張 娟，李水仙，王春芳，趙 巖，祝清芬

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101）

藏悠游膠囊是以葛根凍干粉、桔梗提取物、茯苓提取物、川芎提取物為主要原料制成的保健食品?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》云：葛根“主消渴，身大熱，嘔吐，諸痹，起陰氣，解諸毒”[1]。《中國藥典》一部：桔梗止咳祛痰，用于痰濁阻肺所致的咳嗽痰多[2]。《世補(bǔ)齋醫(yī)書》中記載：“茯苓一味，為治痰主藥。痰之本，水也，茯苓可以行水；痰之動(dòng)，濕也，茯苓又可以行濕”?！侗静輩R言》曰：“川芎，上行頭目，下調(diào)經(jīng)水，中開郁結(jié)，血中氣藥。味辛性陽，氣善走竄而無陰凝黏滯之態(tài)。雖入血分，又能去一切風(fēng)，調(diào)一切氣”[1]。本研究按照《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》GB15193.1-2014的要求及其藥理活性，對(duì)藏悠游膠囊進(jìn)行安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)及提高缺氧耐受力功能研究，為其作為保健食品的食用安全性及功效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BP 211D電子天平（德國Sartorius公司）；高壓蒸汽滅菌器（日本SANYO公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，Stuart溫控?fù)u床培養(yǎng)箱（英國Stuart公司）；BSC-1360ⅡA2生物安全柜（北京中聯(lián)哈爾）；AL204電子天平（Mettler）；全自動(dòng)生化分析儀（日立）；ADVIA?2120i血液分析儀（西門子）；ASP200s全自動(dòng)全封閉脫水機(jī)，EG1150 H & C 包埋機(jī)，RM2245半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，HI1210攤片機(jī)，HI1220烤片機(jī)，XL全自動(dòng)染色機(jī)，CV5030 全自動(dòng)封片機(jī)（Leica）；BX51生物顯微鏡（Olympus）。

1.2 受試物

藏悠游膠囊，規(guī)格：360 mg/粒，36粒/瓶，內(nèi)容物為棕黃色，由某保健品有限公司生產(chǎn)。食用量為每日3次，每次3粒（360 mg/粒）；保存條件：置陰涼干燥處，避免陽光直照。

1.3 試劑

哺乳動(dòng)物微粒體酶（S9），批號(hào)：3516，誘導(dǎo)劑及動(dòng)物品種：多氯聯(lián)苯（Aroclor 1254）誘導(dǎo)雄性SD大鼠（上海寶錄）；敵克松（Dexon，批號(hào)：10112926，上海晶純）；注射用絲裂霉素（MMC，批號(hào)：131101，浙江海正藥業(yè)）；2-氨基芴（批號(hào)：13152，上海晶純）；1, 8-二羥基蒽醌（批號(hào)：WXBB7902V，美國Sigma-Aldrich公司）；環(huán)磷酰胺（批號(hào)：SLBG4216V，美國Sigma-Aldrich公司）；鈉石灰[批號(hào)：20031220，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司]；亞硝酸鈉（批號(hào)：C1305006，阿拉丁公司）。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物及菌株

SPF級(jí)ICR小鼠，SPF級(jí)SD大鼠，均購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2014 0007。飼養(yǎng)條件：SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室使用許可證號(hào)：SYXK（魯）2018 0013。溫度：20～25 ℃，日溫差≤3 ℃，濕度：40 %～70 %，換氣次數(shù)：≥10次/h。照明時(shí)間：12 h 明暗交替。SPF大小鼠生長繁殖飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司），飼料生產(chǎn)許可證號(hào)：京飼證（2014）06054；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（飼料）生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0010。鼠傷寒沙門菌TA97a，TA98，TA100，TA102（上海寶錄）。

2 方法

2.1 急性毒性試驗(yàn)

小鼠檢疫合格后，取試驗(yàn)用小鼠20只，雌雄各半，體重，雄性20.0～22.0 g，雌性18.8～21.4 g。采用最大耐受劑量（MTD）法進(jìn)行試驗(yàn)。禁食不禁水16 h后，稱取樣品粉末25.0 g，充分研磨，加0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液至25 ml，制成1.0 g/ml的混懸液，經(jīng)口灌胃給予濃度為1.0 g/ml的受試物20 ml/kg BW。連續(xù)觀察14 d，記錄動(dòng)物的中毒表現(xiàn)及死亡情況，試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行剖檢并記錄大體解剖結(jié)果。根據(jù)急性毒性劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)受試物的急性毒性強(qiáng)弱。

2.2 Ames試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用平板摻入法。受試物分為5000，1000，200，40，8 μg/皿5個(gè)劑量組。稱取1.25 g藏悠游膠囊內(nèi)容物，加滅菌注射用水至25 ml，混勻，制成5 %的混懸液（高劑量），0.103 MPa條件下滅菌20 min。將冷凍保存的試驗(yàn)菌株TA97a，TA98，TA100，TA102分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基10 ml，37 ℃振蕩（100次/min）培養(yǎng)10 h。將含0.5 mmol/L組氨酸-0.5 mmol/L生物素的頂層培養(yǎng)基2.0 ml分裝于試管中，50 ℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗(yàn)菌株增菌液0.1 ml，受試物溶液0.1 ml和S9混合液0.5 ml（需代謝活化時(shí)），充分混勻，迅速傾倒于底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使之分布均勻。水平放置，待冷凝固化后，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱里孵育48 h，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。在加與不加S9混合液的條件下，受試物每個(gè)劑量均做3個(gè)平行板，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（自發(fā)回變組）、溶媒對(duì)照組（滅菌注射用水）和陽性對(duì)照組。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

取試驗(yàn)用小鼠50只，雄性小鼠25.1～28.1 g，雌性小鼠25.0～28.7 g，隨機(jī)區(qū)組法分為5組，每組10只，雌雄各半。試驗(yàn)設(shè)置受試物低、中、高劑量（2.5，5，10 g/kg BW）組、溶媒（0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液）對(duì)照組和陽性（環(huán)磷酰胺40 mg/kg BW）對(duì)照組，各組小鼠均經(jīng)口灌胃給予，采用30 h兩次給予法，即兩次給予間隔24 h，第二次給予后6 h取材。首次給予時(shí)稱量動(dòng)物體重并記錄。頸椎脫臼法處死小鼠，取胸骨，用止血鉗擠出骨髓液與載玻片一端的胎牛血清混勻，常規(guī)涂片。空氣干燥后，用甲醇固定10 min，將固定好的涂片放入Giemsa應(yīng)用液中，染色10 min，用水輕輕沖洗，晾干。光學(xué)顯微鏡下，觀察200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE），同時(shí)計(jì)數(shù)正染紅細(xì)胞（NCE），計(jì)算PCE/NCE比值，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞。觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，微核率以千分率表示。

2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

取試驗(yàn)用小鼠25只，雄性，體重25.3～28.0 g，隨機(jī)區(qū)組法分為5組，每組5只。試驗(yàn)設(shè)置受試物低、中、高劑量（2.5，5，10 g/kg BW）組、溶媒（0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液）對(duì)照組和陽性（環(huán)磷酰胺40 mg/kg BW）對(duì)照組。首次給予受試物后的第35天，頸椎脫臼法處死小鼠，取出兩側(cè)附睪，放入盛有約1 ml生理鹽水的小燒杯中，用眼科剪縱向剪1～2刀，靜止5 min，輕輕搖動(dòng)。用4層擦鏡紙過濾，濾液涂片。空氣干燥后，用甲醇固定5 min，晾干后用1 %伊紅染色1 h，用水輕輕沖洗，干燥。在低倍鏡下找到背景清晰、精子重疊較少的部位，用高倍鏡檢查精子的形態(tài)。精子畸形按無鉤、香蕉形、胖頭、無定形、雙頭、雙尾、尾折疊進(jìn)行記錄。每只動(dòng)物檢查1000個(gè)精子。記錄畸變的類型和數(shù)量，計(jì)算精子畸形率。

2.5 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

動(dòng)物檢疫合格后，取SD大鼠80只，雄性體重68.8～84.3 g、雌性體重65.1～79.6 g，雌雄分別隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄各半。設(shè)低、中、高3個(gè)劑量組，劑量分別為1.35，2.7，5.4 g/kg BW（分別相當(dāng)于人可能攝入量的25倍、50倍、100倍），大鼠摻入飼料量按10 g/100g BW計(jì)，摻入比例分別為1.35 %，2.7 %，5.4 %。采用逐級(jí)放大法將受試物摻入飼料中，見表1。對(duì)照組動(dòng)物給予普通飼料。單籠飼養(yǎng)，自由飲食，連續(xù)喂養(yǎng)30 d。每周稱一次體重和兩次攝食量，計(jì)算每周及總的食物利用率。第31天在禁食16 h后，稱取禁食動(dòng)物體重（空腹體重）后，戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，進(jìn)行血常規(guī)和血液生化測定，解剖動(dòng)物并取材進(jìn)行病理檢查。

表1 受試物摻入飼料法飼料制備表

2.6 提高缺氧耐受力功能試驗(yàn)

2.6.1 分組及受試物給予方式 取小鼠120只，雄性，體重18～22 g，按體重隨機(jī)分為3組，分別進(jìn)行常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)、急性腦缺血性缺氧實(shí)驗(yàn)。每組40只，各分為溶媒對(duì)照組和受試物低、中、高劑量組，每組10只。低、中、高劑量分別為270，540，1620 mg/kg BW，相當(dāng)于人體推薦量的5倍、10倍、30倍，用0.5 %的羧甲基纖維素鈉溶液配制受試物。灌胃體積20 ml/kg BW，低、中、高劑量組的受試物濃度分別為13.5，81 mg/ml。同時(shí)設(shè)溶媒對(duì)照組，灌胃給予同等體積的0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液。每天灌胃1次，連續(xù)給予30 d后，開始測定各項(xiàng)缺氧指標(biāo)。

2.6.2 常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn) 末次灌胃后1 h，將各組小鼠分別放入盛有5 g鈉石灰的250 ml磨口瓶內(nèi)，每瓶1只，用凡士林封瓶口，蓋嚴(yán)，使之不漏氣，立即計(jì)時(shí)，以呼吸停止為指標(biāo)，觀察小鼠因缺氧而死亡的時(shí)間。

2.6.3 亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn) 末次灌胃后1 h，各組小鼠腹腔注射240 mg/kg BW的亞硝酸鈉，注射劑量0.1 ml/10 g BW，立即計(jì)時(shí)，記錄動(dòng)物存活時(shí)間。

2.6.4 急性腦缺血性缺氧實(shí)驗(yàn) 末次灌胃后1 h，各組小鼠自頸部逐只斷頭，立即按秒表記錄小鼠斷頭后至張口喘氣停止時(shí)間。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理[4]

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以±s表示，微核率和精子畸形率使用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，其他各指標(biāo)均使用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

小鼠一日內(nèi)經(jīng)口灌胃給予受試物20.0 g/kg BW，結(jié)果顯示，小鼠飲食活動(dòng)正常，生長良好，未見明顯中毒表現(xiàn)及死亡情況，大體剖解未見明顯的異常表現(xiàn)，該受試物對(duì)兩種性別小鼠的MTD均大于20.0 g/kg BW。根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，該受試物屬無毒級(jí)保健食品，結(jié)果見表2。

表2 藏悠游膠囊小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

3.2 Ames試驗(yàn)結(jié)果

兩次試驗(yàn)中受試物各劑量組在加和不加S9條件下各菌株回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，各劑量組間亦無劑量反應(yīng)關(guān)系，表明在加與不加S9條件下，受試物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102 4株菌株均未出現(xiàn)遺傳毒性。結(jié)果見表3、表4。

3.3 骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果

受試物各劑量組PCE/NCE比值不少于溶媒對(duì)照組的20 %，表明受試物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞未見明顯毒性。受試物各劑量組微核率與溶媒對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組與溶媒對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明受試物無致小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核作用，小鼠骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性，結(jié)果見表5。

表3 Ames試驗(yàn)結(jié)果（第1次試驗(yàn)）

表4 Ames試驗(yàn)結(jié)果（第2次試驗(yàn)）

表5 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

3.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

受試物各劑量組小鼠精子畸形率與溶媒對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組與溶媒對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，受試物對(duì)小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性，結(jié)果見表6。

3.5 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

3.5.1 對(duì)大鼠體重、攝食量及食物利用率的影響

3.5.1.1 對(duì)大鼠體重的影響 雌性動(dòng)物高劑量組第3周和第4周體重、體重增重、總增重低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），結(jié)果見表7，表8。

表8 藏悠游膠囊對(duì)大鼠每周增重及總增重的影響（n=10）

3.5.1.2 對(duì)大鼠攝食量的影響 受試物各劑量組大鼠給藥期間各周攝食量與對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，受試物對(duì)大鼠各周攝食量無影響。結(jié)果見表9。

3.5.1.3 對(duì)大鼠食物利用率的影響 雄性動(dòng)物高劑量組第4周食物利用率和總食物利用率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。雌性動(dòng)物中劑量組第3周食物利用率和總食物利用率，高劑量組第3周和第4周食物利用率、總食物利用率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），結(jié)果見表10。

受試物對(duì)動(dòng)物體重和食物利用率的影響可能與受試物主要成分的功效有關(guān)，本品主要成分為葛根提取物、桔梗提取物、茯苓提取物、川芎提取物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道葛根具有降血脂的作用[5]，桔梗具有降血脂和抗肥胖的作用[6-7]，茯苓具有利尿作用[8-9]。

3.5.2 對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響 與對(duì)照組比較，雄性動(dòng)物低劑量組中性粒細(xì)胞百分比升高，淋巴細(xì)胞百分比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但上述檢測指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi)，不認(rèn)為存在生物學(xué)意義。其他各劑量組動(dòng)物各血液生化學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表11。

3.5.3 對(duì)大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響 雄性動(dòng)物中劑量組總蛋白、血清白蛋白高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；雌性動(dòng)物低劑量組谷草轉(zhuǎn)氨酶高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但均在正常值范圍內(nèi)，不認(rèn)為存在生物學(xué)意義。其他各劑量組各血清生化指標(biāo)與對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表12。

3.5.4 病理學(xué)大體解剖觀察檢查 各劑量組大鼠肝臟、腎臟、脾臟、胃腸、睪丸和卵巢大體解剖檢查均未見異常，各臟器組織病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)與受試物相關(guān)的組織病理學(xué)改變。雌雄動(dòng)物各劑量組臟器濕重及臟器系數(shù)與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表13、表14。

表9 藏悠游膠囊對(duì)大鼠每周攝食量的影響（n=10）

表10 藏悠游膠囊對(duì)大鼠每周及總的食物利用率的影響（n=10）

表11 藏悠游膠囊對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響（n=10）

表12 藏悠游膠囊對(duì)大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響（n=10）

3.6 提高缺氧耐受力功能試驗(yàn)結(jié)果

3.6.1 臧悠游膠囊對(duì)小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間的影響 結(jié)果見表15。由表15可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的藏悠游膠囊30 d，各劑量組與溶媒對(duì)照組比較，存活時(shí)間明顯延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

3.6.2 高反靈牌藏悠游膠囊對(duì)小鼠亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間的影響 結(jié)果見表16。由表16可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的高反靈牌藏悠游膠囊30 d，各劑量組與溶媒對(duì)照組比較，中劑量組存活時(shí)間延長，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），即藏悠游膠囊小鼠亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

3.6.3 藏悠游膠囊對(duì)小鼠急性腦缺血性缺氧喘氣時(shí)間的影響 結(jié)果見表17。由表17可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的藏悠游膠囊30 d，各劑量組與溶媒對(duì)照組比較，喘氣時(shí)間均延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

4 結(jié)論

本研究采用小鼠急性毒性試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)、30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)5個(gè)方面對(duì)藏悠游膠囊進(jìn)行安全毒理學(xué)評(píng)價(jià)，采用常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)、急性腦缺血性缺氧實(shí)驗(yàn)研究其提高缺氧耐受力的功能。安全毒理學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，兩種性別小鼠MTD均大于20.0 g/kg BW，該受試物屬無毒級(jí)，Ames試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)3項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，30 d喂養(yǎng)未見明顯毒性作用。常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)中，各劑量組均能延長小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間；亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)中，中劑量組能延長小鼠存活時(shí)間；急性腦缺血性缺氧實(shí)驗(yàn)中，各劑量組均能延長小鼠的喘氣時(shí)間，3項(xiàng)試驗(yàn)均為陽性。根據(jù)《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》GB15193.1-2014[3]，藏悠游膠囊未見明顯毒性作用且具有提高缺氧耐受力功能的作用。

表13 藏悠游膠囊對(duì)大鼠臟器濕重的影響（n=10）

表14 藏悠游膠囊對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響（n=10）

表15 高反靈牌藏悠游膠囊對(duì)小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間的影響

表16 藏悠游膠囊對(duì)小鼠亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間的影響

表17 藏悠游膠囊對(duì)小鼠急性腦缺血性缺氧喘氣時(shí)間的影響