張瑤 謝鳳杰 范明輝

[摘要] 目的 應用高效液相色譜法（HPLC）建立快捷穩(wěn)定準確的利奈唑胺血藥濃度測定方法，為血流感染患者個體化精準應用利奈唑胺提供參考。 方法 色譜柱Column-XB-C18（5 μm，4.8×250 mm），流動相乙腈-水（26-74）含0.4%乙酸，流速1.0 mL/min，色譜柱溫度 30℃，波長254 nm，內(nèi)標物質(zhì)為氯霉素。應用該方法測量10例血流感染患者的血藥濃度，為個體化精準應用利奈唑胺提供參考。 結(jié)果 血清利奈唑胺的濃度在（0.2～25.6）mg/L范圍內(nèi)有較的線性關(guān)系（r=0.9996），10例血流感染患者中利奈唑胺血藥濃度波動明顯，在（0.35～13.24） mg/L，其中有3例患者血藥濃度低于最低抑菌濃度MIC（MIC=2 mg/L）。 結(jié)論 該方法可快速、穩(wěn)定、準確的測定血流感染患者的利奈唑胺血藥濃度，應用該方法可為臨床血流感染患者提供個體化精準的給藥方案。

[關(guān)鍵詞] 利奈唑胺;高效液相色譜法;血藥濃度檢測;血流感染

[中圖分類號] R978.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）06-0120-03

[Abstract] Objective To establish a rapid，stable and accurate method for determination of plasma concentration of linezolid by high performance liquid chromatography（HPLC）， and to provide a reference for individualized and precise application of linezolid in patients with bloodstream infection. Methods Chromatographic column Column-XB-C18 （5 μm，4.8×250 mm），mobile phase acetonitrile-water（26-74） containing 0.4% acetic acid，with a flow rate of 1.0 mL/min， a column temperature of 30℃，and a wavelength of 254 nm. Chloramphenicol was used as internal standard substance. This method was used to determine the plasma concentration of 10 patients with bloodstream infection，to provide reference for the individualized and precise application of linezolid. Results A linear relationship of serum linezolid concentration was found in the range of（0.2-25.6） mg/L（r=0.9996）. It was found that the blood concentration of linezolid fluctuated significantly in 10 patients with bloodstream infection，ranging from 0.35 mg/L to 13.24 mg/L. Three out of ten patients had plasma concentration lower than the minimum inhibitory concentration MIC （MIC=2 mg/L）. Conclusion The method can determine the plasma concentration of linezolid in patients with bloodstream infection rapidly，stably and accurately. It can be applied on individualized and precise administration of linezolid for patients with bloodstream infection.

[Key words] Linezolid; High performance liquid chromatography; Blood concentration determination; Bloodstream infection

利奈唑胺是人工合成的惡唑烷酮類抗生素，2000年獲得FDA批準用于臨床。該藥與細菌50S亞基的23S核糖體RNA上的位點結(jié)合，阻斷形成功能性70S始動復合物，從而抑制細菌生長。與人體其他部位感染相比，如肺部感染、泌尿系感染、腹腔感染等，血流感染更為嚴重。利奈唑胺在中國人群中的藥物代謝模型特點表明，體重和年齡等因素均會影響利奈唑胺的體內(nèi)代謝過程[1]，并且血流感染的患者會出現(xiàn)病理生理學改變，血流動力學和藥物代謝動力學不穩(wěn)定[2-5]。但未見關(guān)于血流感染患者利奈唑胺血藥濃度檢測的報道，因此有必要建立測定血流感染患者利奈唑胺血藥濃度的方法。本文旨在建立穩(wěn)定、快捷、準確的HPLC測定血藥濃度方法，使血流感染患者個體化精準的應用利奈唑胺治療感染，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器、試劑及藥品

Waters 高效液相色譜儀、四元高壓數(shù)碼梯度泵、120位自動進樣器、Waters 2487雙波長紫外檢測器、EMPOWER 2 工作站。PRP美容高速離心機、上海力辰分析天平，-80℃和利冰箱。試劑：利奈唑胺對照品（百靈威公司，產(chǎn)品編號：343910，純度>98%）、乙腈 （色譜純，邁瑞爾產(chǎn)品編號F30001）、氯霉素對照品（Tmstandard-1，產(chǎn)品編號：70671，純度99.6%）、純凈水。藥品：利奈唑胺注射液（規(guī)格：300 mL：600 mg，廠家：輝瑞，國藥準字：H20190305）。

1.2 方法

1.2.1 HPLC色譜條件? 色譜柱Column-XB-C18（5 μm，4.8×250 mm），流動相比例乙腈-水（26-74）含0.4%乙酸，流速1.0 mL/min，色譜柱溫度30℃，波長254 nm，進樣量 20 μL，內(nèi)標物質(zhì)為氯霉素。

1.2.2 對照品、內(nèi)標物及樣品的處理? 利奈唑胺對照品及內(nèi)標物用流動相溶解，配置濃度均為0.2 mg/L備用。取300 μL血漿，加入2 mL的離心管中，再加入200 μL的甲醇沉淀蛋白，渦旋30 s，之后3000 r/min 離心10 min，取上清液20 μL進樣。

1.2.3 專屬性考察? 取2份血漿，將一定濃度的利奈唑胺和氯霉素標準品放入血漿中，按照“1.2.2”項樣品處理方法進樣測定。

1.2.4 線性關(guān)系考察? 用移液槍吸取空白血漿1 mL加入備用利奈唑胺溶液及氯霉素溶液，配制成系列利奈唑胺藥物濃度0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L、1.6 mg/L、3.2 mg/L、6.4 mg/L、12.8 mg/L、25.6 mg/L的溶液，按照“1.2.2”項樣品處理方法進樣。

1.2.5 精密度實驗、回收率實驗、穩(wěn)定性實驗? 取空白血漿按照“1.2.2”項樣品配制方法配制成濃度0.4 mg/L、0.8 mg/L、1.6 mg/L的樣品備用，分別于1 d內(nèi)測3次，及連續(xù)3 d每天測一次，考察其精密性。測定該3種濃度的峰面積，與標準方程計算量進行對比，計算回收率。將3種濃度的樣品分別在室溫條件下放置24 h，樣品處理后復溶24 h，-80℃冷凍10 d后復溶，測定其穩(wěn)定性。

1.2.6 血流感染患者血藥濃度檢測? 10例臨床診斷為血流感染患者（均為革蘭陽性細菌感染）在0.6 g Q12 h的條件下，48 h后再次給藥前10 min靜脈取血2 mL，每例患者測定6次血藥濃度，按照“1.2.2”項方法測定患者血漿利奈唑胺的血藥濃度，根據(jù)患者的血藥濃度實際情況，個體化精準調(diào)整患者的給藥方案。根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)，如體溫情況、血肌酐情況、患者主訴、患者精神狀態(tài)、血流動力學情況，其中有兩項及以上臨床癥狀未改善，視為無效，三項及以上臨床癥狀改善視為有效。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察

色譜圖基線平穩(wěn)，利奈唑胺與內(nèi)標物完全分離，未受內(nèi)標物的影響。利奈唑胺保留時間TR=5.3 min，氯霉素保留時間TR=7.6 min，見圖1、圖2。

2.2 標準曲線的繪制

根據(jù)最小二成法計算標準曲線，得回歸方程為Y=0.362C-0.0052（r=0.9996），其中Y為利奈唑胺面積與內(nèi)標物面積之比，C為利奈唑胺的濃度，利奈唑胺濃度C線性范圍應該控制在（0.2～25.6）mg/L。

2.3 精密度、回收率實驗、穩(wěn)定性實驗結(jié)果

精密度實驗結(jié)果RSD波動在2.4%～3.5%，回收率實驗結(jié)果均值波動在97.52%～103.31%，穩(wěn)定性試驗結(jié)果RSD波動在3.46%～6.32%。說明該方法符合測定利奈唑胺的血藥濃度要求。見表1～3。

2.4 血流感染患者血藥濃度檢測結(jié)果

10例應用利奈唑胺治療血流感染患者的血藥濃度波動范圍在（0.35～13.24） mg/L，其中有3例小于MIC（MIC=2 mg/L），且臨床無效。見表4。

3討論

本研究建立了快捷、穩(wěn)定、準確的HPLC測定利奈唑胺血藥濃度的方法，該方法利奈唑胺的保留時間更短[6]，節(jié)省了分析時間，分析方法更加快捷，本研究采用內(nèi)標法，內(nèi)標法建立的回歸方程因變量是內(nèi)標物和對照品的峰面積或峰高的比值，因此內(nèi)標法回歸方程的計算與進樣量無關(guān)，并且適合測定微量組分。當前耐甲氧西林金黃色葡萄菌MRSA已經(jīng)成為院內(nèi)感染首要的致病菌[7]。2017年全國耐藥監(jiān)測網(wǎng)顯示我國西藏MRSA檢出率為52%。更加嚴重的是日本及美國已經(jīng)有報道出現(xiàn)了萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌VISA[8]。而我國也已經(jīng)分離出萬古霉素中介的菌株hVISA[9]。臨床常用治療血流革蘭陽性菌藥物主要包括萬古霉素、利奈唑胺、達托霉素。目前利奈唑胺可能是革蘭陽性細菌的最后一道防線，相關(guān)研究表明利奈唑胺治療MRSA感染療效優(yōu)于萬古霉素[10-11]，且萬古霉素有一定的腎毒性[12]，利奈唑胺和達托霉素治療血流感染的療效和安全性相似[13]。本研究選擇利奈唑胺治療血流感染，其中有3例患者血藥濃度小于利奈唑胺的MIC，且臨床表現(xiàn)為無效。血藥濃度長時間低于MIC可能導致耐藥菌的產(chǎn)生[14]，因此當臨床在應用利奈唑胺血藥濃度低于MIC時應更加引起重視，值得注意的是，MIC可能會隨著抗生素的廣泛應用而改變[15]。

本研究的結(jié)果表4顯示，血流感染患者的血藥濃度波動在（0.35～13.24）mg/L，波動百分率為97.36%（計算公式為Cmax-Cmin/Cmax），血藥濃度波動較大。血流感染患者通常繼發(fā)于人體其他部位的感染，且血流動力學發(fā)生改變，血液中細菌的感染程度及細菌本身的毒性亦各不相同，可能是血藥濃度波動明顯的原因。血藥濃度波動較大可能增加藥物的不良反應的發(fā)生，但還需要觀察更多血流感染患者的利奈唑胺血藥濃度波動與不良反應之間的關(guān)系來進一步明確。

綜上所述，本研究建立了快捷、穩(wěn)定、準確的HPLC測定人血漿中利奈唑胺濃度方法，使血流感染的患者能夠更加安全有效的應用利奈唑胺，有一定的應用價值，值得臨床廣泛推廣。

[參考文獻]

[1] 張雷，白楠，劉又寧，等. 利奈唑胺在中國人的群體藥代動力學特點[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2016，39（12）：924-928.

[2] 董海燕，董亞琳，楊華，等. 利奈唑胺在不同疾病患者中藥動學變化的臨床意義[J]. 中國新藥與臨床雜志，2010， 29（3）：170-174.