吳雙雙，馮艷麗～4

(1.湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002；2.湖北師范大學(xué) 生物學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，湖北 黃石 435002；3.特色野菜良種繁育與綜合利用技術(shù)湖北省工程研究中心，湖北 黃石 435002；4.湖北師范大學(xué) 食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435002)

0 前言

紅曲菌(Monascusspp.)，又稱紅曲霉，是一類小型絲狀真菌，是中國(guó)重要的可食用微生物資源[1，2]。紅曲菌的發(fā)酵產(chǎn)物——紅曲最早在中國(guó)發(fā)現(xiàn)，其生產(chǎn)及應(yīng)用歷史長(zhǎng)達(dá)近2000年[3]。以大米等富含淀粉的原料為培養(yǎng)基，接種紅曲菌后可發(fā)酵制成紅曲，它既可食用也可作藥用[4，5]。紅曲菌可產(chǎn)生多種有益次生代謝產(chǎn)物，主要包括莫納可林K(monacoin K，MK)，紅曲色素(Monascuspigments，MPs)、麥角固醇及γ-氨基丁酸等。但是，部分紅曲菌株還可產(chǎn)生腎毒素——桔霉素[6，7]。目前，對(duì)紅曲菌代謝產(chǎn)物研究和應(yīng)用最為廣泛的是MPs和MK。

MPs不僅熱穩(wěn)定性及蛋白著色力強(qiáng)、對(duì)pH穩(wěn)定，它還因安全無(wú)毒被用作天然食品著色劑[6，7]。MK可有效減少或阻斷人體膽固醇的合成，從而調(diào)節(jié)人體血壓和血脂[8～10]。桔霉素是部分種屬的紅曲菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的真菌毒素，具有腎毒性，還可能致畸、誘發(fā)腫瘤、致突變等[11～13]。眾所周知，發(fā)酵基質(zhì)對(duì)微生物生長(zhǎng)及代謝具有重要意義。在紅曲發(fā)酵過(guò)程中，若采用價(jià)格低廉的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物作為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，從而獲取高附加值的MPs或MK，可在大幅降低生產(chǎn)成本的同時(shí)，強(qiáng)化農(nóng)副產(chǎn)物的綜合利用[14]。

米糠是稻谷加工過(guò)程中的重要副產(chǎn)物，它依附在糙米的表層，主要由外果皮、中果皮、交聯(lián)層、種皮和糊粉層組成[15]。雖然米糠的重量約為稻谷總重的6%，但稻米60%的營(yíng)養(yǎng)成分存在于米糠中，且含有90%以上人體必需的微量元素[16]。米糠中的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分主要包括脂肪、蛋白質(zhì)、糖類、維生素和礦物元素等。另外，米糠還含有角鯊烯、必需脂肪酸和神經(jīng)酰胺等近百種功能因子，具有預(yù)防心血管疾病、腫瘤及調(diào)節(jié)血糖等功能[17，18]。我國(guó)米糠年產(chǎn)量約1 200萬(wàn)噸，但其利用率極低，還不足20%.目前，米糠主要用于飼料加工，還有部分用于植酸、肌醇、米糠油等的開(kāi)發(fā)，利用率及利用范圍有待提高和擴(kuò)展[19]。

我國(guó)是世界上第一稻米生產(chǎn)大國(guó)，世界上34%的稻米產(chǎn)自我國(guó)[20]。在稻米的加工過(guò)程中，占稻米產(chǎn)量10%～15%的副產(chǎn)物為碎米，每年可產(chǎn)生約3 000萬(wàn)噸碎米。碎米的主要成分與大米十分相似，主要包括約75%的淀粉和約8%的蛋白質(zhì)及少量生理活性物質(zhì)和脂類物質(zhì)。此外，碎米中還含有大量礦物元素和維生素B族[21]，但碎米價(jià)格卻比大米便宜一半甚至更多[20]。然而，我國(guó)的碎米資源利用率較低。目前主要利用碎米制作新脂肪替代物、多孔淀粉、抗性淀粉等[20]，獲取碎米蛋白[22]，研制米面包、米飲料、米粉、人造米等[23]。

鑒于已有的文獻(xiàn)和現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)，以前期實(shí)驗(yàn)過(guò)程中誘變得到的可高產(chǎn)MK的紅曲菌ZWN2及可高產(chǎn)MPs的紅曲菌ZWS5為實(shí)驗(yàn)菌株，以米糠或碎米為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)上述兩株紅曲菌發(fā)酵米糠或碎米產(chǎn)MK或MPs的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。以期通過(guò)該研究，為后續(xù)進(jìn)一步拓寬米糠和碎米的綜合利用途徑提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 可高產(chǎn)MK的紅曲菌ZWN2及可高產(chǎn)MPs紅曲菌ZWS5，是以叢毛紅曲菌(Monascuspilosus)MS-1(CCTCC M 2013295，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，武漢)為出發(fā)菌株誘變獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基[24]：稱取200 g去皮馬鈴薯，切塊至大小約為邊長(zhǎng)為2 cm的正方體，添加1 000 mL的蒸餾水并煮沸20 min，經(jīng)8層紗布過(guò)濾，加入20 g瓊脂粉并加熱攪拌至完全溶解，后加入20 g葡萄糖并攪拌至溶解，冷卻后以蒸餾水定容至1 000 mL.

種子液培養(yǎng)基[24,25]：葡萄糖80 g，蛋白胨10 g，NH4H2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.1 g，土豆汁(PDA培養(yǎng)基不添加葡萄糖及瓊脂粉)1 000 mL.

固態(tài)培養(yǎng)基組分及發(fā)酵參數(shù)[26]：優(yōu)化培養(yǎng)基中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為米粉和豆粉，其比例為3∶2，原始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為純米粉。每個(gè)250 mL三角瓶中加入上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基50 g，培養(yǎng)基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量分別調(diào)整為35%(w/w)，0.6%(v/w)和0.004 mol/kg，混勻后滅菌并趁熱打散。

上述培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌20 min.

1.1.3 試劑 葡萄糖：重慶和平制藥有限公司；無(wú)水氯化鈣、冰乙酸、磷酸二氫銨、七水硫酸鎂、無(wú)水氯化鋰及無(wú)水乙醇均為分析純?cè)噭?，蛋白胨及瓊脂粉均為生物試劑，乙腈及磷酸均為色譜純?cè)噭?，上述試劑均?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MK標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)：購(gòu)于阿拉丁公司；大豆分離蛋白及大豆異黃酮(純度80%)，購(gòu)于河南千志商貿(mào)有限公司，純凈水、土豆：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：UV-5 100 B，上海元析儀器有限公司；高效液相色譜儀：Agilent 1 260，安捷倫科技有限公司；其它均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.3 方法

1.3.1 種子液的培養(yǎng)及固態(tài)發(fā)酵 取15 mL無(wú)菌水，加入在30 ℃培養(yǎng)10 d的紅曲菌茄形瓶中，用接種鏟將茄形瓶中的紅曲菌孢子洗入裝有玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中打散。將上述紅曲菌孢子懸液接入種子液培養(yǎng)基，控制接種量為10%(v/v).將種子液置于30 ℃、130 r/min培養(yǎng)36 h.在進(jìn)行紅曲固態(tài)發(fā)酵時(shí)，控制種子液的接種量為13%(v/w)，在30 ℃培養(yǎng)3 d后調(diào)整溫度至25 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)至14 d(該發(fā)酵條件主要用于紅曲菌產(chǎn)MK，若用于紅曲菌產(chǎn)MPs則將培養(yǎng)基置于30 ℃培養(yǎng)14 d).將發(fā)酵產(chǎn)物置于55 ℃烘干12 h后粉碎并過(guò)80目篩備用[26]。

1.3.2 紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物的色價(jià)檢測(cè) 采用分光光度法測(cè)定紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物的色價(jià)[24]。在50 mL離心管中加入0.3 g粉碎后的紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物和10 mL 75%乙醇，充分振蕩、勻混后超聲提取1 h.在室溫靜置15 min后取上清液，于8 000 r/min離心10 min，取上清液待用。將上述所得上清液用75%乙醇稀釋至適宜的濃度，以確保其OD505nm值在0.2～0.8之間，用75%的乙醇作為空白對(duì)照，調(diào)整分光光度計(jì)波長(zhǎng)至505 nm，測(cè)定吸光度值。紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物的色價(jià)計(jì)算公式為：

1.3.3 紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中MK的檢測(cè) 以優(yōu)化后的高效液相色譜(High performance liquid chromatography，HPLC)法分析紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中的MK含量及MK和MPs同系物的種類[26,27]。MK的提取同1.3.2中MPs的提取。取離心后的紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物提取液，用75%乙醇稀釋至適宜濃度，使樣品中MK的濃度與標(biāo)樣中MK的濃度盡量接近。采用微孔有機(jī)濾膜(0.22 μm)過(guò)濾樣液后備用。采用Agilent 1 260的HPLC系統(tǒng)，Inertsil ODS-3的色譜柱，乙腈∶水∶0.5%磷酸=60∶37∶3作為流動(dòng)相，控制流速、柱溫和檢測(cè)波長(zhǎng)分別為1.0 mL/min、25 ℃及238 nm，進(jìn)樣量設(shè)置為20 μL(若進(jìn)行MPs同系物的監(jiān)測(cè)，則主要觀察505 nm，460 nm和390 nm，分別代表紅色素、橙色素和黃色素)。紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中MK含量的計(jì)算公式如下：

1.3.4 發(fā)酵基質(zhì)對(duì)紅曲菌ZWN2產(chǎn)MK及MPs的影響 分別采用大米、米粉:豆粉(3∶2)、米糠和碎米粉為基礎(chǔ)發(fā)酵基質(zhì)，分別調(diào)整培養(yǎng)基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量為35%(w/w)，0.6%(v/w)和0.004 mol/kg.接種量控制在13%(v/w)，接種后的培養(yǎng)物在30 ℃培養(yǎng)3 d，再調(diào)整溫度至25 ℃并培養(yǎng)至14 d[26].采用1.3.2和1.3.3中所述的方法分析發(fā)酵產(chǎn)物中的MK及MPs.分別以MK及MPs的產(chǎn)量作為考察指標(biāo)，選取適合紅曲菌產(chǎn)MK或MPs的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.3.5 刺激物對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK及MPs的影響

1.3.5.1 刺激物對(duì)紅曲菌ZWN2在米糠中產(chǎn)MK及MPs的影響

課題組已有的研究結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)指出，大豆異黃酮、葡萄糖及大豆分離蛋白對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK及MPs均影響顯著。在1.3.4中篩選所得適合產(chǎn)MK的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加不同的刺激因子，主要包括：大豆分離蛋白(5%)、大豆異黃酮(3%)、葡萄糖(3%)，大豆分離蛋白+大豆異黃酮(5%+3%)、大豆分離蛋白+葡萄糖(5%+3%)、大豆異黃酮+葡萄糖(3%+3%)和大豆分離蛋白+大豆異黃酮+葡萄糖(5%+3%+3%)(w/w)，調(diào)整培養(yǎng)基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量同1.3.4，紅曲菌的接種及固態(tài)發(fā)酵參數(shù)同1.3.1.紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中MK及MPs的分析方法同1.3.2和1.3.3該實(shí)驗(yàn)的目的是篩選促進(jìn)紅曲菌ZWN2產(chǎn)MK的刺激物。

1.3.5.2 刺激物對(duì)紅曲菌ZWS5在碎米中產(chǎn)MPs的影響

在1.3.4篩選所得的MPs基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加刺激因子，主要包括：大豆分離蛋白(5%)、大豆異黃酮(3%)、葡萄糖(3%)，大豆分離蛋白+大豆異黃酮(5%+3%)、大豆分離蛋白+葡萄糖(5%+3%)、大豆異黃酮+葡萄糖(3%+3%)和大豆分離蛋白+大豆異黃酮+葡萄糖(5%+3%+3%)(w/w)，調(diào)整培養(yǎng)基中水分、冰乙酸、MgSO4·7H2O含量及接種量同1.3.4，在30 ℃培養(yǎng)至14 d，發(fā)酵產(chǎn)物處理方法同1.3.1.紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中MPs的分析方法同1.3.2和1.3.3.該實(shí)驗(yàn)的目的是篩選促進(jìn)紅曲菌ZWS5產(chǎn)MPs的刺激物。

1.3.6 刺激物添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK及MPs的影響

1.3.6.1 刺激物添加量對(duì)紅曲菌ZWN2產(chǎn)MK及MPs的影響

在1.3.4篩選出的適合紅曲菌產(chǎn)MK基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同量的由1.3.5.1篩選所得的刺激物，調(diào)整培養(yǎng)基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量同1.3.4，紅曲菌的接種及固態(tài)發(fā)酵參數(shù)同1.3.1.紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中MK及MPs的分析方法同1.3.2和1.3.3.該實(shí)驗(yàn)的目的是篩選促進(jìn)紅曲菌ZWN2產(chǎn)MK刺激物的適宜添加量。

1.3.6.2 刺激物添加量對(duì)紅曲菌ZWS5產(chǎn)MPs的影響

在1.3.4篩選出的適合紅曲菌產(chǎn)MPs基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同量的由1.3.5.2篩選所得的刺激物，調(diào)整培養(yǎng)基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量同1.3.4，紅曲菌的接種及固態(tài)發(fā)酵參數(shù)同1.3.5.2.紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中MPs的分析方法同1.3.2.該實(shí)驗(yàn)的目的是篩選促進(jìn)紅曲菌ZWS5產(chǎn)MPs刺激物的適宜添加量。

1.3.7 優(yōu)化后米糠及碎米培養(yǎng)基與優(yōu)化培養(yǎng)基產(chǎn)MK及MPs對(duì)比分析

1.3.7.1 紅曲菌ZWN2在優(yōu)化后米糠培養(yǎng)基與優(yōu)化培養(yǎng)基中產(chǎn)MK對(duì)比分析

將紅曲菌ZWN2分別接種于1.3.6.1篩選所得的培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵[26]，調(diào)整培養(yǎng)基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量同1.3.4，紅曲菌的接種及固態(tài)發(fā)酵參數(shù)同1.3.1.紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中MK及MPs的分析方法同1.3.2和1.3.3.該實(shí)驗(yàn)的目的是分析ZWN2在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)MK能力。

1.3.7.2 紅曲菌ZWS5在優(yōu)化后碎米培養(yǎng)基與純大米培養(yǎng)基中產(chǎn)MPs對(duì)比分析

將ZWS5分別接種于1.3.6.2實(shí)驗(yàn)篩選所得的培養(yǎng)基和純大米培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，調(diào)整培養(yǎng)基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量同1.3.4，紅曲菌的接種及固態(tài)發(fā)酵參數(shù)同1.3.5.2.紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中MPs的分析方法同1.3.2.該實(shí)驗(yàn)主要是分析紅曲菌ZWS5在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)MPs的能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵基質(zhì)對(duì)紅曲菌ZWN2產(chǎn)MK及MPs的影響

將紅曲菌ZWN2分別接種于以大米、米粉∶豆粉(3∶2)、米糠和碎米粉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中固態(tài)發(fā)酵，分析紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中的MPs及MK，結(jié)果如圖1所示。

圖1 培養(yǎng)基對(duì)紅曲菌ZWN2菌株產(chǎn)MPs和MK的影響

由圖1可知，對(duì)4種培養(yǎng)基產(chǎn)MPs和MK的情況進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明，4種培養(yǎng)基產(chǎn)MPs和MK的組間差異均呈極顯著差異(p值分別為0.000026和0.000015).證明基礎(chǔ)培養(yǎng)基的類型對(duì)紅曲菌產(chǎn)MPs和MK均呈極顯著影響(p<0.001).同等條件下，碎米更適于紅曲菌產(chǎn)MPs而米糠更適宜紅曲菌產(chǎn)MK.究其原因，可能是由于米糠中含有大量的生理活性物質(zhì)和微量元素，與前期優(yōu)化的米加豆的混合基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，更適宜紅曲菌的生長(zhǎng)和MK的產(chǎn)生[28]。在MPs的產(chǎn)生方面，碎米的組分雖與大米非常相似，但碎米中含有的豐富礦物元素和維生素B族更利于紅曲菌產(chǎn)MPs[21].在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，以米糠作為紅曲菌產(chǎn)MK的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以碎米作為紅曲菌產(chǎn)MPs的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.2 刺激物對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK及MPs的影響

2.2.1 刺激物對(duì)紅曲菌ZWN2在米糠中產(chǎn)MK及MPs的影響 將不同組合和比例的大豆分離蛋白、葡萄糖及大豆異黃酮添加至由2.1篩選所得的米糠培養(yǎng)基中，考察刺激物對(duì)紅曲菌ZWN2在米糠培養(yǎng)基中產(chǎn)MPs和MK的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，所添加的3種刺激物對(duì)紅曲菌ZWN2產(chǎn)MPs均有一定程度的抑制作用。在對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響方面，當(dāng)添加5%大豆分離蛋白或3%大豆異黃酮時(shí)，對(duì)紅曲菌ZWN2產(chǎn)MK具有一定的促進(jìn)作用，但效果不顯著，這與前期研究結(jié)果并非完全相符(數(shù)據(jù)未列出)。造成該現(xiàn)象的原因可能是該刺激物的添加量并不適于紅曲菌ZWN2產(chǎn)MPs或MK.后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，采用大豆異黃酮和大豆分離蛋白繼續(xù)探討它們促進(jìn)紅曲菌ZWN2產(chǎn)MK的最適添加量。

1：米糠空白對(duì)照；2∶5%大豆分離蛋白；3∶3%大豆異黃酮；4∶3%葡萄糖；5∶5%大豆分離蛋白+3%大豆異黃酮；6∶5%大豆分離蛋白+3%葡萄糖；7∶3%大豆異黃酮+3%葡萄糖；8∶5%大豆分離蛋白+3%大豆異黃酮+3%葡萄糖。

2.2.2 刺激物對(duì)紅曲菌ZWS5在碎米中產(chǎn)MPs的影響 根據(jù)2.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，碎米作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基適宜紅曲菌產(chǎn)MPs.在碎米培養(yǎng)基中添加不同刺激物，考察刺激物對(duì)紅曲菌ZWS5產(chǎn)MPs的影響，結(jié)果如圖3和表1所示。

圖3 刺激物對(duì)紅曲菌ZWS5在碎米中產(chǎn)MPs的影響

1：碎米空白對(duì)照；2∶5%大豆分離蛋白；3∶3%大豆異黃酮；4∶3%葡萄糖；5∶5%大豆分離蛋白+3%大豆異黃酮；6∶5%大豆分離蛋白+3%葡萄糖；7∶3%大豆異黃酮+3%葡萄糖；8∶5%大豆分離蛋白+3%大豆異黃酮+3%葡萄糖。

表1 刺激物對(duì)紅曲菌ZWS5在碎米中產(chǎn)MPs同系物的影響

由圖3可知，在碎米培養(yǎng)基中添加3%大豆異黃酮或者3%大豆異黃酮+3%葡萄糖均可顯著促進(jìn)對(duì)紅曲菌ZWS5產(chǎn)MPs(p3=0.024831，p7=0.034962，p<0.05)，但二者之間無(wú)顯著性差異(p=0.670057>0.05)，選擇3%大豆異黃酮作為促進(jìn)紅曲菌ZWS5產(chǎn)MPs的適宜刺激物。由表1可知，刺激物不僅可影響紅曲菌產(chǎn)MPs的產(chǎn)量，還可影響MPs的同系物種類。添加大豆分離蛋白的紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中紅色素的同系物種類的數(shù)量少于對(duì)照，橙色素同系物種類有所增加，黃色素同系物種類基本沒(méi)有變化。葡萄糖或大豆異黃酮對(duì)紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中紅、橙、黃色素同系物種類影響不明顯。上述現(xiàn)象可能是刺激物的添加影響了MPs的合成途徑造成的，這與已有文獻(xiàn)報(bào)道類似[29]。

2.3 刺激物的添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK及MPs的影響

2.3.1 刺激物添加量對(duì)紅曲菌ZWN2產(chǎn)MK及MPs的影響 結(jié)合2.2.1的結(jié)果，篩選獲得大豆分離蛋白和大豆異黃酮作為促進(jìn)紅曲菌ZWN2產(chǎn)MK的刺激物，在米糠培養(yǎng)基中分別添加不同量的大豆分離蛋白和大豆異黃酮，考察其對(duì)紅曲菌ZWN2產(chǎn)MK的影響，結(jié)果如圖4和圖5所示。

大豆分離蛋白添加量(%)

大豆分離蛋白添加量(%)

圖4 大豆分離蛋白添加量對(duì)紅曲菌ZWN2在米糠中產(chǎn)MPs及MK的影響

大豆異黃酮添加量(%)

大豆異黃酮添加量(%)

圖5 大豆異黃酮添加量對(duì)紅曲菌ZWN2在米糠中產(chǎn)MPs及MK的影響

由圖4可知，大豆分離蛋白對(duì)紅曲菌ZWN2產(chǎn)MPs具有顯著抑制作用(p<0.05)，該結(jié)果與課題組前期研究結(jié)果相符(數(shù)據(jù)未列出)。當(dāng)培養(yǎng)基中大豆分離蛋白添加量為3%時(shí)，紅曲菌ZWN2發(fā)酵米糠所得產(chǎn)物中MK的量最高，達(dá)12.14 mg/g.與對(duì)照組(6.39 mg/g)相比，MK的產(chǎn)量提高了89.98%.由圖5可知，當(dāng)大豆異黃酮的添加量較小(<4%)時(shí)，對(duì)紅曲菌ZWN2 產(chǎn)MPs呈抑制作用。當(dāng)大豆異黃酮的添加量達(dá)到4%或5%時(shí)，ZWN2發(fā)酵產(chǎn)物中MPs產(chǎn)量有所提高，且大豆異黃酮添加量為5%時(shí)，其發(fā)酵產(chǎn)物的色價(jià)顯著高于大豆異黃酮添加量為4%時(shí)的色價(jià)(0.010.05).綜合圖4和圖5，選擇添加3%大豆分離蛋白作為紅曲菌ZWN2發(fā)酵米糠產(chǎn)MK的適宜添加量。

2.3.2 刺激物添加量對(duì)紅曲菌ZWS5產(chǎn)MPs的影響 根據(jù)2.2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選獲得大豆異黃酮用作促進(jìn)紅曲菌ZWS5產(chǎn)MPs的刺激物。以碎米為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別調(diào)整其中大豆異黃酮的添加量呈濃度梯度，考察大豆異黃酮的添加量對(duì)紅曲菌ZWS5產(chǎn)MPs的影響，結(jié)果如圖6所示。

大豆異黃酮添加量(%)

由圖6可知，當(dāng)大豆異黃酮的添加量為1%和3%時(shí)，均可顯著促進(jìn)紅曲菌ZWS5在碎米中產(chǎn)MPs(p1=0.029462<0.05和p3=0.045869<0.05)，所得發(fā)酵產(chǎn)物的色價(jià)可達(dá)918.4 U/g和886.4 U/g.與對(duì)照組純碎米發(fā)酵產(chǎn)物的色價(jià)675.2 U/g相比，分別提高36.02%和31.28%.但大豆異黃酮的添加量為1%或3%時(shí)，兩者所得發(fā)酵產(chǎn)物的色價(jià)之間無(wú)顯著差異(p=0.656778>0.05).故選擇添加1%的大豆異黃酮作為紅曲菌ZWS5發(fā)酵碎米產(chǎn)MPs的適宜添加量。

2.4 優(yōu)化后米糠及碎米培養(yǎng)基與優(yōu)化培養(yǎng)基產(chǎn)MK及MPs對(duì)比分析

結(jié)合2.3.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出3%大豆分離蛋白作為紅曲菌ZWN2產(chǎn)MK的適宜添加量。在優(yōu)化培養(yǎng)基即米豆混合培養(yǎng)基、米糠培養(yǎng)基和優(yōu)化后的米糠培養(yǎng)基即添加3%的大豆分離蛋白中分別接入紅曲菌ZWN2，對(duì)比分析不同培養(yǎng)基對(duì)紅曲菌ZWN2產(chǎn)MK能力的影響，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，紅曲菌ZWN2分別在3種培養(yǎng)基即優(yōu)化培養(yǎng)基即米豆混合培養(yǎng)基、米糠培養(yǎng)基和優(yōu)化后的米糠培養(yǎng)基即米糠+3%大豆分離蛋白中均發(fā)酵14 d，紅曲菌ZWN2發(fā)酵優(yōu)化后的米糠培養(yǎng)基所得發(fā)酵產(chǎn)物中MK產(chǎn)量最高，為11.68 mg/g.該MK產(chǎn)量與優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物中MK產(chǎn)量5.86 mg/g相比提高99.32%.

結(jié)合2.3.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選后以1%大豆異黃酮作為紅曲菌ZWS5產(chǎn)MPs的適宜添加量。在純大米、碎米和優(yōu)化后的碎米等培養(yǎng)基中分別接種紅曲菌ZWS5，探究培養(yǎng)基對(duì)紅曲菌ZWS5產(chǎn)MPs能力的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8 培養(yǎng)基對(duì)紅曲菌ZWS5產(chǎn)MPs的影響

由圖8可知，紅曲菌ZWS5在3種培養(yǎng)基中發(fā)酵14 d，紅曲菌ZWS5發(fā)酵碎米優(yōu)化培養(yǎng)基所得發(fā)酵產(chǎn)物中MPs產(chǎn)量最高，達(dá)到981.33 U/g.與紅曲菌ZWS5發(fā)酵純大米培養(yǎng)基所得發(fā)酵產(chǎn)物的色價(jià)560 U/g相比，提高75.24%.

以HPLC法分析MK含量時(shí)，采用酸式和內(nèi)酯式MK標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照，計(jì)算紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中MK的含量。酸式及內(nèi)酯式MK和紅曲發(fā)酵產(chǎn)物提取液樣品的色譜圖如圖9所示。

由圖9可知，酸式MK和內(nèi)酯式MK的出峰時(shí)間分別在11 min和21 min左右，紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中的MK主要以酸式和內(nèi)酯式存在，且以酸式結(jié)構(gòu)為主。但根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T2847-2007，目前對(duì)紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中MK的定量，是以內(nèi)酯式MK作為計(jì)算依據(jù)。對(duì)MK的檢測(cè)過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)不同批次樣品中MK的含量對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尰蛘{(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，確保MK標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與樣品中MK的濃度盡量接近。

3 結(jié)論

將紅曲菌ZWN2和ZWS5用于米糠及碎米的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生MK或MPs，對(duì)其發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。1)紅曲菌ZWN2發(fā)酵米糠產(chǎn)MK的適宜條件為：在米糠基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加大豆分離蛋白，添加量為3%.調(diào)整培養(yǎng)基中水分、乙酸及MgSO4·7H2O含量分別為35%，0.6%(v/w)和0.004 mol/kg，控制種子液的接種量為13%(v/w).在30 ℃培養(yǎng)3 d，調(diào)整溫度至25 ℃并繼續(xù)培養(yǎng)至14 d.此時(shí)，紅曲菌ZWN2發(fā)酵產(chǎn)物中MK含量達(dá)11.68 mg/g.2)ZWS5發(fā)酵碎米產(chǎn)MPs的適宜條件為：在碎米基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加大豆異黃酮，添加量為1%.調(diào)整培養(yǎng)基中水分、乙酸、MgSO4·7H2O含量及接種量與米糠紅曲相同。在30 ℃培養(yǎng)14 d，紅曲菌ZWS5發(fā)酵產(chǎn)物的色價(jià)可達(dá)981.33 U/g.該研究結(jié)果可為后續(xù)進(jìn)一步拓寬米糠和碎米的綜合利用途徑提供借鑒。