馬利華，尤敦學(xué)，沈石星

(1.徐州工程學(xué)院 食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.江蘇久思鄉(xiāng)食品科技有限公司，江蘇 徐州 221018)

血紅蛋白是使血液呈紅色的一種蛋白，血紅蛋白在食品加工中應(yīng)用非常廣泛，可以提高肉制品的彈性、風(fēng)味以及組織狀態(tài)等[1,2]。

國(guó)外對(duì)血紅蛋白在肉制品中的應(yīng)用研究較早，1976年Fox就提出了添加由血紅蛋白合成的亞硝基血色原可使腌肉制品獲得較穩(wěn)定的粉紅色，因此可減少亞硝酸鹽的使用量[3]。Basu和Kumar將血紅蛋白與酸性紅色素相互作用制備改性血紅蛋白色素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者相互作用后會(huì)影響血紅蛋白吸收峰的褪色變化，并顯著淬滅血紅蛋白的固有熒光性[4]。國(guó)內(nèi)雖然對(duì)血紅蛋白的研究較晚，但已初見成效。馬美湖成功合成了亞硝基血紅蛋白并成功地應(yīng)用在香腸中，降低了亞硝酸鹽的含量[5]。

目前研究比較多的是亞硝基血紅蛋白著色劑，亞硝基血紅蛋白是由血紅蛋白與亞硝酸鈉或NO反應(yīng)制得，常作為紅色素用于肉制品加工中，替代亞硝酸鹽的發(fā)色作用，明顯降低了肉制品中亞硝酸鹽的殘留量，增加了安全性[6,7]。但色素的分散性和熱穩(wěn)定性均不理想，影響了實(shí)際使用效果。通過蛋白質(zhì)和多糖在控制條件下的美拉德反應(yīng)制備糖化血紅蛋白著色劑能明顯提高該新型著色劑的溶解性、光照和熱穩(wěn)定性等性能[8]。

本課題主要是將動(dòng)物血中的血紅蛋白糖基化改性，研究改性前后血紅蛋白穩(wěn)定性的變化，為制作更為穩(wěn)定、安全的色素提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豬血：采購(gòu)于菜市場(chǎng)。

1.2 試劑與設(shè)備

硫酸銨、氯化鈉、過氧化氫、硫代硫酸鈉、三氯化鐵、葡萄糖：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

WSC-S色差儀、7230G可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-80-2B臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血紅蛋白的提取以及糖基化

稱量20 g左右的豬血于燒杯中，加入40 mL蒸餾水，將豬血和水用高速組織搗碎機(jī)搗碎，然后加入等體積的飽和硫酸銨溶液，靜置3 h。用離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速4000 r/min，完成后去上清液即為血紅蛋白，干燥后稱其質(zhì)量[9]。

將血紅蛋白和葡萄糖質(zhì)量比在1∶3的條件下，加入適量蒸餾水，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0左右，在75 ℃水浴加熱2 h,冷卻后加入等體積的飽和硫酸銨溶液，靜置3 h，在轉(zhuǎn)速4000 r/min的條件下離心30 min，去上清液即為糖基化血紅蛋白[10]。

1.3.2 游離氨基酸和接枝度的測(cè)定

采用茚三酮比色法測(cè)定血紅蛋白反應(yīng)前后的游離氨基酸[11]。采用接枝度衡量血紅蛋白糖基化效果[12]。

式中:C0為未反應(yīng)時(shí)蛋白質(zhì)自由氨基總量;Ct為反應(yīng)后蛋白質(zhì)自由氨基的含量。

1.3.3 糖基化血紅蛋白穩(wěn)定性的測(cè)定

在200～600 nm每10 nm測(cè)定一次吸光值，選取最大吸光值，進(jìn)行糖基化血紅蛋白的穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算保留率[13]。

式中：A為處理后溶液的吸光度；A0為處理前溶液的吸光度。

1.3.3.1 光對(duì)穩(wěn)定性的影響

配制糖基化血紅蛋白溶液分別于日光燈、室內(nèi)自然光和黑暗條件下放置6 d，每天測(cè)一次吸光度，計(jì)算糖基化血紅蛋白溶液的色素保留率。

1.3.3.2 溫度對(duì)穩(wěn)定性的影響

將色素溶液分別置于室溫(25 ℃)，40，50，60 ℃的恒溫水浴中，每30 min測(cè)一次吸光度，共3 h，計(jì)算糖基化血紅蛋白溶液的色素保留率。

1.3.3.3 pH對(duì)穩(wěn)定性的影響

將糖基化血紅蛋白溶液分別調(diào)節(jié)pH為3，5，7，9，然后測(cè)定吸光度，計(jì)算糖基化血紅蛋白溶液的色素保留率。

1.3.3.4 氧化還原劑對(duì)穩(wěn)定性的影響

分別配制0.1%的過氧化氫以及硫代硫酸鈉的色素溶液，與室溫避光處放置1 h，每隔10 min測(cè)定一次吸光度，計(jì)算糖基化血紅蛋白溶液的色素保留率。

1.3.3.5 金屬離子對(duì)穩(wěn)定性的影響

分別配制含有Fe2+、Al3+、Cu2+的糖基化血紅蛋白溶液，每種離子的質(zhì)量濃度為100 mg/L，放在室內(nèi)避光處6 d，每天測(cè)一次吸光度，計(jì)算糖基化血紅蛋白溶液的色素保留率。

1.3.3.6 食品添加劑對(duì)穩(wěn)定性的影響

分別配制1%的NaCl和NaH2PO4的糖基化血紅蛋白溶液，于室內(nèi)避光處存放2 h，每隔0.5 h測(cè)一次吸光度，計(jì)算糖基化血紅蛋白溶液的色素保留率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 血紅蛋白糖基化

豬血質(zhì)量為19.98 g，提取的血紅蛋白質(zhì)量為15.32 g ，血紅蛋白接枝度DG=33.90%。

2.2 糖基化血紅蛋白穩(wěn)定性研究

2.2.1 光對(duì)糖基化血紅蛋白穩(wěn)定性的影響

圖1 光對(duì)糖基化血紅蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.1 The effect of light on the stability of glycosylated hemoglobin

由圖1可知，糖基化血紅蛋白色素在不同光照條件下放置了6 d，3種條件的保留率都有所下降，在日光燈下的色素溶液下降幅度最大，比黑暗處放置下降40.86%；黑暗處放置則相對(duì)穩(wěn)定，說明該色素在日光條件下色素發(fā)生氧化，穩(wěn)定性變差。因此，在加工過程中應(yīng)盡量避免強(qiáng)光直射。

2.2.2 溫度對(duì)穩(wěn)定性的影響

圖2 溫度對(duì)糖基化血紅蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.2 The effect of temperature on the stability of glycosylated hemoglobin

由圖2可知，隨著時(shí)間的增加，各個(gè)溫度下的糖基化血紅蛋白色素的保留率都趨于下降，30 ℃下吸光度變化最小，150 min 處理后色素保留率在65%以上，60 ℃處理色素保留率最低，150 min 處理后僅為36.32%，說明該色素在60 ℃以下比較穩(wěn)定，可進(jìn)行生產(chǎn)和加工。

2.2.3 pH對(duì)穩(wěn)定性的影響

圖3 pH對(duì)糖基化血紅蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.3 The effect of pH on the stability of glycosylated hemoglobin

由圖3可知，色素在pH 3～7時(shí)保留率逐漸上升，當(dāng)pH為7～9時(shí)吸光度值處于最大，隨后開始下降，說明該色素在酸性條件下呈色力強(qiáng)，在堿性條件下其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化，導(dǎo)致色素被破壞。

2.2.4 氧化還原劑對(duì)穩(wěn)定性的影響

圖4 氧化還原劑對(duì)糖基化血紅蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.4 The effect of redox agents on the stability of glycosylated hemoglobin

由圖4可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，加入過氧化氫的糖基化血紅蛋白色素溶液的保留率下降，但總體變化不大，處理30 min后保留率僅下降10.42%，說明該色素抗氧化性較好，而加入硫代硫酸鈉的血紅蛋白溶液保留率下降相對(duì)明顯，處理30 min后保留率則下降了31.16%，表明該色素耐還原性比較差，因此生產(chǎn)與加工時(shí)應(yīng)避免還原劑的介入。

2.2.5 金屬離子對(duì)穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，隨著時(shí)間的增加，金屬離子對(duì)色素的影響均較明顯，3種金屬離子處理后色素的保留率平均下降30.62%。Fe2+色素液的保留率下降最大，處理6 d后色素保留率比對(duì)照下降43.86%，而Al3+和Cu2 +的下降趨勢(shì)相對(duì)緩慢。說明Fe2+對(duì)色素有較大的影響，因此生產(chǎn)與加工時(shí)應(yīng)避免鐵質(zhì)器具的使用。

圖5 金屬離子對(duì)糖基化血紅蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.5 The effect of metal ions on the stability of glycosylated hemoglobin

2.2.6 食品添加劑對(duì)穩(wěn)定性的影響

圖6 部分食品添加劑對(duì)糖基化血紅蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.6 The effect of some food additives on the stability of glycosylated hemoglobin

由圖6可知， 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，加入食品添加劑對(duì)糖基化血紅蛋白溶液的保留率影響均不明顯，NaCl處理3 h后色素保留率僅下降5.12%，NaH2PO4處理3 h后色素保留率也僅下降9.61%，說明實(shí)驗(yàn)所選氯化鈉和磷酸鹽兩種食品添加劑對(duì)該色素影響較小。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)豬血血紅蛋白進(jìn)行了糖基化改性，制備了綠色、穩(wěn)定、安全的色素，該色素在光、溫度、pH、氧化還原劑、金屬離子、部分食品添加劑等條件下進(jìn)行了穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明糖基化改性后的血紅蛋白色素在30 ℃、酸性條件、部分食品添加劑等條件下處理都比較穩(wěn)定，生產(chǎn)與加工時(shí)應(yīng)避免高溫、強(qiáng)光照射、金屬離子尤其是Fe2+等。