陳 輝，黃惠華

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510000)

菠蘿蛋白酶是存在于菠蘿中的一種蛋白水解酶，可以對氨基酸殘基之間的肽鍵進(jìn)行水解。菠蘿蛋白酶在蛋白質(zhì)多肽制備、肉類嫩化等領(lǐng)域有重要應(yīng)用，在消炎、抗水腫，促進(jìn)抗生素藥物的吸收，預(yù)防血小板聚集等方面都被證實具有明顯作用[1]。菠蘿蛋白酶作為生物活性物質(zhì)發(fā)揮作用時，很容易受外界環(huán)境影響[2]，因此，增強(qiáng)酶的儲存和操作穩(wěn)定性是其實際應(yīng)用的一個重要因素。和游離酶相比，固定化酶具有穩(wěn)定性好、易回收、可重復(fù)利用等優(yōu)點[3]。固定化效果的好壞很大程度上取決于載體材料的選擇，因此選擇一種合適的固定化酶載體尤為重要[4]。纖維素作為一種天然高分子材料，來源豐富、成本低，但由于纖維素在普通溶劑中的難溶解性[5]，將纖維素作為固定化酶載體的研究較少報道。將纖維素在離子液體中溶解并改性不僅能形成水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)，還能賦予纖維素更多的與酶分子結(jié)合的功能基團(tuán)，使其成為理想的固定化酶載體[6-7]；同時，作為一種廢棄資源的利用，將菠蘿皮渣纖維素(pineapple peel cellulose，PPC)作為酶的固定化載體，也具有重要的意義。本實驗擬將菠蘿皮渣纖維素在離子液體中溶解并用L-絲氨酸改性，改性產(chǎn)物用來固定化菠蘿蛋白酶，并對固定化工藝和酶學(xué)特性進(jìn)行研究，希望得到一種良好的固定化酶載體。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿皮渣，廣州市場收集；離子液體[Bmim]Cl，中科院蘭州化學(xué)物理研究所；菠蘿蛋白酶(300 U/mg，CAS:8002-43-5)，上海麥克林生化有限科技公司；L-絲氨酸、氫氧化鈉、氯乙酸鈉、乙酸、戊二醛、L-半胱氨酸和EDTA·2Na、酪蛋白、三氯乙酸，以上試劑皆為化學(xué)純或分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA12MCW型精密分析天平，賽多利斯儀器有限公司；DF- 101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，廣州市星爍儀器有限公司； UV- 1800型紫外/可見分光光度計，日本島津公司；JW- 3021HR型高速冷凍離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；VECTOR33型傅里變換葉紅外光譜儀，德國Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1菠蘿皮渣纖維素的提取

采用Dai等[8]的方法從菠蘿皮渣中提取纖維素。將菠蘿皮渣榨汁，得到的殘渣用清水沖洗后于50 ℃烘箱中干燥，粉碎后過80目篩，得到菠蘿皮渣原纖維。稱取一定量菠蘿皮渣原纖維，加入蒸餾水(料液比為1∶20，g/mL)，于80 ℃水浴鍋中攪拌2.0 h，過濾，濾渣中加入質(zhì)量濃度為75 mg/mL的亞氯酸鈉溶液(pH值3.8～4.0)(料液比1∶20，g/mL)，于80 ℃水浴鍋中反應(yīng)5.0 h以除去木質(zhì)素。將混合物過濾，用蒸餾水沖洗至濾渣為純凈的白色。向濾渣中加入10%氫氧化鈉溶液(料液比1∶15)，室溫下攪拌處理10.0 h，除去半纖維素和其他雜質(zhì)，過濾。用蒸餾水洗滌至中性，然后用95%乙醇洗滌，冷凍干燥即得PPC，過100目篩備用。

1.3.2L-絲氨酸改性菠蘿皮渣纖維素的制備

稱取10.0 g離子液體[Bmim]Cl于試管中，在110 ℃磁力攪拌油浴鍋中溶解。另稱取一定量提取的PPC添加到溶解的離子液體[Bmim]Cl中，110 ℃磁力攪拌5.0 h，充分溶解PPC。調(diào)節(jié)溫度為80 ℃，加入一定質(zhì)量的L-絲氨酸，繼續(xù)磁力攪拌2.0 h。PPC上被活化的羥基與L-絲氨酸發(fā)生反應(yīng)，將氨基接枝到PPC上。反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水充分浸泡以置換出離子液體[Bmim]Cl，得到L-絲氨酸改性菠蘿皮渣纖維素(modified pineapple peel cellulose，MPPC)。將樣品冷凍干燥后粉碎，過60目篩，備用。

1.3.3改性菠蘿皮渣纖維素固定化菠蘿蛋白酶的制備

稱取得到的MPPC粉末20 mg于試管中，加入4 mL菠蘿蛋白酶溶液(用pH值為7.0的磷酸緩沖溶液配制，離心去除不溶物，調(diào)節(jié)菠蘿蛋白酶質(zhì)量濃度為1 mg/mL)。參考Isobe等[9]的方法，將混合物震蕩24.0 h，通過改性纖維素的功能基團(tuán)與菠蘿蛋白酶分子之間的化學(xué)吸附，以及改性纖維素三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對菠蘿蛋白酶分子的物理吸附來吸附菠蘿蛋白酶，吸附完成后離心。將下層沉淀置于4 mL戊二醛溶液中進(jìn)一步交聯(lián)一段時間，再次離心后用蒸餾水清洗數(shù)次，得到改性菠蘿皮渣纖維素固定化菠蘿蛋白酶(modified pineapple peel cellulose immobilized bromelain，MPPC-Br)，冷凍干燥備用。

1.3.4固定化菠蘿蛋白酶制備條件優(yōu)化

分別研究了PPC與離子液體[Bmim]Cl的質(zhì)量比、L-絲氨酸與PPC的質(zhì)量比、戊二醛溶液體積分?jǐn)?shù)以及交聯(lián)時間對固定化菠蘿蛋白酶活性的影響。固定L-絲氨酸與PPC的質(zhì)量比為1∶1、戊二醛溶液體積分?jǐn)?shù)為1%、交聯(lián)時間為1.0 h，考察不同PPC與離子液體[Bmim]Cl的質(zhì)量比對固定化菠蘿蛋白酶活性的影響；固定PPC與離子液體[Bmim]Cl的質(zhì)量比為3∶100、戊二醛溶液體積分?jǐn)?shù)為1%、交聯(lián)時間為1.0 h，考察不同L-絲氨酸與PPC的質(zhì)量比對固定化菠蘿蛋白酶活性的影響；固定PPC與離子液體[Bmim]Cl的質(zhì)量比為3∶100、L-絲氨酸與PPC的質(zhì)量比為1∶1、交聯(lián)時間為1.0 h，考察不同戊二醛溶液體積分?jǐn)?shù)對固定化菠蘿蛋白酶活性的影響；固定PPC與離子液體[Bmim]Cl的質(zhì)量比為3∶100、L-絲氨酸與PPC的質(zhì)量比為1∶1、戊二醛溶液體積分?jǐn)?shù)為1%，考察不同交聯(lián)時間對固定化菠蘿蛋白酶活性的影響。

1.3.5菠蘿蛋白酶活力的測定

菠蘿蛋白酶活性的測定[10]：取1 mL酶液，置于37.2 ℃水浴中預(yù)熱10 min，加入同樣在37.2 ℃預(yù)熱的酪蛋白溶液2 mL(質(zhì)量濃度為2 mg/mL，用0.2 mol/L pH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制)，混合搖勻后準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，加入體積分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液3 mL終止反應(yīng)，將混合物保溫10 min后，在8 000 r/min下離心10 min，取上清液，測定其在275 nm波長下的吸光度。對照組是取1 mL酶液，在37.2 ℃水浴中預(yù)熱10 min后，先加入3 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液，反應(yīng)10 min；再加入2 mL酪蛋白溶液，保溫10 min。在8 000 r/min下離心10 min，取上清液，測定其在275 nm波長下的吸光度。MPPC-Br的活力測定，是將20 mg MPPC-Br浸入1 mL 0.2 mol/L pH值為7.0的磷酸緩沖溶液中，其余步驟相同。菠蘿蛋白酶活性定義為：1 g(干重)固定化酶或1 mL酶液在上述條件下水解酪蛋白，每分鐘產(chǎn)生1 μg酪氨酸，即為一個酶活力單位，表示為U。

1.3.6結(jié)構(gòu)表征與分析

1.3.6.1 紅外光譜分析

對PPC、MPPC、菠蘿蛋白酶以及MPPC-Br進(jìn)行紅外光譜分析。測定條件為：在4 000～500 cm-1的頻率范圍內(nèi)以4 cm-1的分辨率進(jìn)行FT-IR測量。

1.3.6.2 熱穩(wěn)定性分析

通過熱分析儀(TGA)對PPC、MPPC及MPPC-Br進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析。測定條件為：在N2氛圍下以10 ℃/min的加熱速率從室溫升溫至500 ℃。

1.3.6.3 X射線衍射分析

采用X射線衍射儀對PPC、MPPC及MPPC-Br進(jìn)行XRD測試，測試條件為：衍射角2θ為4°～ 40°，掃描速度設(shè)定為2°/min，管壓和管流分別設(shè)置為40 kV和40 mA。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPC、MPPC、菠蘿蛋白酶以及MPPC-Br的表征結(jié)果

2.1.1PPC、MPPC、菠蘿蛋白酶以及MPPC-Br的結(jié)構(gòu)分析

圖2 PPC、MPPC和MPPC-Br的TG 和DTG的分析結(jié)果Fig.2 Results of TG and DTG analysis of PPC, MPPC and MPPC-Br

圖1 PPC、MPPC、MPPC-Br及菠蘿蛋白酶的紅外光譜Fig.1 FT-IR spectra of PPC, MPPC,MPPC-Br and bromelain

2.1.2PPC、MPPC及MPPC-Br的熱重分析結(jié)果

圖2為PPC、MPPC及MPPC-Br的熱重分析圖。3種物質(zhì)的熱分解過程都可以分為兩個階段，第一階段發(fā)生在50～80 ℃附近，是由于樣品中的水分蒸發(fā)導(dǎo)致的質(zhì)量損失；第二階段是樣品的熱降解過程，PPC的失重峰值出現(xiàn)在355 ℃附近，MPPC的峰值出現(xiàn)在308 ℃附近，而MPPC-Br的峰值出現(xiàn)在345 ℃附近。另外，當(dāng)溫度到達(dá)500 ℃時，PPC的殘留質(zhì)量為19.77%，MPPC的殘留質(zhì)量為18.00%，MPPC-Br的殘留質(zhì)量為23.70%。說明PPC經(jīng)改性后纖維素分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，熱穩(wěn)定性降低[15]，用戊二醛將菠蘿蛋白酶分子交聯(lián)到MPPC上后熱穩(wěn)定性又有所上升。

2.1.3PPC、MPPC以及MPPC-Br的XRD分析結(jié)果

圖3是PPC、MPPC和MPPC-Br的X衍射圖譜。PPC在2θ為22.2°處有一個很強(qiáng)的吸收峰，在2θ為15.7°和2θ為34.6°處分別有一個較弱的吸收峰，這些都屬于典型的天然纖維素Ⅰ型結(jié)構(gòu)的特征衍射峰[16]。將PPC在離子液體[Bmim]Cl中用L-絲氨酸改性后，在2θ為15.7°和2θ為22.2°處的衍射峰向左偏移，且強(qiáng)度減小，在2θ為34.6°處的衍射峰已經(jīng)完全消失。這些結(jié)果表明，改性后的菠蘿皮渣纖維素晶體結(jié)構(gòu)從纖維素Ⅰ型轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維素Ⅱ型，而纖維素Ⅱ型的晶體結(jié)構(gòu)沒有纖維素Ⅰ型穩(wěn)定，在離子液體中溶解后，結(jié)構(gòu)松散，有利于與氨基酸的接枝共聚反應(yīng)[17]。另外，MPPC-Br與MPPC比較，其衍射峰沒有明顯變化。

圖3 PPC、MPPC及MPPC-Br的衍射圖譜Fig.3 XRD patterns of PPC, MPPC and MPPC-Br

2.2 菠蘿蛋白酶固定化條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1PPC與離子液體[Bmim]Cl的質(zhì)量比對固定化酶活性的影響

PPC與離子液體[Bmim]Cl的質(zhì)量比對固定化酶活性的影響，實驗結(jié)果如圖4。圖4中，當(dāng)PPC與離子液體[Bmim]Cl的質(zhì)量比為1∶100，此時相對酶活性只有69.6%，這可能是因為MPPC含量太少，形成的凝膠結(jié)構(gòu)不緊密，不能很好地與酶分子結(jié)合。隨著PPC與離子液體[Bmim]Cl的質(zhì)量比增加，相對酶活性顯著增加，當(dāng)PPC與離子液體[Bmim]Cl的質(zhì)量比為3∶100時，此時相對酶活性達(dá)到最大，為100%。繼續(xù)增加PPC與離子液體[Bmim]Cl的質(zhì)量比，相對酶活性略有減小，這可能是因為在此PPC與離子液體[Bmim]Cl的質(zhì)量比值下，溶解的MPPC分子中，與酶的結(jié)合位點都得到了充分利用，因此選擇PPC與離子液體[Bmim]Cl的質(zhì)量比為3∶100。

圖4 PPC與離子液體的質(zhì)量比對固定化酶活性的影響Fig.4 Effect of mass ratio of PPC to ionic liquid on activity of immobilized enzyme

2.2.2L-絲氨酸與PPC質(zhì)量比對固定化酶活性的影響

圖5 L-絲氨酸與PPC質(zhì)量比對固定化酶活性的影響Fig.5 Effect of mass ratio of L-serine to PPC on activity of immobilized enzyme

L-絲氨酸與PPC質(zhì)量比對固定化酶活性的影響，實驗結(jié)果如圖5。圖5中，當(dāng)L-絲氨酸與PPC質(zhì)量比為1∶3時，相對酶活性為29.9%；隨著L-絲氨酸與PPC質(zhì)量比的增加，相對酶活性也顯著增加，當(dāng)L-絲氨酸與PPC質(zhì)量比為1∶1時，相對酶活性達(dá)到最大，為100%，這是因為隨著L-絲氨酸含量的增加，更多的L-絲氨酸接枝到PPC上，從而增加了與菠蘿蛋白酶的結(jié)合位點，酶得以充分的固定化。繼續(xù)增大L-絲氨酸與PPC質(zhì)量比，相對酶活性不再提高，這可能是因為PPC上活化的羥基及其結(jié)合位點已全部飽和。因此選擇L-絲氨酸與PPC質(zhì)量比為1∶1。

2.2.3戊二醛溶液體積分?jǐn)?shù)對固定化酶活性的影響

戊二醛溶液體積分?jǐn)?shù)對固定化酶活性的影響，實驗結(jié)果如圖6。圖6中，隨著戊二醛溶液體積分?jǐn)?shù)的增加，相對酶活性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這是因為低濃度的戊二醛的交聯(lián)不夠充分，而濃度過高則會導(dǎo)致酶分子本身的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響了酶的活性。

圖6 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對固定化酶活性的影響Fig.6 Effect of glutaraldehyde volume fraction on activity of immobilized enzyme

圖7 交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響Fig.7 Effect of crosslinking time on activity of immobilized enzyme

2.2.4交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響

交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響，實驗結(jié)果如圖7。圖7中，隨著交聯(lián)時間的增加，固定化酶相對酶活性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)交聯(lián)時間小于1.0 h時，交聯(lián)程度不夠，不能很好地固定菠蘿蛋白酶。但交聯(lián)時間過長，菠蘿蛋白酶與MPPC緊密結(jié)合，導(dǎo)致酶的活性位點不能很好地與底物分子結(jié)合，從而影響了酶的相對活性。因此選擇交聯(lián)時間為1.0 h比較合適。

2.3 MPPC-Br的特性分析

2.3.1MPPC-Br的熱穩(wěn)定性

將MPPC-Br和游離酶分別在不同的溫度環(huán)境下(40～80 ℃)放置2.0 h，研究溫度對酶活性的影響，結(jié)果如圖8。隨著溫度的升高，MPPC-Br在50 ℃時相對酶活性有所提升，這說明50 ℃是MPPC-Br的最適反應(yīng)溫度；繼續(xù)升高溫度，相對酶活性緩慢減小，但是到達(dá)80 ℃時，相對酶活性依然還有82.0%。而隨著溫度的升高，游離菠蘿蛋白酶的相對酶活性急劇減小，50 ℃時就只剩下48.0%，80 ℃已基本檢測不到活性，這說明MPPC-Br比游離酶具有更好的溫度穩(wěn)定性。這是因為菠蘿蛋白酶和MPPC在形成水凝膠過程中，通過固定化形成了共價鍵或氫鍵，酶活性位點的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，MPPC-Br的熱穩(wěn)定性得以提高，同時水凝膠對酶分子也有一定的保護(hù)作用。

圖8 MPPC-Br的熱穩(wěn)定性Fig.8 Thermal stability of MPPC-Br

2.3.2MPPC-Br的酸堿穩(wěn)定性

分別將MPPC-Br和游離酶在不同pH值條件下放置24.0 h，測定其酶活性，結(jié)果如圖9。圖9中，pH值為2.0時，MPPC-Br的相對酶活性為80.6%，而游離酶的相對酶活性為55.8%；pH值小于4.0時，游離酶隨著pH值的下降相對酶活性顯著下降，而MPPC-Br相對酶活性變化不大，說明MPPC-Br比游離酶更耐酸性環(huán)境。MPPC-Br在pH值為4.0時穩(wěn)定性最好，而游離酶在pH值為5.0時穩(wěn)定性最好，說明MPPC-Br較游離酶最適反應(yīng)pH值向酸性移動。

圖9 MPPC-Br的酸堿穩(wěn)定性Fig.9 pH stability of MPPC-Br

3 結(jié) 論

本實驗將PPC在離子液體中改性并用于固定化菠蘿蛋白酶。所制備的MPPC-Br活性受PPC與離子液體的質(zhì)量比、L-絲氨酸與PPC的質(zhì)量比、戊二醛體積分?jǐn)?shù)以及交聯(lián)時間的影響。當(dāng)PPC與離子液體的質(zhì)量比為3∶100，L-絲氨酸與PPC的質(zhì)量比為1∶1，戊二醛體積分?jǐn)?shù)為1.0%，交聯(lián)時間為1.0 h時，MPPC-Br的活性最高。在80 ℃環(huán)境下放置2.0 h后，MPPC-Br仍然具有82.0%的相對酶活，而游離菠蘿蛋白酶在此條件下幾乎失活，說明MPPC-Br具有更好的溫度穩(wěn)定性。MPPC-Br在pH為4.0時穩(wěn)定性較好，而游離酶在pH為5.0時穩(wěn)定性更好，說明MPPC-Br比游離酶更耐酸性環(huán)境。本實驗以菠蘿皮渣為原料，開發(fā)了一種新的固定化酶載體，對廢棄資源的高值化利用具有重要意義。所制備的固定化菠蘿蛋白酶具有較好的溫度穩(wěn)定性和酸環(huán)境穩(wěn)定性，希望能為其他以纖維素為基礎(chǔ)的固定化酶載體的開發(fā)提供理論參考。