何圣賢，萬(wàn) 瑤，覃雪梅，張 慧，劉 芳

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004）

【研究意義】水稻細(xì)菌性條斑?。╞acterial leaf streak，BLS），簡(jiǎn)稱細(xì)條病，是由水稻細(xì)條 病 病 菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzicola，Xooc）感染引起，該病菌為革蘭氏陰性、黃單胞菌屬細(xì)菌[1]。是我國(guó)南方稻區(qū)主要的檢疫性病害之一[2-3]，是繼水稻稻瘟病、水稻紋枯病和水稻白葉枯病之后的第四大病害[4]，1957年在我國(guó)廣東省發(fā)現(xiàn)該病害[5]。病菌的侵染能引起植物一系列生理代謝過(guò)程的變化，進(jìn)而導(dǎo)致各種癥狀[6]，而植物激素的變化可能與病害癥狀形成有關(guān)[7]。因此，研究水稻感染細(xì)條病菌后激素的變化可為揭示水稻與病原菌互作機(jī)制提供依據(jù)，同時(shí)為水稻抗性育種提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大量研究表明，在植物與病原物互作過(guò)程中水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ETH）發(fā)揮了關(guān)鍵作用[8-10]。一般認(rèn)為SA主要調(diào)控植物對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的抗性，而JA和ETH主要調(diào)控植物對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的抗性[11]。植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的激素，如赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素（CTK）、脫落酸（ABA）、生長(zhǎng)素（IAA）等也直接或間接地參與了植物抗病或感病反應(yīng)[12]。激素合成代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是如何調(diào)控水稻抗病性的，也引起重視。研究表明SA的信號(hào)途徑在介導(dǎo)水稻防衛(wèi)反應(yīng)中起重要作用[13]，其中兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)控基因OsNPR1和OsWRKY45在水稻SA途徑中具有不同而又互補(bǔ)的作用[14]。許多研究表明JA參與水稻免疫反應(yīng)[15-16]。Riemann等[17]通過(guò)對(duì)JA合成途徑關(guān)鍵基因OsAOC缺失突變體的研究發(fā)現(xiàn)，OsAOC突變后對(duì)稻瘟菌的抗性降低，JA介導(dǎo)了對(duì)稻瘟菌的防衛(wèi)反應(yīng)。Uji等[18]發(fā)現(xiàn)水稻OsMYC2作為早期JA信號(hào)的正調(diào)控因子，能夠與JA反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄抑制子JAZ互作，OsMYC2在水稻過(guò)表達(dá)后，通過(guò)上調(diào)防御相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)了對(duì)白葉枯病菌的抗性。Grewal等[19]利用微陣列研究白葉枯病菌觸發(fā)的水稻轉(zhuǎn)錄調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn)，大量乙烯信號(hào)相關(guān)基因參與水稻免疫調(diào)節(jié)。Qin等[20]在研究赤霉素20-氧化酶基因OsGA20ox3過(guò)表達(dá)和RNAi轉(zhuǎn)基因植株時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)GA含量，可以改變水稻對(duì)白葉枯病菌和稻瘟病菌的抗性。Jiang等[21]測(cè)定了稻瘟病菌侵染后苗期水稻葉片內(nèi)植物激素的含量，發(fā)現(xiàn)CTK在葉片內(nèi)積累，并證實(shí)CTK信號(hào)與SA信號(hào)協(xié)同參與水稻對(duì)稻瘟病菌的數(shù)量抗性調(diào)控。【本研究切入點(diǎn)】雖然在水稻與病原菌互作過(guò)程中植物激素功能的研究已取得一定進(jìn)展，但是多集中于稻瘟病菌和白葉枯病菌的研究。對(duì)于各類植物激素在水稻抵抗細(xì)條病菌中所扮演的角色，還缺乏認(rèn)識(shí)，關(guān)于Xooc侵染后植株內(nèi)源激素的變化仍少見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)測(cè)定Xooc侵染水稻細(xì)條病抗、感近等基因系后SA、JA、ETH、GA、玉米素（ZT）在不同時(shí)間點(diǎn)的葉片內(nèi)含量，并與接種無(wú)菌水的對(duì)照進(jìn)行比較，明確Xooc侵染對(duì)水稻植株內(nèi)源激素的影響，為研究和防治水稻細(xì)條病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 水稻材料 以感病秈稻品種9311為輪回親本，抗病野生稻材料DY19為供體親本，通過(guò)雜交、回交和自交培育BC4 F3代，獲得水稻細(xì)條病抗病近等基因系LR19和感病近等基因系LS19。2019年9月在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院科學(xué)研究試驗(yàn)基地種植LR19和LS19各100株。

1.1.2 供試菌株 水稻細(xì)條病菌（Xooc）采用廣西水稻細(xì)條病優(yōu)勢(shì)生理小種 GX01，由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室何勇強(qiáng)教授提供。

1.2 試驗(yàn)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 SA含量變化

從圖1可以看出，接菌0 h，抗病近等基因系LR19較感病近等基因系LS19的SA含量高，前者 SA 含量（10.05 μg/mL）是后者（7.11 μg/mL）的1.48倍。接菌0～96 h，LR19處理組與對(duì)照組SA含量整體都呈下降趨勢(shì)，且在各時(shí)間點(diǎn)，接菌處理和對(duì)照間差異不顯著；接菌0～24 h，LS19處理組與對(duì)照組SA含量緩慢上升，并在接菌24 h同時(shí)達(dá)到峰值，分別為7.61、8.16 μg/mL，接菌24～96 h又皆呈下降趨勢(shì)，但對(duì)照組下降速率更快，而處理組則稍慢。從總體上看，接種0～96 h期間SA含量，LR19和LS19處理組分別為8.32、6.57 μg/mL，對(duì)照組分別為8.31、6.27 μg/mL?？剐圆牧蟂A含量始終高于感性材料，但兩個(gè)材料處理組與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。表明SA含量的變化并不是由Xooc的侵染引起的。

圖1 抗、感近等基因系接種細(xì)條病菌后不同時(shí)間葉片SA含量的變化Fig.1 Changes of SA content in leaves of resistant and susceptible near-isogenic lines at different times after Xooc inoculation

2.2 JA含量變化

由圖2可知，接菌0 h，LR19和LS19葉片JA含量差異不大，前者為1 579.33 pmol/L，后者為1 418.5 pmol/L；接菌24～96 h，LR19和LS19葉片JA含量都升高，而前者JA含量要低于后者。接菌0～24 h，LR19處理組葉片JA含量迅速升高，并達(dá)到峰值（2 891.0 pmol/L），較對(duì)照（939.33 pmol/L）增加207.77%，差異顯著；接菌24～96 h，JA含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而減少，接菌96 h，處理組（2 022.67 pmol/L）較對(duì)照組（679.33 pmol/L）增加197.74%，差異顯著；接菌0～48 h，LS19處理組葉片JA含量一直保持較高的上升速率，并在接菌48 h達(dá)到峰值（4 180.17 pmol/L），較對(duì)照（991.83 pmol/L）增加321.46%，差異顯著；接菌96 h，處理組葉片JA含量有所下降（3 506.83 pmol/L），較對(duì)照（725.17 pmol/L）仍保持較高水平，增加比率達(dá)到383.59%（P＜0.05）。從總體上看，接菌0～96 h期間JA含量，LR19處理組和對(duì)照組分別為2 316.0、1 174.33 pmol/L；LS19處理組和對(duì)照組分別為3 043.08、971.83 pmol/L?？?、感材料處理組與對(duì)照組相比差異顯著，細(xì)條病菌侵染后，誘導(dǎo)抗、感病近等基因系葉片JA含量上升，JA參與了水稻與細(xì)條病菌的互作。

圖2 抗、感近等基因系接種細(xì)條病菌后不同時(shí)間葉片JA含量的變化Fig.2 Changes of JA content in leaves of resistant and susceptible near-isogenic lines at different times after Xooc inoculation

2.3 ETH含量變化

圖3 抗、感近等基因系接種細(xì)條病菌后不同時(shí)間葉片ETH含量的變化Fig.3 Changes of ETH content in leaves of resistant and susceptible near-isogenic lines at different times after Xooc inoculation

由圖3可知，接菌0 h，LR19和LS19葉片ETH含量分別為224.04、166.02 nmol/L，前者是后者的1.35倍，二者之間差異顯著；接菌24 h，LR19處理組（192.31 nmol/L）較對(duì)照組（278.57 nmol/L）ETH含量減少，減少比率為30.97%，差異顯著；接菌24～96 h，處理組ETH含量呈波動(dòng)趨勢(shì)，而對(duì)照組ETH含量則趨于穩(wěn)定；接菌0～24 h，LS19處理組葉片ETH含量降低，并在接菌24 h后趨于穩(wěn)定，且始終低于對(duì)照，但是與對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異。從總體上看，接菌0～96 h，LR19和LS19葉片 ETH含量，處理組分別為220.06、128.32 nmol/L，對(duì)照組分別為280.56、144.7 nmol/L，抗病近等基因系高于感病近等基因系，但兩個(gè)材料ETH含量處理組與對(duì)照組間差異未達(dá)顯著水平。表明ETH含量的變化并不是由Xooc的侵染引起的。

2.4 GA含量變化

由圖4可知，接菌0 h，LR19葉片GA含量（76.78 pmol/L）略低于 LS19（81.98 pmol/L），但差異不顯著。接菌24 h，LR19處理組葉片GA含量（74.92 pmol/L）較對(duì)照組（62.39 pmol/L）增加比率為20.08%；接菌24～48 h，GA含量迅速下降并于接菌96 h達(dá)到最低值（42.34 pmol/L），較對(duì)照組（88.62 pmol/L）減少52.22%，差異顯著；接菌24 h，LS19處理組葉片 GA含量升高至峰值（89.51 pmol/L），較對(duì)照組（72.25 pmol/L）增加23.89%，接菌24 h后，GA含量開(kāi)始下降，接菌96 h下降至最低值（74.43 pmol/L），但與對(duì)照組（42.64 pmol/L）差異仍顯著。從總體上看，接菌0～96 h期間GA含量，LR19處理組和對(duì)照組分別為63.81、75.19 pmol/L，LS19處理組和對(duì)照組分別為83.20、66.27 pmol/L，抗、感材料處理組與對(duì)照組相比差異顯著，細(xì)條病菌侵染后，抗、感近等基因系葉片GA含量變化不同，前者下調(diào)，后者上調(diào)，表明GA參與了水稻與細(xì)條病菌的互作。

圖4 抗、感近等基因系接種細(xì)條病菌后不同時(shí)間葉片GA含量的變化Fig.4 Changes of GA content in leaves of resistant and susceptible near-isogenic lines at different times after Xooc inoculation

2.5 ZT含量變化

由圖5可知，接菌0 h，LR19和LS19葉片ZT含量分別為6.35、4.84 pmol/L，前者是后者的1.33倍。LR19處理組葉片ZT含量在接菌48 h降到谷值（4.62 pmol/L），較對(duì)照（5.64 pmol/L）減少比率為18.09%，接菌48～96 h，ZT含量表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，但始終低于對(duì)照；LS19處理組葉片ZT含量在接菌24 h降到最低（3.76 pmol/L），較對(duì)照（5.24 pmol/L）減少比率為28.24%，差異顯著，接菌48 ～96 h，ZT含量上升，但與對(duì)照相比差異不顯著。從總體上看，接菌0～96 h，LR19和LS19 葉片ZT含量，處理組分別為5.56、4.37 pmol/L，對(duì)照組分別為6.40、4.96 pmol/L，抗病近等基因系高于感病近等基因系，但兩個(gè)材料ZT含量處理組與對(duì)照組間差異不顯著。表明ZT含量的變化并不是由Xooc的侵染引起的。

圖5 抗、感近等基因系接種細(xì)條病菌后不同時(shí)間葉片ZT含量的變化Fig.5 Changes of ZT content in leaves of resistant and susceptible near-isogenic lines at different times after Xooc inoculation

3 討論

植物激素作為一種天然存在的小的有機(jī)分子，不僅對(duì)植物的發(fā)育過(guò)程有重要作用，而且在植物的防御和免疫反應(yīng)中起著重要的信號(hào)分子作用[22-23]。許多最初被認(rèn)為只與生長(zhǎng)過(guò)程有關(guān)的激素，現(xiàn)在已被認(rèn)為與對(duì)病原體的免疫反應(yīng)有關(guān)[24]。不是由一種激素控制植物免疫的，植物激素通過(guò)復(fù)雜的拮抗和協(xié)同作用相互依賴。植物激素信號(hào)通路之間的復(fù)雜交流網(wǎng)絡(luò)被稱為激素交聯(lián)。植物激素積累動(dòng)態(tài)影響著由某一特定植物激素介導(dǎo)的信號(hào)輸出，以及由此產(chǎn)生的激素交聯(lián)。因此，測(cè)量植物激素濃度，對(duì)于理解激素交聯(lián)至關(guān)重要[10]。目前參與防御水稻細(xì)條病菌的激素及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)尚不清楚，本研究測(cè)量水稻細(xì)條病抗、感近等基因系受Xooc侵染后，5種激素濃度在不同時(shí)間點(diǎn)的變化，將有助于對(duì)這一問(wèn)題的認(rèn)識(shí)。

水楊酸（SA）在植物防衛(wèi)反應(yīng)的信號(hào)途徑和獲得性抗性（systemic acquired resistance,SAR）方面起著重要作用[13]。水稻植株內(nèi)源基礎(chǔ) SA含量相對(duì)較高，其占植株鮮重的比例大致為5 000～30 000 ng/g，甚至比受侵染的煙草、擬南芥等植物組織還要高，高含量的SA可充當(dāng)內(nèi)源抗氧化劑，為水稻提供保護(hù)，不受由病原菌侵染、非生物脅迫和老化引起的損傷[25-28]。然而，SA參與水稻防御更依賴于SA信號(hào)傳導(dǎo)而不是其內(nèi)源水平或從頭合成的變化[15]。本研究中，接菌Xooc后，抗病近等基因系體內(nèi)SA含量遠(yuǎn)高于感病近等基因系，此后，二者中的JA含量均呈下降趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。表明SA含量的變化并不是由Xooc的侵染而引起的。但是在接菌0～96 h，抗病近等基因系SA含量始終高于感病近等基因系，這種高的內(nèi)源基礎(chǔ)SA含量，是否是產(chǎn)生細(xì)條病抗性所需要的，還有待進(jìn)一步研究。

茉莉酸（JA）在植物遭受病原菌入侵時(shí)起著重要的保護(hù)作用，當(dāng)病原菌入侵后，植物通過(guò)JA信號(hào)傳遞，能夠?qū)Σ≡拿{迫作出防衛(wèi)反應(yīng)[29-30]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，在水稻中JA是個(gè)強(qiáng)大的信號(hào)，能夠抵抗各種不同生活方式的病原菌，包括半活體營(yíng)養(yǎng)型白葉枯病菌、活體營(yíng)養(yǎng)型稻瘟病菌和死體營(yíng)養(yǎng)型紋枯病菌[16]。本試驗(yàn)中，細(xì)條病菌侵染后，誘導(dǎo)抗病近等基因系和感病近等基因系葉片內(nèi)的JA含量上升，而接種無(wú)菌水的對(duì)照，抗病近等基因系和感病近等基因系葉片內(nèi)的含量均沒(méi)有上升，在各時(shí)間點(diǎn)，處理組與對(duì)照組間差異顯著。表明，Xooc能夠誘導(dǎo)JA含量的增加。Feng等[31]研究表明OsPGIP4正向調(diào)控水稻對(duì)細(xì)條病菌的防衛(wèi)反應(yīng)，而JA可能參與OsPGIP4介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)。Ke等[32]研究發(fā)現(xiàn)，水稻的植物抗毒素蛋白基因OsPAD4誘導(dǎo)的對(duì)白葉枯病菌和半活體營(yíng)養(yǎng)型細(xì)條病菌的抗性，并不依賴SA反應(yīng)，而是與JA的積累和JA響應(yīng)基因的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果同樣提示JA可能參與了水稻與細(xì)條病菌的互作。而在接菌24～96 h，抗病近等基因系的JA含量低于感病近等基因系，可能是因?yàn)榭共〗然蛳诞a(chǎn)生抗性需要JA參與反應(yīng)或信號(hào)介導(dǎo)而消耗所致。

ETH與JA信號(hào)具有協(xié)同作用[10]。其作為水稻防御信號(hào)的雙向調(diào)節(jié)因子，增強(qiáng)了對(duì)稻瘟病等病原菌的抗性，而導(dǎo)致對(duì)白葉枯病菌的敏感性，正負(fù)調(diào)控作用取決于病原體的感染生物學(xué)[33]。本試驗(yàn)中，抗、感近等基因系接種細(xì)條病菌后，葉片ETH含量與對(duì)照組差異不顯著。表明ETH含量的變化并不是由Xooc的侵染引起的。接菌0～96 h，抗病近等基因系ETH含量始終高于感病近等基因系，這有可能與細(xì)條病抗性差異相關(guān)。

赤霉素（GA）是一個(gè)四環(huán)二萜類激素的大家族，有助于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和免疫反應(yīng)[34]。Yang等[35]研究表明，GA負(fù)調(diào)控水稻的基礎(chǔ)抗病性。外施GA和GA合成抑制劑可分別提高白葉枯病的敏感性和抗性。相似地，生物合成基因OsGA20Ox3的轉(zhuǎn)錄增加也導(dǎo)致對(duì)白葉枯病菌和稻瘟病菌敏感性的增強(qiáng)[20]。本研究接菌后，抗病近等基因系葉片GA含量較對(duì)照下降；而感病近等基因系葉片GA含量較對(duì)照上升。受Xooc侵染后，抗、感系葉片GA含量變化不同。從而推測(cè)GA在水稻抗細(xì)條病的過(guò)程中可能發(fā)揮著負(fù)調(diào)控的作用。

玉米素（ZT）是一種植物體內(nèi)天然存在的細(xì)胞分裂素，不僅能促進(jìn)植物細(xì)胞分裂，而且可以阻止葉綠素和蛋白質(zhì)降解，減慢呼吸作用，延緩植株衰老。細(xì)胞分裂素對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的免疫具有正負(fù)調(diào)節(jié)雙向作用，取決于侵染部位細(xì)胞分裂素濃度的高低。高水平的細(xì)胞分裂素導(dǎo)致病原菌生長(zhǎng)減少和防御反應(yīng)的激活，而低濃度的細(xì)胞分裂素促進(jìn)病原菌生長(zhǎng)[36]。細(xì)胞分裂素對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的重要性要超過(guò)細(xì)菌和真菌/卵菌病原體[9]。本試驗(yàn)中，抗、感近等基因系葉片ZT含量雖在接菌處理后表現(xiàn)為下降，但是從整體上看，與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異。表明ZT含量的變化，并不是由Xooc侵染引起的。而抗病近等基因系ZT含量始終高于感病近等基因系，這可能有助于抵抗細(xì)條病。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，接菌后，LR19處理組SA、ETH、ZT含量分別為8.32 μg/mL、220.06 nmol/L和5.56 pmol/L，對(duì)照組則分別為8.31 μg/mL、250.86 nmol/L和6.40 pmol/L。LS19處 理組 SA、ETH、ZT含 量 分 別 為 6.57 μg/mL、128.35 nmol/L和4.37 pmol/L，對(duì)照組則分別為 6.27 μg/mL、134.7 nmol/L 和 4.96 pmol/L。對(duì)于這3種激素，抗、感材料在處理組和對(duì)照組間差異均不顯著，表明它們的變化不是由Xooc引起的，但是抗性材料SA、ETH、ZT含量始終高于感性材料，可能有助于抵抗病原菌的侵染。接菌后，LR19處理組JA、GA含量分別為2 316.0、63.81 pmol/L，對(duì)照組則分別為1 174.33、75.19 pmol/L，LS19處理組JA、GA含量分別為3 043.08、83.20 pmol/L，對(duì)照組則分別為971.83、66.27 pmol/L。對(duì)于這2種激素，抗、感材料在處理組和對(duì)照組間差異顯著，且抗性材料的含量低于感性材料。表明它們的變化是由Xooc引起的，JA和GA參與了水稻對(duì)細(xì)條病的抗性反應(yīng)。