陳麗娜，王亞俊，丁會芹，吳明遠，王建剛，劉大慶，張 輝

（1.康立泰藥業(yè)有限公司，山東 青島 266112；2.山東省藥學科學院，山東 濟南 250101）

白介素12（IL-12）是具有多重免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子，研究表明其能通過調(diào)節(jié)固有免疫、獲得性免疫及腫瘤血管生成過程發(fā)揮抗腫瘤作用[1-2]。固有免疫方面，IL-12的P40亞基可作為巨噬細胞的趨化因子，趨化巨噬細胞向腫瘤部位移動，增強免疫應答，發(fā)揮抗腫瘤作用。獲得性免疫方面，IL-12作為在Th1細胞分化和Th1型細胞因子介導的腫瘤免疫和炎癥免疫中發(fā)揮作用的最重要細胞因子[3]，能誘導NK細胞和T細胞產(chǎn)生γ干擾素（IFN-γ），IFN-γ能上調(diào)MCH-I/II類分子、細胞間黏附分子1（ICAM-1）等黏附分子及T-bet等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子的表達，并能反饋性上調(diào)產(chǎn)生內(nèi)源性IL-12，進而發(fā)揮抗腫瘤作用。國內(nèi)外已有較多研究均明確闡述了IL-12在抗腫瘤方面的有效性[4-8]。因此，本文就IL-12單藥抗腫瘤，以及聯(lián)合放化療、免疫治療等治療方式聯(lián)合抗腫瘤的動物藥效學研究做一綜述。

1 IL-12單獨用藥對荷瘤動物模型的藥效學研究

1.1 IL-12對黑色素瘤轉(zhuǎn)移的肺癌、肝癌、網(wǎng)狀細胞肉瘤及腎細胞癌的抑制作用

Gately等[9]研究了IL-12在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤及抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性，證實了IL-12對黑色素瘤轉(zhuǎn)移的肺癌、肝癌、網(wǎng)狀細胞肉瘤及腎細胞癌的抑制作用。首先評價IL-12對B16F10黑色素瘤在肺部轉(zhuǎn)移的抑制作用。靜脈注射腫瘤細胞后，C57BL/6小鼠從種瘤后第1天開始，一周5次腹腔注射不同劑量的IL-12，共3周。結(jié)果表明，腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)量呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，1 μg劑量組（41個）與溶劑對照組（200個）差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.005）；另一組已轉(zhuǎn)移腫瘤試驗中，1 μg劑量組與對照組相比，腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)量差異仍有統(tǒng)計學意義（P＜0.0005）。結(jié)果表明，IL-12有潛在的抗腫瘤活性，且這種活性在有明確的腫瘤轉(zhuǎn)移后仍可體現(xiàn)。其次，IL-12對皮下已生長B16F10腫瘤的抑制性也有劑量相關(guān)性，未出現(xiàn)顯著相關(guān)毒性。繼續(xù)給藥至第50天，小鼠腫瘤生長被一定程度地抑制，極大地延長了小鼠的存活時間。

IL-12對M5076網(wǎng)織細胞肉瘤的生長及肝轉(zhuǎn)移的抑制作用評價試驗結(jié)果表明，溶劑對照組的中位生存期為21 d，并在第26天小鼠全部死亡；IL-12給藥組的中位生存期為38 d。另外皮下注射M5076腫瘤細胞后，腫瘤的發(fā)展慢于皮下注射B16F10細胞，因此，給予IL-12治療在種植腫瘤細胞4周后開始。IL-12仍顯著減緩了腫瘤生長，自發(fā)的肝轉(zhuǎn)移也被有效抑制。上述結(jié)果表明，IL-12可抑制M5076網(wǎng)織細胞肉瘤在皮下的生長以及肝轉(zhuǎn)移。

腹腔注射IL-12對小鼠腎細胞腺癌腫瘤未完全消失，但有顯著的抑制效果。將IL-12注射于癌周則腫瘤抑制效果非常顯著，60 d后檢測結(jié)果表明，IL-12給藥組有70 %的小鼠未檢測到腫瘤。上述結(jié)果表明，IL-12有抗腎細胞腺癌的活性，且在一定情況下，可導致已形成腫瘤消失。

1.2 IL-12對結(jié)腸腺癌、肉瘤的抑制作用

Nastala等[10]研究發(fā)現(xiàn)重組白介素12（rIL-12）可誘導IFN-γ的產(chǎn)生從而導致腫瘤凋亡。C57BL/6小鼠腹腔種植MCA-105及MC-38腫瘤細胞后，給予IL-12可使腫瘤細胞消亡，并且延長小鼠生存期。IL-12單獨使用或與IL-2聯(lián)合應用抗MC-38腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)果表明，建立肺部腫瘤轉(zhuǎn)移模型后10 d給予IL-12（1.0 μg/d），微小轉(zhuǎn)移腫瘤明顯被抑制。相比于IL-2對照組，雖然IL-2給藥組也產(chǎn)生了顯著的腫瘤抑制作用，但毒性反應較大；低劑量的IL-2及IL-12聯(lián)用在本試驗條件下未顯現(xiàn)出更好的抗腫瘤效果。以上結(jié)果均證實了IL-12對結(jié)腸腺癌、肉瘤較好的抑制作用。

1.3 IL-12對纖維肉瘤、卵巢癌的抑制作用

IL-12對3種腫瘤模型的抑制作用研究[11]，包括病毒誘發(fā)的CSA1M纖維肉瘤，輻射導致的OV-HM卵巢癌及化學致癌的MCH-1-A1纖維肉瘤。CSA1M和OV-HM腫瘤在經(jīng)過系統(tǒng)的IL-12治療后完全消失，這種治療方式甚至對生長50 d的大CSA1M腫瘤消亡也是有效的。OV-HM卵巢癌有較強的轉(zhuǎn)移性，在小鼠種植腫瘤細胞一個月后即可自發(fā)向淋巴結(jié)和肺部轉(zhuǎn)移形成微小腫瘤，但經(jīng)IL-12治療后，小鼠的原生OV-HM腫瘤完全消失，且未觀察到有腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生。結(jié)果表明，IL-12對于OV-HM模型在消除原生腫瘤的同時還可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。但對于MCH-1-A1纖維肉瘤雖有腫瘤被抑制的情況，但沒有引發(fā)腫瘤消亡。結(jié)果表明，對于不同的腫瘤模型，IL-12的抗腫瘤效應可能是不同的。IL-12抗腫瘤機制及影響IL-12功效的因素仍需進一步深入探索。

1.4 IL-12對淋巴瘤的作用

Verbik等[12]評價了IL-12對淋巴瘤的作用效果，BALB/c小鼠種植1×103 RAW117-H10淋巴瘤細胞24 h后，腹腔注射給予IL-12。腫瘤種植后第16天，對照組的小鼠全部死于肝臟和肺部巨大的腫瘤負荷；而腫瘤種植60 d后處死給藥組小鼠，病理照片顯示，0.350 μg給藥組小鼠沒有在肺部或肝部出現(xiàn)腫瘤小結(jié)節(jié)。結(jié)果表明，IL-12能有效提高淋巴瘤小鼠的總生存率，并有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

1.5 IL-12對乳腺癌的作用

Boggio等[13]評價了在腫瘤早期、晚期及長期給藥IL-12對小鼠乳腺癌發(fā)展的影響，將過度表達HER-2/neu致癌基因的轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠（BALB-neu T小鼠）及攜帶HER-2/neu原癌基因的FVB小鼠（FVB-neu N小鼠）隨機分組，每周檢查乳腺及腫塊情況＞3 mm即確認為腫瘤。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-12可推遲BALB-neu T小鼠乳腺癌的發(fā)生。評價了FVB-neu N小鼠接受IL-12治療乳腺癌發(fā)展的情況，在確認腫瘤形成后第6周、第22周和第28周腹腔注射IL-12。6周給藥組、22周給藥組與對照組相比，在腫瘤增殖及無瘤率方面，均存在顯著性差異，但第28周給藥組與對照組相比無顯著差異。以上結(jié)果提示，對腫瘤的抑制作用似乎主要依賴于IL-12干預早期腫瘤血管生成的能力。

1.6 IL-12對膀胱癌的作用

O’Donnell等[14]研究了IL-12在小鼠膀胱癌模型中的作用，MB49細胞和MBT2細胞腫瘤模型給藥試驗結(jié)果均表明，IL-12對膀胱癌的抑制作用為劑量相關(guān)的；在一個MB49腫瘤模型給藥試驗中，于第3，5，7，9和11天給予IL-12 250 ng，小鼠腫瘤完全消失，且在到試驗結(jié)束的180 d內(nèi)，無腫瘤生長跡象。

研究者進一步探索，將上述試驗中存活的C57BL/6J小鼠再次接種MB49腫瘤細胞，于第7天后給予IL-12，給藥劑量為500/1000 ng，一周5次，共2周。當發(fā)現(xiàn)腫瘤生長直徑大于2 cm時，將小鼠處死。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥組與對照組相比，小鼠存活率有顯著差異；于第105天后給經(jīng)IL-12治療的存活小鼠再次接種MB49腫瘤，并不再給予IL-12，最初1000 ng給藥組存活的小鼠在此次試驗中有了更高的存活率，表明給予IL-12可產(chǎn)生免疫保護。

2 IL-12與放化療或其他腫瘤治療方法聯(lián)合應用的藥效學研究

早期的非臨床研究顯示IL-12單藥在抗腫瘤非臨床研究中具有很好的治療效果，但是臨床藥效卻并不明顯，并且引發(fā)了嚴重的不良反應。因此，研究嘗試將IL-12與其他癌癥治療方法聯(lián)用，如抗體、腫瘤疫苗、其他細胞因子、化療及放療等。

2.1 IL-12與放化療聯(lián)合治療腫瘤

在多種動物腫瘤模型中，IL-12和環(huán)磷酰胺聯(lián)用產(chǎn)生了比IL-12或環(huán)磷酰胺單獨使用均更優(yōu)的抗腫瘤效應。

一項小鼠肉瘤和結(jié)腸癌腫瘤模型研究證實[15]，在多次的化療周期中，免疫刺激缺乏而非內(nèi)在腫瘤細胞的耐藥性，是抗腫瘤反應喪失的原因。該研究還發(fā)現(xiàn)，無論腫瘤是否有免疫原性，在化療周期中加入IL-12可保持甚至促進抗腫瘤反應，并顯著延長小鼠生存期。有些腫瘤負荷較大的小鼠，在第一次環(huán)磷酰胺和IL-12聯(lián)合治療復發(fā)后，給予第二次治療（治療方案、劑量與第一次相同）可完全清除腫瘤。分析表明，在第一個治療周期后，兩種藥物聯(lián)用提高了宿主的抗腫瘤免疫活性。Le等[16]研究再次證明，通過IL-12治療而激活的抗腫瘤免疫反應，特別是環(huán)磷酰胺和IL-12組合，可對抗臨床上顯著的大腫瘤負擔。預先存在的腫瘤致敏T細胞[15,17]對IL-12和環(huán)磷酰胺加IL-12根除已建立的腫瘤至關(guān)重要。

有研究對小鼠腫瘤放化療后給予IL-12，取得了較好的結(jié)果[18]。試驗采用C57BL/6J小鼠，種植EL4淋巴瘤或Lewis肺癌細胞，建立腫瘤模型，造模后的小鼠進行放化療治療，并給予IL-12。放/化療后每3～4 d進行外周血細胞計數(shù)，并測量腫瘤大小。

（1）低劑量IL-12顯著改善了亞致死劑量照射荷瘤小鼠全血細胞減少癥，同時伴隨腫瘤體積減小。在EL4淋巴瘤和Lewis肺癌模型中，相對于對照組，所有細胞因子治療組在研究終點均表現(xiàn)為腫瘤體積整體減小；對于淋巴瘤模型，IL-12治療（預給藥、后給藥或預-后給藥）明顯抑制了腫瘤的生長（%T/C＜50 %），但粒細胞集落刺激因子（G-CSF）效果不顯著，所有治療組對第二次輻射劑量表現(xiàn)出一定的敏感性。在Lewis肺癌模型中，相對于對照組，G-CSF和IL-12治療組的腫瘤體積均減小。雖然Lewis肺癌模型中，相對于對照組，所有的細胞因子治療組抑制了腫瘤生長，但只有IL-12預-后給藥組和G-CSF組對第二劑量輻射表現(xiàn)出敏感性。在Lewis肺癌模型中，與對照組相比，只有IL-12后給藥組腫瘤體積減少顯著（%T/C＜50 %）。

（2）與單純化療相比，低劑量IL-12促進化療后的荷瘤小鼠造血恢復并伴隨腫瘤生長體積的抑制。在兩種腫瘤模型的化療研究觀察期結(jié)束時，與單獨治療（安慰劑組）相比，IL-12聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療使腫瘤體積顯著減少（%T/C＜50 %），尤其是EL4模型，無論是IL-12預-后給藥和IL-12后給藥在16天觀察期結(jié)束時腫瘤體積均顯著減少（%T/C＜50 %）。而對于肺癌模型，在12 d觀察期內(nèi)，IL-12預-后給藥組（分次劑量為50 ng/100 ng）和預給藥組（50 ng）腫瘤體積都顯著減少（%T/C＜50 %）。無論哪種腫瘤模型，G-CSF治療未實現(xiàn)顯著腫瘤減少，只在肺癌模型中可看到總體不顯著的腫瘤體積減少。IL-12在Lewis肺癌模型中的抗腫瘤效應另一個重要部分是IL-12聯(lián)合環(huán)磷酰胺在單純基本治療的基礎(chǔ)上產(chǎn)生了顯著的抗腫瘤反應，盡管事實上細胞株無免疫原性（以往報道IL-12對Lewis肺癌腫瘤模型的效應顯示IL-12對這種無免疫原性的腫瘤沒有抗腫瘤效果[19]）。因此，該研究IL-12預-后給藥組在無免疫原性腫瘤的結(jié)果，即%T/C約34 %，表明IL-12與環(huán)磷酰胺聯(lián)合改變了這種無免疫原性肺癌腫瘤模型的免疫原性。

進一步對淋巴瘤模型進行第二輪化療及細胞因子治療，以評估腫瘤直徑＜20 mm荷瘤小鼠腫瘤的發(fā)展。環(huán)磷酰胺及佐劑細胞因子給藥方式與上述相同。在第二輪化療時，小鼠體內(nèi)的可見腫瘤并未消失。因此與該小鼠模型系統(tǒng)的第一輪化療相比，在第二輪環(huán)磷酰胺治療時，表現(xiàn)出對細胞毒性藥物明顯的耐受性。人類癌癥治療中也觀察到對環(huán)磷酰胺的耐受性。小鼠淋巴瘤研究中，第二輪化療結(jié)束后，即第一輪環(huán)磷酰胺治療后5周和腫瘤接種后7周，試驗終止時IL-12預-后給藥組和后給藥組分別有37.5 %和50 %的小鼠無腫瘤，而安慰劑組未發(fā)現(xiàn)無腫瘤的小鼠。因此，在這種侵襲性淋巴瘤模型中，IL-12給藥結(jié)合環(huán)磷酰胺是非常有效的治療方法，產(chǎn)生的抗腫瘤效應比單純環(huán)磷酰胺療法更有效。

在一項硼替佐米與IL-12聯(lián)合抗腫瘤的臨床前研究中[20]，硼替佐米單藥使用導致了腫瘤生長的顯著抑制，分別在治療15和21 d后腫瘤體積減少約65 %和約60 %。在同一時間點，硼替佐米與IL-12聯(lián)合治療則分別使腫瘤生長減少約75%和約84 %。在2周時終止硼替佐米治療后，腫瘤恢復生長。聯(lián)合治療則完全阻止了腫瘤生長的這種反彈，且在整個過程中腫瘤體積持續(xù)減少。

2.2 IL-12與其它免疫療法聯(lián)合治療腫瘤

基于IL-12組合免疫療法的當前趨勢通?？煞譃閮煞N，一種旨在增強抗腫瘤應答，如將IL-12應用于癌癥疫苗過繼性T細胞療法[21]；另一種將IL-12作為免疫治療劑、生物治療藥等的補充，其抗腫瘤機制與IL-12單藥抗腫瘤機制不同[22-23]。

最近，IL-12與單克隆抗體聯(lián)合應用的動物研究獲得了有希望的結(jié)果，這些單抗包括抗CTLA-4和抗PD-L1等[24-25]。IL-12（確切地說，通過注射編碼IL-12的Semliki Forest病毒）聯(lián)合激動劑抗CD137單抗治療黑色素瘤和肺癌模型小鼠，也獲得了增強IL-12的抗腫瘤作用[26]。值得注意的是，目前臨床腫瘤學腫瘤免疫治療策略中對表面分子的阻斷和刺激單克隆抗體均進行了深入研究。有研究嘗試轉(zhuǎn)移編碼IL-12的mRNA，OncoSec Medical（NCT03132675）也已發(fā)表腫瘤內(nèi)基因電穿孔策略。初步臨床數(shù)據(jù)表明，IL-12質(zhì)粒聯(lián)合抗PD-1單克隆抗體（pembrolizumab）和對黑色素瘤患者有效的治療效果[27]。

3 結(jié)語

綜上所述，IL-12單獨用藥的非臨床抗腫瘤藥效研究多集中在早期階段，且抗腫瘤作用十分顯著。然而，進入臨床試驗階段后，IL-12單藥對各類腫瘤的治療效果并不理想，且給藥劑量較大，不良反應明顯。有關(guān)IL-12單獨用藥的療效，未來仍需大樣本量的臨床前及臨床研究進一步確證。研究逐步轉(zhuǎn)向?qū)L-12與其他治療方法聯(lián)合應用，以發(fā)揮其保護和恢復造血功能、促進機體免疫、調(diào)動腫瘤免疫的同時，能抑制腫瘤生長、提高聯(lián)合治療方式的應答率的雙重優(yōu)勢，最終在動物試驗中顯示出了較好的抗腫瘤效應。IL-12與放化療及其他腫瘤免疫療法聯(lián)合使用，明顯提高了藥物抗腫瘤活性。鑒于IL-12在先天性和獲得性免疫中的重要橋梁作用，IL-12有一定的抗腫瘤活性，尤其是作為免疫佐劑與放化療、免疫治療聯(lián)用時，可顯著抑制腫瘤生長，阻止腫瘤惡性轉(zhuǎn)移，有效延長生存期。因此，IL-12與放化療、免疫治療及細胞治療等的聯(lián)合應用是未來抗腫瘤的主要發(fā)展方向。隨著對IL-12的研究深入，IL-12將成為有重要臨床意義的抗腫瘤新藥。