孔亞茹，周小楓，熊浩銘，張 哲，張 豪，李加琪，袁曉龍

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實驗室，廣東 廣州 510642）

卵泡是哺乳動物卵巢的基本功能單位，卵泡發(fā)育是一個連續(xù)的、有選擇性的過程。在哺乳動物胚胎期，原始生殖細(xì)胞遷移至生殖嵴分化為生殖細(xì)胞，進(jìn)而分化為卵原細(xì)胞。經(jīng)增殖遷移至卵巢皮質(zhì)，隨即發(fā)育為原始卵泡。卵巢中的原始卵泡經(jīng)過募集、選擇和優(yōu)勢化等過程，逐步發(fā)育為初級卵泡、次級卵泡、有腔卵泡和成熟卵泡[1]。受促卵泡激素（Folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH）、雌激素、促黃體素（Luteinizing hormone，LH）、促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH） 信號通路、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）信號通路、凋亡和自噬信號通路等的調(diào)控[2]，卵巢組織發(fā)生重塑，包括卵泡腔的形成、擴(kuò)張和卵泡液的積累，使卵泡形態(tài)和功能發(fā)生周期性的變化，形成成熟的卵母細(xì)胞，對動物的繁殖具有重要作用。

卵巢卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)及卵泡液中含有大量的明膠蛋白、纖維蛋白和IV型膠原蛋白等，這些活性蛋白為卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的遷移、增殖和分化提供了必要條件?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組鋅依賴性的內(nèi)肽酶，由鈣保持穩(wěn)定，分為膠原酶、明膠酶、溶血素、基質(zhì)溶素、膜型MMPs和其他MMPs[3]。MMPs通過與相關(guān)的內(nèi)源性抑制劑協(xié)同作用，能夠酶解膠原、明膠、纖連蛋白和層粘連蛋白等胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的主要成分[4]，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號通路，介導(dǎo)細(xì)胞微環(huán)境變化，從而影響著細(xì)胞的存活、形態(tài)、組織修復(fù)和特異性功能變化[5]，在胚胎發(fā)育、子宮重塑、傷口愈合、乳腺形態(tài)發(fā)生等生理過程中發(fā)揮重要作用[6]。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP2）和酶-9（MMP9）屬于明膠酶，能夠特異降解Ⅳ型膠原的一種基質(zhì)水解酶。MMP2和MMP9結(jié)構(gòu)相似，兩者的表達(dá)分別在在轉(zhuǎn)錄水平、酶原活化水平和酶活性水平相互調(diào)節(jié)。在內(nèi)皮素-1、白細(xì)胞介素-1β、血管緊張素Ⅱ、腫瘤壞死因子-α、雌激素、孕酮和缺氧等因素的影響下，明膠酶明顯上調(diào)，酶解ECM中的Ⅳ型膠原等蛋白，改變組織形態(tài)[7]。它們不僅能降解多數(shù)大分子細(xì)胞外基質(zhì)，還能激活生長因子，參與雌激素信號通路，影響雌激素的合成，進(jìn)而參與卵泡發(fā)育。本文重點(diǎn)對MMP2和MMP9的生物學(xué)特性及其在哺乳動物卵泡生長、排卵、黃體化及閉鎖過程中的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行綜述。

1 MMP2和MMP9的生物學(xué)特性

1.1 MMP2的生物學(xué)特性

金屬蛋白酶是一種含有金屬鈣和鋅，結(jié)構(gòu)高度同源的內(nèi)肽酶。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200多種金屬蛋白酶，其中有40種屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族。MMPs分為膠原酶、明膠酶、溶血素、基質(zhì)溶素、膜型MMPs和其他MMPs。其中MMP2屬于明膠酶。最初從人類類風(fēng)濕滑膜成纖維細(xì)胞中純化出MMP2蛋白，隨后發(fā)現(xiàn)其分子量為72 ku[8-10]。在人類基因組中，MMP2基因長27.9 kb，包含13個外顯子和12個內(nèi)含子，位于染色體上的16q12.2。人的MMP2基因首先翻譯成無活性的酶原，該酶原由5個結(jié)構(gòu)域組成（N端結(jié)構(gòu)域、自身抑制性結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)和血凝素結(jié)構(gòu)域）[11]，其中血凝素結(jié)構(gòu)域決定底物特異性，鉸鏈區(qū)與血凝素結(jié)構(gòu)域的連接對于活化MMP2至關(guān)重要。催化結(jié)構(gòu)域中3個重復(fù)的纖連蛋白結(jié)構(gòu)域，可與明膠蛋白特異性結(jié)合，以及與明膠和層粘連蛋白結(jié)合，進(jìn)而降解ECM中的明膠，Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原，彈性蛋白，纖連蛋白，蛋白聚糖等[12-13]。由于ECM是細(xì)胞存活的微環(huán)境，因此MMP2能通過酶解明膠蛋白影響細(xì)胞的生長、增殖和遷移[14]。MMP2還與肌節(jié)蛋白、膜受體、細(xì)胞因子和生長因子相互作用，從而調(diào)節(jié)血管生成、組織重塑的生理過程以及腫瘤和關(guān)節(jié)炎等病理過程[15]。

1.2 MMP9的生物學(xué)特性

MMP9也屬于明膠酶，是MMPs家族中分子量最大的明膠酶，于1974年首次在人類中性粒細(xì)胞中分離，稱為“中性粒細(xì)胞明膠酶”[16]。人類的MMP9基因長9.9 kb，含有13個外顯子和12個內(nèi)含子，位于染色體上的20q13.12，分子量為92 ku。MMP9蛋白結(jié)構(gòu)與MMP2結(jié)構(gòu)相似，人MMP9蛋白的主要結(jié)構(gòu)有NH2-末端親和域、催化域、連接域和COOH-末端血凝素結(jié)構(gòu)域。鋅離子與MMP-9富含半胱氨酸的基序相互協(xié)調(diào)，首先形成無活性的MMP9蛋白酶原；血凝素結(jié)構(gòu)域與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑3和抑制劑1在高爾基體分泌前形成緊密的復(fù)合物，從而能夠抑制其他基質(zhì)金屬蛋白酶[17]。MMP9與MMP2功能也相似，纖維連結(jié)蛋白結(jié)構(gòu)域的高度糖基化，能與變性膠原或明膠結(jié)合，酶解膠原或明膠蛋白[15]，且MMP9底物還有蛋白聚糖、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等[18]。由于ECM是細(xì)胞遷移的屏障，在胚胎發(fā)育中MMP9可通過作用于特定底物介導(dǎo)細(xì)胞遷移[19]。MMP9也可通過一些生物活性分子，如血管素、白細(xì)胞介素-8和血管內(nèi)皮生長因子等，影響著血管新生和腫瘤等生命活動[20]。由于在卵泡發(fā)育過程中，卵泡的形態(tài)發(fā)生了顯著變化，隨著ECM大量的降解和重塑，MMP9可以通過酶解ECM成分誘導(dǎo)細(xì)胞遷移，以及調(diào)節(jié)其抑制劑的活性來影響其他生物分子的活性，影響卵泡發(fā)育。

2 MMP2和MMP9對卵泡發(fā)育的影響

在哺乳動物卵泡發(fā)育的過程中，一部分原始卵泡經(jīng)過選擇逐漸發(fā)育形成成熟卵泡，排出卵母細(xì)胞，隨后形成黃體，促進(jìn)新一輪的卵泡發(fā)育；另一部分卵泡經(jīng)過閉鎖被淘汰。MMP2和MMP9能降解Ⅳ型膠原蛋白等ECM組分，促使改變卵泡形態(tài)，對哺乳動物的卵泡發(fā)育發(fā)揮重要作用。目前已有許多關(guān)于MMP2和MMP9對卵泡發(fā)育調(diào)控的研究（表1、表2）。

2.1 對卵泡生長的影響

在哺乳動物體內(nèi)，卵泡由原始卵泡逐步發(fā)育為初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡。在卵泡生長中伴隨著廣泛的血管生成、顆粒細(xì)胞大量增殖、卵泡擴(kuò)張以及卵泡液積聚[21]。卵巢組織中包含大量的膠原蛋白和非膠原蛋白，其中卵泡膜ECM中的膠原蛋白主要含有Ⅳ型膠原蛋白；卵泡的ECM中富含彈性蛋白、蛋白聚糖與氨基聚糖等。MMP2和MMP9可能通過分解ECM的活性蛋白，影響顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移，進(jìn)而影響卵泡的發(fā)育。小鼠卵泡中MMP2和MMP9蛋白主要存在于卵泡組織重塑的位置，mRNA和蛋白表達(dá)量與卵泡的直徑成正比[22]。MMP2和MMP9在小腔卵泡顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中合成和分泌，由于優(yōu)勢卵泡選擇發(fā)生在腔狀卵泡階段，推測它們參與了優(yōu)勢卵泡的選擇過程[23]。為了進(jìn)一步研究MMP2和MMP9在卵巢內(nèi)的表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)MMP9的表達(dá)量在正常豬卵泡發(fā)育各階段均高于小型豬，而MMP2的表達(dá)量在小型豬卵巢中卻高于正常豬[24]，推測MMP2和MMP9可分別參與正常和小型豬卵巢卵泡的發(fā)育。體外研究表明，MMP2表達(dá)量在2～6 mm牛卵泡中與雌二醇（E2）濃度成正相關(guān)，與孕酮（P4）濃度呈負(fù)相關(guān)，從而參與雌激素受體信號通路，影響雌激素的合成[25]，推測MMP2通過雌激素信號通路參與卵泡發(fā)育調(diào)控。此外，MMP2可通過激活表皮生長因子受體（EGFR），觸發(fā)下游信號通路，增加活性氧的形成，促進(jìn)血管收縮，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育中血管的重塑[26]。由于維甲酸通過調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)改變組織形態(tài)，用維甲酸處理的卵巢，MMP9蛋白表達(dá)量升高，從而促進(jìn)卵泡的體外活化[27]。這些研究表明，MMP2和MMP9可能通過分解卵泡液中的明膠蛋白、纖維蛋白和Ⅳ型膠原蛋白等，影響卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞的功能和卵泡腔的形成及擴(kuò)張，進(jìn)而影響卵泡生長發(fā)育。

表1 MMP2對卵泡發(fā)育調(diào)控的研究進(jìn)展Table 1 Research progress of MMP2 in regulation of follicle development

表2 MMP9對卵泡發(fā)育調(diào)控的研究進(jìn)展Table 2 Research progress of MMP9 in regulation of follicle development

2.2 對排卵的影響

排卵即卵泡發(fā)育成熟、卵泡壁分解破裂形成小孔并釋放卵母細(xì)胞的過程。卵泡發(fā)育至成熟時為保持內(nèi)部壓力，卵泡頂端細(xì)胞死亡退化和血管破裂，最終導(dǎo)致卵泡膜變薄形成卵泡點(diǎn)；在P4和LH作用下，激活蛋白水解酶活性，卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞分離以便卵泡破裂釋放出卵子和卵泡液[28]。由于格拉夫卵泡破裂原因可能是卵泡液中的蛋白水解酶消化卵泡膜[29]，因此確定哺乳動物卵泡排卵所必需的蛋白酶一直備受關(guān)注。在排卵前隨著卵泡發(fā)育，卵泡內(nèi)MMP2和MMP9的表達(dá)逐漸增加，一方面促進(jìn)卵泡發(fā)育，另一方面也為排卵做準(zhǔn)備，保證卵子釋放；在排卵時，通過檢測卵泡液成分，發(fā)現(xiàn)MMP2和MMP9活性增加，其中MMP2是主要蛋白酶[30]。因此，MMP2可能參與排卵過程。在卵泡成熟、E2濃度達(dá)到最大值時出現(xiàn)LH峰，并在LH刺激下，成熟卵泡完成排卵。MMP2蛋白水平與E2峰值呈顯著正相關(guān)，人類卵泡膠原蛋白表達(dá)水平在成熟卵泡中顯著降低，說明MMP2可能通過降解卵泡膠原蛋白進(jìn)而促進(jìn)卵泡成熟[31]。進(jìn)一步研究明膠酶在排卵中的作用，發(fā)現(xiàn)在小鼠卵巢中，注射LH能夠顯著上調(diào)MMP2基因mRNA的表達(dá)，而對MMP9的mRNA表達(dá)量卻無明顯影響[32]。在大鼠中注射人絨毛促性腺激素（hCG）或在觀察到LH峰之后，MMP2 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著增加；且MMP2的mRNA和蛋白表達(dá)量在成熟卵泡的顆粒細(xì)胞中也上調(diào)[33]，由此推測，LH可能通過調(diào)控MMP2的分泌進(jìn)而影響排卵。用LH刺激綿羊卵巢后，成熟卵泡中MMP2的酶活性顯著升高，從而促進(jìn)排卵[34]。

除MMP2促進(jìn)排卵，有些研究也發(fā)現(xiàn)MMP9參與排卵過程。在卵泡逐漸發(fā)育過程中，發(fā)現(xiàn)MMP9的表達(dá)量隨卵泡發(fā)育成熟而顯著增加，發(fā)育良好的成熟卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中表達(dá)量最多，提示MMP9參與排卵過程[23]。在大鼠卵巢中，MMP9的mRNA和蛋白在受到LH刺激后表達(dá)量顯著上升[35]，LH濃度的不斷增加會刺激卵泡成熟，推測LH可誘導(dǎo)MMP9的產(chǎn)生，對卵泡排卵具有重要作用。這些證據(jù)表明，MMP2和MMP9可能通過激素相關(guān)刺激，促進(jìn)顆粒細(xì)胞膜的溶解和卵泡頂端碎裂，參與協(xié)調(diào)哺乳動物卵母細(xì)胞的釋放。

2.3 對黃體形成的影響

成熟卵泡破裂、排出卵母細(xì)胞后，卵泡壁塌陷褶皺，卵泡膜血管破裂流血凝集到卵泡腔，從而形成紅體。同時FSH誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞表達(dá)LH受體，在出現(xiàn)LH排卵峰后促進(jìn)顆粒細(xì)胞的黃體化，最終卵泡腔充滿膜血管、成纖維細(xì)胞形成黃體[1]。眾多研究證明，ECM結(jié)構(gòu)的降解可擴(kuò)大黃體化，對黃體的形成和退化具有重要作用。

利用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)在假孕大鼠卵巢黃體的形成到退化過程中，MMP2基因的mRNA表達(dá)水平逐漸降低，這說明MMP2可能在黃體的組織重塑中發(fā)揮重要作用[32]。例如，MMP9 mRNA在豬黃體退化期的表達(dá)水平顯著升高[36]。比較恒河猴黃體退化早期、中期、中晚期、晚期和最晚期的和MMP9表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MMP2在早期和晚期表達(dá)較高，MMP9在黃體晚期表達(dá)最高[37]。這些結(jié)果說明，MMP2和MMP9在黃體的組織重塑中發(fā)揮著重要作用。由于黃體形成需要大量的細(xì)胞和血管生成，因此有研究發(fā)現(xiàn)利用LH處理無垂體幼鼠，MMP2和MMP9均能促進(jìn)大鼠卵巢黃體化以及降解卵泡膜，從而促進(jìn)膜細(xì)胞遷移到顆粒細(xì)胞層，誘導(dǎo)血管新生[38]。對奶牛注射GnRH和前列腺素F（PGF）后，MMP2和血管生成因子的mRNA和蛋白表達(dá)量在黃體生成期均顯著升高，在黃體退化期，血管生成因子減少，MMP2和MMP9蛋白酶表達(dá)量增加，進(jìn)而參與毛細(xì)血管的降解和黃體細(xì)胞的凋亡[39]。這些結(jié)果證明，ECM重塑發(fā)生在整個黃體期，MMP2和MMP9可能有助于增強(qiáng)細(xì)胞分化、血管生成等；MMP2可能參與黃體的形成和退化，而MMP9可能僅參與黃體退化過程。

由于黃體形成和退化均受激素調(diào)節(jié)，因此MMP2和MMP9也能受某些激素的調(diào)節(jié)進(jìn)而影響黃體形成。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠中LGR4基因通過調(diào)節(jié)WNTs的活性促進(jìn)MMP9 mRNA翻譯，進(jìn)而激活EGFR-ERK信號通路影響黃體成熟[40]。用LH和非代謝黃體酮分別處理恒河猴，兩個處理組黃體中的MMP2和MMP9 mRNA表達(dá)量和蛋白活性較對照組顯著降低[41]，因此LH可能通過促進(jìn)MMP2和MMP9 mRNA或蛋白水平提高明膠酶活性，進(jìn)而影響黃體退化。結(jié)果表明，性激素可能通過調(diào)控MMP2和MMP9的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而影響黃體的形成和退化。此外，培養(yǎng)黃體化顆粒細(xì)胞發(fā)現(xiàn)hCG處理的顆粒細(xì)胞中MMP2表達(dá)量顯著降低，說明hCG能抑制MMP2的表達(dá)，從而穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)，延長黃體功能，提示妊娠早期對維持黃體功能具有重要作用[42]。

2.4 對卵泡閉鎖的影響

卵泡閉鎖主要表現(xiàn)為顆粒細(xì)胞層減少，分泌的雌激素減少，P4濃度增加，顆粒細(xì)胞的促性腺激素受體減少，胞質(zhì)溶解退化，且伴隨著明顯的組織重塑[43]。顆粒細(xì)胞的過度凋亡是卵泡閉鎖的標(biāo)志。

卵泡液含有大量明膠蛋白、纖維蛋白和IV型膠原蛋白等[44]，這些活性蛋白為顆粒細(xì)胞的遷移、增殖和分化提供了必要的條件。MMP2因能分解卵泡液中明膠蛋白、纖維蛋白和IV型膠原蛋白，可直接調(diào)控顆粒細(xì)胞的凋亡和增殖[45]。同時，在牛[46]、貓[47]和羊[48]的閉鎖卵泡液中，MMP2的mRNA表達(dá)量顯著高于正常卵泡。用明膠酶譜檢測2～6 mm奶牛卵泡液內(nèi)的明膠酶活性，發(fā)現(xiàn)MMP2和MMP9蛋白在閉鎖卵泡中的活性顯著高于正常卵泡；同時，閉鎖卵泡中E2與P4的含量也顯著降低[49]，推測MMP2和MMP9表達(dá)量可能是卵泡閉鎖的標(biāo)志。由于大量的顆粒細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)卵泡閉鎖，MMP2和MMP9蛋白可能有利于卵泡壁的顆粒細(xì)胞過度凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致卵泡閉鎖。在初級卵泡和次級卵泡顆粒細(xì)胞中，馬絨促性素（equine chorionic gonadotropin，eCG）能顯著上調(diào)MMP2蛋白表達(dá)水平，并促進(jìn)卵泡閉鎖[50]。但是卵泡過度閉鎖改變卵泡的ECM，可致使細(xì)胞粘附分子表達(dá)量下調(diào)，從而引起多囊卵巢綜合征[51]。研究發(fā)現(xiàn)，在人的多囊卵巢綜合征卵巢黃體化的顆粒細(xì)胞中，MMP2和MMP9的表達(dá)量顯著高于在正常卵泡中黃體顆粒細(xì)胞的表達(dá)量，同時，在人的多囊卵巢卵泡液中的MMP2和MMP9的表達(dá)量顯著高于正常卵巢卵泡液中的表達(dá)量[52]。這些證據(jù)表明，MMP2和MMP9可能通過影響顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡，進(jìn)而在卵泡閉鎖過程中起著重要的作用。

3 結(jié)語

在卵巢周期性變化中，由于蛋白水解和血管發(fā)生，導(dǎo)致ECM降解和重塑，卵泡發(fā)生了組織重塑。卵泡液和卵泡膜中含有大量的明膠蛋白、纖維蛋白和Ⅳ型膠原蛋白等蛋白，這些活性蛋白為卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞遷移、增殖和分化提供了必要條件。MMP2和MMP9作為水解ECM的關(guān)鍵酶類，能分解卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞及卵泡液中的明膠蛋白、纖維蛋白和Ⅳ型膠原蛋白等，參與卵泡腔的形成及擴(kuò)張、排卵、黃體化及閉鎖等過程，對維持卵巢的正常功能具有重要作用。若MMP2和MMP9表達(dá)異常，卵巢功能則發(fā)生變化，導(dǎo)致卵巢疾病發(fā)生，甚至致使卵巢功能發(fā)生障礙，如卵泡發(fā)育異常、排卵受阻、黃體不全、誘發(fā)卵巢癌等癌癥發(fā)生等。目前針對MMP2和MMP9的表達(dá)模式研究甚多，關(guān)于多種因子和途徑對MMP2和MMP9的精確調(diào)控機(jī)制仍需深入研究，這將有助于進(jìn)一步了解MMP2和MMP9對卵巢疾病的發(fā)病機(jī)制，為相關(guān)疾病的診斷和治療提供新方向。