何曉，沈豪飛，姚瑩，張學(xué)紅

卵巢顆粒細(xì)胞在卵泡形成竇腔時(shí)，分化為卵丘細(xì)胞(cumulus cells,CC)和壁層顆粒細(xì)胞(mural granulosa cells,MGC)。CC突起的尖端穿過透明帶，終止于卵母細(xì)胞膜,從而形成卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體。CC通過縫隙連接與卵母細(xì)胞進(jìn)行雙向信息傳遞，進(jìn)而有助于卵母細(xì)胞的成熟、受精與早期胚胎發(fā)育[1]。MGC表面存在多種受體，并且能夠分泌多種激素和細(xì)胞因子，以自分泌和旁分泌的方式調(diào)節(jié)卵泡生長發(fā)育和成熟[2]。研究表明，在卵母顆粒細(xì)胞復(fù)合物中加入顆粒細(xì)胞可改善卵母細(xì)胞的代謝，有助于其在體外生長[3]。還有其他實(shí)驗(yàn)支持顆粒細(xì)胞質(zhì)量的下降和凋亡的增多會(huì)影響卵母細(xì)胞質(zhì)量以及受精率和妊娠率[4]。由此可見，對(duì)顆粒細(xì)胞功能的研究很必要。MicroRNA(miRNA)是一類高度保守的小型非編碼RNA，大小一般為18～24個(gè)核苷酸，通過互補(bǔ)結(jié)合其靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)，從而參與轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、腫瘤形成等生物學(xué)過程。目前在生殖領(lǐng)域中，對(duì)其研究主要集中在以下三個(gè)方面：① miRNA調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟的方式[5]。② miRNA在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞雙向通信過程中的作用[1]。③ miRNA在子宮內(nèi)膜異位癥等生殖疾病中的作用[6]。在查閱大量文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，之前研究大多停留在miRNA在卵巢顆粒細(xì)胞不同階段中的差異性表達(dá)，以及對(duì)細(xì)胞功能的影響，但具體調(diào)控機(jī)制和下游因子改變的認(rèn)識(shí)較淺，因此本文就近年來miRNA在顆粒細(xì)胞凋亡、增殖和類固醇激素合成中的作用和調(diào)控機(jī)制予以綜述。

1 miRNA對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控

凋亡是一種程序性的細(xì)胞死亡，半胱天冬酶(caspase)又稱凋亡蛋白酶，凋亡相關(guān)因子通過caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)DNA片段化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的主要原因之一，而閉鎖是卵泡生長發(fā)育和維持的重要環(huán)節(jié)。卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)指40歲之前因卵巢功能衰竭所致的閉經(jīng)，伴隨血促性腺激素過多和雌激素過少，顆粒細(xì)胞凋亡在POF發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，通過研究卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制可對(duì)POF的診療提供幫助。

1.1 促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡的miRNA

Zhou等[7]發(fā)現(xiàn)miR-150促進(jìn)綿羊卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，在體外過表達(dá)miR-150增加促凋亡因子Bax和caspase3的表達(dá)，減少類固醇生成性急性調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，與黃體期顆粒細(xì)胞相比miR-150在卵泡期顆粒細(xì)胞中的表達(dá)增加，這與黃體期顆粒細(xì)胞凋亡增多引起卵泡閉鎖相吻合。此現(xiàn)象引導(dǎo)研究者們繼續(xù)探索miRNA對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響。過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha,PPARGC1A)是線粒體合成的關(guān)鍵因子，其可通過多種途徑減輕氧自由基損傷、抑制炎癥反應(yīng)、抑制凋亡。過氧化氫處理后的山羊顆粒細(xì)胞凋亡，miR-1197-3p表達(dá)顯著上升而PPARGC1A表達(dá)顯著下降，miR-1197-3p抑制劑可減輕過氧化氫對(duì)細(xì)胞的凋亡并增加PPARGC1A的表達(dá)。miR-1197-3p可能通過線粒體依賴性細(xì)胞凋亡途徑靶向PPARGC1A調(diào)控細(xì)胞凋亡[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-31和miR-143通過抑制卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)受體的miRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)促進(jìn)牛顆粒細(xì)胞的凋亡，此外過表達(dá)miR-31減少孕酮的合成，過表達(dá)miR-143同時(shí)減少孕酮和雌激素的合成，miR-31和miR-143的抑制劑對(duì)激素水平起反作用[9]。在基因轉(zhuǎn)錄過程中轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮重要的調(diào)控作用，類固醇生成因子1(steroidogenic factor 1,SF1)通過結(jié)合編碼miR-202-5p基因附近啟動(dòng)子區(qū)域，激活轉(zhuǎn)化生長因子βII型受體(transforming growth factor receptor 2,TGFβR2)，在mRNA和蛋白質(zhì)水平上降解TGFβR2減弱TGFβ/Smad信號(hào)通路傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)山羊顆粒細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖[10]。卵泡閉鎖是卵泡發(fā)育、成熟和正常排卵中重要的生理過程，卵泡閉鎖的加快導(dǎo)致POF患者異常排卵或不排卵，在收集臨床標(biāo)本后，Chen等[11]發(fā)現(xiàn)miR146a在POF患者血漿和卵巢顆粒細(xì)胞表達(dá)顯著高于正常女性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR146a同時(shí)靶向白介素1受體相關(guān)激酶和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，此外，caspase抑制劑可減弱miR146a對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響。由此可推測miR146a通過調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡參與POF的發(fā)病，但能否作為POF的預(yù)測和診斷依據(jù)，尚需結(jié)合臨床進(jìn)行深入研究。由上可知，miRNA通過調(diào)控靶基因促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)而參與卵泡閉鎖及POF發(fā)生發(fā)展等過程，或許miRNA能夠作為POF等疾病的臨床指標(biāo)和治療策略。

1.2 抑制顆粒細(xì)胞凋亡的miRNA

目前研究發(fā)現(xiàn)抑制顆粒細(xì)胞凋亡的miRNA相比促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡的miRNA較少，現(xiàn)總結(jié)目前研究最透徹的三種miRNA：miR-181b、miR-222、miR-21。

Smads家族在TGFβ信號(hào)通路中扮演重要角色，不同Smad對(duì)TGFβ信號(hào)通路有不同的影響。Smad7影響TGFβR1的穩(wěn)定性并阻礙TGFβR1與Smad2/3的結(jié)合，最終破壞TGFβ信號(hào)通路，該通路異常會(huì)影響顆粒細(xì)胞功能和卵母細(xì)胞成熟。在豬卵泡閉鎖過程中下調(diào)的miR-181b可直接作用于Smad7基因，抑制顆粒細(xì)胞凋亡[12]。miR-222直接靶向血小板凝血酶蛋白1(thrombospondin1,THBS1)的3′UTR，miR-222模擬物抑制THBS1的mRNA和蛋白質(zhì)，并導(dǎo)致抗凋亡因子Bcl-2上調(diào)，促凋亡因子caspase3下調(diào)；miR-222抑制劑促進(jìn)THBS1表達(dá)，減少Bcl-2表達(dá)，但對(duì)caspase3無明顯影響。miR-222通過影響THBS1抑制豬顆粒細(xì)胞凋亡[13]。當(dāng)發(fā)現(xiàn)miR-21可抑制顆粒細(xì)胞凋亡后，研究者在體外用miR-21轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)與化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠POF顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)，可有效抑制顆粒細(xì)胞的凋亡，同時(shí)磷酸酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)和程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)表達(dá)下調(diào)。下調(diào)的磷酸化PTEN激活蛋白激酶B途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞生長和增殖，并抑制細(xì)胞凋亡。PDCD4通過脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，PDCD4的下調(diào)保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷所致的凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將miR-21轉(zhuǎn)染的MSC移植到大鼠雙側(cè)卵巢，結(jié)果表明大鼠卵巢重量和不同階段卵泡數(shù)目增加，雌激素水平增加而FSH水平降低。這意味著過表達(dá)miR-21促進(jìn)MSC對(duì)POF的修復(fù)作用，這對(duì)POF患者改善卵巢功能提供了新的診療思路[14]。

2 miRNA對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的調(diào)控

顆粒細(xì)胞的增殖功能對(duì)于卵泡發(fā)育、成熟和閉鎖至關(guān)重要。多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是常見的因排卵障礙引起的不孕類型，已觀察到PCOS患者顆粒細(xì)胞的增殖率顯著上升，通過總結(jié)顆粒細(xì)胞增殖與miRNA的關(guān)系，為PCOS的發(fā)病機(jī)制和診療提供幫助。

2.1 miRNA在正常顆粒細(xì)胞增殖中的作用

為證明miR-320在顆粒細(xì)胞增殖中的作用，Yin等[15]在體內(nèi)和體外鼠顆粒細(xì)胞中過表達(dá)miR-320，均表現(xiàn)為顆粒細(xì)胞增殖受抑制，并且miR-383能夠增強(qiáng)miR-320對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的抑制作用。miR-10b通過靶向腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotropic factor,BDNF)抑制山羊顆粒細(xì)胞的增殖，BDNF具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，進(jìn)一步研究將miR-10b與BDNF聯(lián)合治療發(fā)現(xiàn)促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，可見miR-10b的抑制作用可通過BDNF的重新加入而逆轉(zhuǎn)[16]，可考慮使用靶基因制劑去改善miRNA對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的抑制作用。miR-224可通過靶向Smad4抑制小鼠顆粒細(xì)胞的增殖和雌激素的釋放，Liang等[17]在此基礎(chǔ)從轉(zhuǎn)錄水平出發(fā)，發(fā)現(xiàn)p53和p65因子通過結(jié)合miRNA-22的宿主基因GABAA受體ε亞基啟動(dòng)子下調(diào)miR-224，上調(diào)靶基因，由此思考是否可反調(diào)控miRNA來治療相關(guān)疾病。miR-181a通過靶向激活素受體IIA(activin receptor IIA,AcvrIIa)減少增殖細(xì)胞核抗原的積累抑制顆粒細(xì)胞增殖[18]。特別的是Yan等[19]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-145通過靶向AcvrIb抑制小鼠顆粒細(xì)胞增殖，而Xu等[20]發(fā)現(xiàn)miR-145通過靶向Krüppel樣因子4保護(hù)小鼠顆粒細(xì)胞免受氧化應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡，因此miR-145在小鼠顆粒細(xì)胞中的作用仍需要更多的研究去證實(shí)。

2.2 miRNA在多囊卵巢綜合征患者顆粒細(xì)胞增殖中的作用

miR-93在PCOS患者中過表達(dá)，通過靶向細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A增強(qiáng)永生化人顆粒腫瘤細(xì)胞的增殖，但不能排除高胰島素血癥和高雄激素對(duì)miR-93的影響，此現(xiàn)象僅在PCOS患者中發(fā)現(xiàn)，因此miR-93對(duì)健康顆粒細(xì)胞是否有調(diào)節(jié)作用仍需更加全面的研究[21]。PCOS患者中上調(diào)的miRNA還有miR-3940-5p、miR-140、miR-129和miR-17-5p等[17,22-25]。相反，在PCOS患者中低表達(dá)的miR-145、miR-483和miR-483-5p分別通過靶向胰島素受體底物1、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)、IGF2抑制顆粒細(xì)胞增殖[26-28]。近期研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者中低表達(dá)的miR-129和miR-17-5p，當(dāng)過表達(dá)兩者時(shí)可見顆粒細(xì)胞增殖增加凋亡減少[22-23]。這些結(jié)果提示miRNA可作為改善PCOS患者顆粒細(xì)胞功能的新型分子靶標(biāo)。

3 miRNA對(duì)顆粒細(xì)胞類固醇激素合成的調(diào)控

MGC產(chǎn)生多種類固醇激素和生長因子，通過影響顆粒細(xì)胞增殖與凋亡以及卵泡液的形成影響卵泡生長發(fā)育[2]，最重要的類固醇激素有雌激素和孕激素，他們通過負(fù)反饋下丘腦垂體性腺軸調(diào)控卵巢功能，雌、孕激素也是主要的抗凋亡因子。我們通過研究miRNA對(duì)類固醇激素的調(diào)控不但可以間接解釋顆粒細(xì)胞凋亡，還對(duì)調(diào)控卵泡生長發(fā)育提供理論支持。

芳香化酶(CYP19A1)是體內(nèi)雌激素合成的限速酶，直接影響體內(nèi)雌激素的水平。研究發(fā)現(xiàn)miR-378直接靶向豬卵丘細(xì)胞CYP19A1抑制雌激素合成，從而影響卵母細(xì)胞成熟[29]；miR-1275則是通過靶向肝受體同源蛋白1影響CYP19A1表達(dá)從而抑制豬顆粒細(xì)胞雌激素合成[30]；Zhang等[31]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-205抑制小鼠顆粒細(xì)胞雌激素釋放并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制與miR-205靶向環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)原件結(jié)合蛋白1(cyclic adenosine monophosphate responsive element binding protein 1,CREB1)調(diào)控caspase和CYP19A1軸有關(guān)，CREB1上調(diào)可部分挽救miR-205所致的細(xì)胞凋亡和雌激素抑制；相反miR-132靶向CYP19A1負(fù)向調(diào)節(jié)劑神經(jīng)元相關(guān)受體1促進(jìn)小鼠顆粒細(xì)胞雌激素的合成[32]。miR-320通過轉(zhuǎn)錄因子E2F1和SF1兩個(gè)靶基因抑制小鼠顆粒細(xì)胞雌激素產(chǎn)生，同時(shí)部分促進(jìn)孕酮和睪丸激素產(chǎn)生[15]。Mohammed等[33]在人顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-96通過抑制叉頭轉(zhuǎn)錄因子1促進(jìn)顆粒細(xì)胞孕激素產(chǎn)生。由上可知，miRNA在顆粒細(xì)胞雌、孕激素合成過程中起重要的調(diào)控作用，而雌孕激素對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育和胚胎成功著床極為重要，在輔助生殖技術(shù)中，我們可考慮通過檢測顆粒細(xì)胞中與激素合成相關(guān)的特異miRNA初步評(píng)估卵泡質(zhì)量和子宮內(nèi)膜情況。

4 結(jié)語與展望

以上，我們總結(jié)miRNA在顆粒細(xì)胞凋亡、增殖和類固醇激素合成中的作用，miRNA與靶基因的特異性結(jié)合，引起靶基因和/或下游通路因子miRNA和蛋白質(zhì)水平變化，進(jìn)而調(diào)控顆粒細(xì)胞功能。目前研究的卵巢顆粒細(xì)胞多數(shù)取材于動(dòng)物，無法準(zhǔn)確反映miRNA對(duì)人顆粒細(xì)胞功能的調(diào)控，但對(duì)解釋兩者間機(jī)制提供一定方向，以后仍需要更多以人顆粒細(xì)胞為模型的研究為臨床試驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。在今后的研究我們應(yīng)多分析探索miRNA的多元化特征，深究其在顆粒細(xì)胞中的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，另外物種差異性和組織特異性問題也不容忽視。人類對(duì)新事物的認(rèn)識(shí)是一個(gè)從宏觀到微觀，再從微觀到宏觀的過程，研究miRNA對(duì)顆粒細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制為以后宏觀調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞功能奠定了分子基礎(chǔ)。異常顆粒細(xì)胞miRNA的研究為相關(guān)疾病提供新的診療思路，miRNA合成劑與抑制劑以及相應(yīng)靶基因類似藥物也將有望成為治療不孕癥相關(guān)疾病的新方法。此外，在人類輔助生殖技術(shù)中，是否可將miRNA作為微創(chuàng)診斷生物標(biāo)記物預(yù)測卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量，更需要我們進(jìn)一步的探索。