PLA2 等）進入血循環(huán)中，產(chǎn)生破壞作用。 其中，PLA2 被激活后，作用于細胞膜和線粒體膜的甘油磷脂，分解其卵磷脂和腦磷脂中的脂肪酸分子為溶血卵磷脂，后者具有高度的細胞毒性，可以溶解破壞胰腺及體內(nèi)各組織細胞膜和線粒體膜的脂蛋白結(jié)構(gòu)，使細胞壞死，引起胰腺和胰周組織進一步廣泛壞死。 此外，PLA2 還可觸發(fā)體內(nèi)的單核巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等釋放大量內(nèi)源性炎性介質(zhì)，導致機體發(fā)生全身的炎癥反應（SIRS）［1］。 這些都是胰腺炎患者發(fā)生并發(fā)癥和導致死亡的主要原因［2-3］。

自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)的過程，是真核細胞特有的生命現(xiàn)象，主要通過對長壽命蛋白以及細胞器的降解和再利用對細胞進行調(diào)節(jié)。 研究表明，自噬是細胞生長發(fā)育、成熟分化及死亡的重要調(diào)控機制，又是細胞對不良環(huán)境的一種防御機制［4-5］。 除此之外，自噬參與多種疾病的病理過程，如腫瘤、神經(jīng)退行性病變、心臟疾病、病原體感染等［6］。 隨著對細胞自噬的分子機制的深入研究，其在疾病中的作用引起了學者廣泛的重視。 最近的研究表明自噬活性的異常改變與急性胰腺炎關(guān)系密切［7-9］，已成為目前探討急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展研究的新靶點。

圖1 手術(shù)后大鼠胰腺及胰周組織大體改變

圖2 光鏡下大鼠胰腺組織病理變化（HE 染色 ×40）

圖3 大鼠血清（A）、腹水PLA2（B）和腹水TNF-α（C）的檢測情況（C：對照組；G：治療組）

注:PLA2 為磷酯酶A2

圖5 大鼠胰腺組織自噬相關(guān)蛋白表達情況（DAB 染色 ×100）

圖6 大鼠胰腺組織Beclin1 表達情況（DAB 染色 ×100）

圖7 大鼠胰腺組織空泡膜蛋白1表達情況（DAB 染色 ×100）

圖8 大鼠胰腺組織磷酯酰肌醇三磷酸激酶表達情況（DAB 染色 ×100）

圖9 大鼠胰腺組織核因子-кB 表達情況（DAB 染色 ×100）

圖10 大鼠胰腺組織PLA2 及LC3 的表達情況（Western Blot）

本研究提示，電灼傷致創(chuàng)傷性局灶性胰腺炎大鼠模型的血清PLA2 表達早期開始增高，隨著術(shù)后時間的延長而繼續(xù)增加，術(shù)后24 h 血清PLA2 表達維持于較高值。 創(chuàng)傷后7 d，血清PLA2 表達較前期下降，但仍顯著高于對照組。 這些結(jié)果證實，胰腺創(chuàng)傷后早期主要受到電熱傷的物理性損傷，淺層的胰腺腺泡被破壞，胞漿中的酶大量釋放到細胞外，隨后化學性損傷加重胰腺炎，但深部胰腺組織結(jié)構(gòu)正常，故創(chuàng)傷性局灶性胰腺炎不至于導致血清PLA2 明顯升高，血清中PLA2 與正常大鼠無明顯差異，這與臨床上出現(xiàn)創(chuàng)傷性局灶性胰腺炎后血清淀粉酶升高不明顯一致，此不同于膽源性重癥胰腺炎表現(xiàn)，但導致胰周腹水中PLA2 水平早期明顯增加，且峰值時間在傷后72 h 出現(xiàn)并可以維持較長時間。 隨著胰腺組織的自我修復，傷后7 d 腹水中PLA2 水平有所下降，但仍較高。 本研究通過自噬相關(guān)基因及蛋白的檢測同樣發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷性局灶性胰腺炎術(shù)后24 h 自噬現(xiàn)象即明顯存在，在術(shù)后72 h 達高峰，仍持續(xù)增多，隨著胰腺組織的自我修復及慢性炎癥的形成逐漸減弱，但胰腺周圍組織的病理性損傷仍明顯，早期滲出、出血、壞死明顯，后期粘連顯著。 因此在創(chuàng)傷性局灶性胰腺炎發(fā)生后如何保護胰腺及胰周組織是值得研究的課題。

臨床已發(fā)現(xiàn)胃癌根治術(shù)中應用醫(yī)用生物蛋白膠涂布胰腺表面可減少腹水、腹腔出血及粘連，但對胰腺本身有無影響，無法判斷。 因此本研究在創(chuàng)傷性局灶性胰腺炎大鼠模型構(gòu)建成功的基礎上，進一步研究了使用生物蛋白膠后胰腺及胰周組織變化情況。

研究發(fā)現(xiàn)，生物蛋白膠在24 h 內(nèi)并沒有對胰腺組織本身發(fā)揮有利作用，僅作為隔絕炎性滲出的物理屏障。 由于胰腺腺泡細胞被大量破壞，細胞漿內(nèi)的大量酶因蛋白膠的阻擋而無法彌散稀釋，大量消化酶發(fā)生自我消化，可導致接近壞死區(qū)深部的胰腺腺泡被破壞，但由于局灶性壞死緣故，不至于并發(fā)重癥胰腺炎。因此在鏡下觀察胰腺局灶壞死區(qū)早期有大量炎性細胞浸潤，但炎性滲出帶較輕，自噬相關(guān)的調(diào)控蛋白VMP1、PI3K 及NF-κB 上調(diào)活化參與早期自噬激活的過程。 72 h 后，治療組電灼創(chuàng)面縮小，胰腺組織病理改變好轉(zhuǎn)，PLA2、自噬相關(guān)蛋白表達下調(diào)，生物蛋白膠后期又發(fā)揮促進胰腺組織修復的功能，其中的機制尚不明確，可能與生物蛋白膠可促進新生血管形成或作為多種生長因子、前體細胞媒介促進創(chuàng)傷愈合有關(guān)［10-12］。

綜上，醫(yī)用生物蛋白膠全程對胰腺周圍組織具有保護作用，早期對胰腺起到隔絕創(chuàng)傷性局灶性胰腺炎的物理作用，后期發(fā)揮生物活性對胰腺創(chuàng)面進行修復。