蔡 淼，陳 超，曹永強(qiáng)，楊貞耐，*

(1.北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100048；2.東君乳業(yè)(禹城)有限公司， 山東 德州 253000)

微生物胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)是微生物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞外的高分子化合物，具有易提取、生產(chǎn)不受季節(jié)影響、生產(chǎn)周期短等優(yōu)勢(shì)[1]。但其產(chǎn)量受多種因素的影響，不僅與自身的遺傳性質(zhì)有關(guān)，還容易受到菌體生長(zhǎng)環(huán)境的影響，培養(yǎng)基的組成以及培養(yǎng)條件都會(huì)對(duì)多糖的產(chǎn)量產(chǎn)生影響[2]。因此，選擇合適的培養(yǎng)條件至關(guān)重要。微生物EPS具有多種生物學(xué)活性。Sasikumar等[3]研究發(fā)現(xiàn)，LactobacillusplantarumBR2產(chǎn)生的EPS具有DPPH自由基清除能力，對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。許女等[4]對(duì)干酪乳桿菌KW3 EPS進(jìn)行抗氧化研究，體外研究結(jié)果顯示，EPS具有DPPH自由基清除能力；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KW3胞外多糖可顯著降低衰老小鼠血清、肝和腦組織中的MDA含量, 提高其SOD活性和GSH- Px活性。

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌廣泛存在于自然界，具有重要的商業(yè)價(jià)值，目前對(duì)其代謝物的研究主要集中在蛋白酶、氨肽酶的培養(yǎng)條件優(yōu)化、抗菌肽對(duì)羅非魚(yú)片的保鮮效果等方面[5-7]，但對(duì)EPS的研究報(bào)道較少。

本研究針對(duì)一株從傳統(tǒng)酒曲中分離篩選得到的高產(chǎn)EPS的菌株GSBm- 1，16S rDNA進(jìn)行菌株鑒定，響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件，旨在提高其EPS的產(chǎn)量，探究EPS生物活性，包括體外抗氧化和降血糖活性，為EPS在功能性食品中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株GSBm- 1由實(shí)驗(yàn)室從傳統(tǒng)酒曲中分離純化并保藏。

胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、蔗糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、檸檬酸銨、尿素、大豆蛋白胨、三氯乙酸(TCA)、無(wú)水乙醇、苯酚、濃硫酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

菌株GSBm- 1基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成：酵母浸粉5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、氯化鈉10.0 g，去離子水1 L。調(diào)節(jié)pH值為7.2，121 ℃高溫滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

低溫冰箱(-80 ℃)， 美國(guó)Thermo公司； MLS- 3750型高壓滅菌鍋，日本Sanyo公司；CR21GⅢ型高速冷凍離心機(jī)、HZQ- Q型氣浴恒溫?fù)u床，日本Hitachi公司；Elx800型酶標(biāo)儀，美國(guó)博騰儀器有限公司；S20型數(shù)顯pH計(jì)，上海Mettler Toledo儀器有限公司；透析袋(8 000～14 000 D)，北京生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1基于16S rDNA的菌種分子生物學(xué)鑒定

樣品由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Gen Bank中已知菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.3.2菌株活化

將菌株接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，接種量為3%，37 ℃、140 r/min培養(yǎng)18 h，連續(xù)活化兩代后備用。

1.3.3胞外多糖的提取

參照Wang等[8]的方法，略作改動(dòng)。將活化后的菌株接種在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，接種量為3%，140 r/min、37 ℃培養(yǎng)24 h，加入TCA使其最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，140 r/min震蕩2 h除去雜蛋白，而后9 810 r/min、4 ℃離心45 min，收集上清液。將2倍體積的無(wú)水乙醇加入到上清液中，并4 ℃靜置24 h。沉淀后的溶液在9 810 r/min、4 ℃的條件下離心30 min后，除去上清液，用蒸餾水溶解沉淀，4 ℃條件下透析48 h，每8 h換一次水。

1.3.4胞外多糖的測(cè)定

采用苯酚- 濃硫酸法測(cè)定菌株胞外多糖的產(chǎn)量：從透析袋中取100 μL樣品用蒸餾水稀釋至1 mL，加入500 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%苯酚及2.5 mL濃硫酸，搖勻，避光靜置30 min。取200 μL混合靜置后的溶液于96孔板中，在490 nm條件下測(cè)吸光度。

將葡萄糖溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品，490 nm條件下測(cè)吸光度，得到回歸方程，y=0.006 3x+0.001 9，R2=0.999 7。

1.3.5單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先對(duì)影響多糖產(chǎn)量的因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別選取碳源(蔗糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖)、氮源(尿素、蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸銨、檸檬酸銨、牛肉膏)、pH值(5、6、7、8、9)、溫度(27、32、37、42、47 ℃)、轉(zhuǎn)速(100、120、140、160、180 r/min)、時(shí)間(12、24、36、48、60 h)、接種量(1%、2%、3%、4%、5%)為單因素，按照1.3.3的方法提取多糖，1.3.4的方法測(cè)定菌株胞外多糖的產(chǎn)量。

1.3.6Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)的因素水平，用MINITAB 15.0選取N=12的Plackett- Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)影響胞外多糖產(chǎn)量的7個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素取2個(gè)水平，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Plackett- Burman試驗(yàn)因素與水平

1.3.7響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以胞外多糖產(chǎn)量作為響應(yīng)值，對(duì)3個(gè)因素進(jìn)行考察，以單因素實(shí)驗(yàn)中胞外多糖產(chǎn)量最高的條件為0水平，設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.3.8體外抗氧化活性測(cè)定

取EPS樣品，配制成0、2、4、6、8、10、15、20、25 mg/mL的樣品溶液，分別測(cè)定抗氧化指標(biāo)。

DPPH自由基清除能力測(cè)定：參照Xu等[9]的方法，略作改動(dòng)。取1 mL多糖樣品與2 mL 0.2 mmol/L的DPPH甲醇溶液混合，室溫避光反應(yīng)1 h，離心，于517 nm處測(cè)定吸光度。DPPH自由基清除率計(jì)算見(jiàn)式(1)。

DPPH清除率=[1-(A1-A)/A0]×100%。

(1)

式(1)中，A，以等體積甲醇代替DPPH溶液的空白組吸光度；A0，以等體積無(wú)菌水代替樣品的對(duì)照組吸光度；A1，樣品組吸光度。

ABTS+自由基清除能力測(cè)定：采用ABTS+測(cè)定試劑盒。

圖1 菌株GSBm- 1 16S rDNA 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of bacterial strain GSBm- 1 based on 16S rDNA sequence

亞鐵螯合能力的測(cè)定：參照Tang等[10]的方法，略作改動(dòng)。多糖樣品1 mL，2 mol/L氯化亞鐵溶液0.05 mL，5 mol/L菲啰嗪0.2 mL，2.75 mL蒸餾水，室溫下放置10 min，于562 nm處測(cè)定其吸光度。亞鐵螯合能力計(jì)算見(jiàn)式(2)。

Fe2+螯合能力=[A0-(A1-A2)]/A0×100%。

(2)

式(2)中，A0，對(duì)照組的吸光度(蒸餾水代替樣品)；A1，樣品組吸光度；A2，空白組吸光度(蒸餾水代替氯化亞鐵)。

1.3.9降血糖活性測(cè)定

參照Wang等[11]的方法，略作改動(dòng)。5 μLα-葡萄糖苷酶，20 μL EPS溶液與165 μL PBS(0.1 mmol/L, pH 值6.8)混合，37 ℃放置10 min，加入10 μL 含0.95 mmol/L PNP- Glu的0.1 mol/L的PBS溶液(pH值6.9)，37 ℃放置10 min，加入100 μL的1 mol/L Na2CO3。測(cè)定405 nm處的吸光度。α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算見(jiàn)式(3)。

α-葡萄糖苷酶抑制率=
[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100%。

(3)

式(3)中，A1，PBS、酶、底物、 Na2CO3溶液的吸光度；A2，PBS和Na2CO3溶液的吸光度；A3，PBS、酶、樣品、底物、 Na2CO3溶液的吸光度；A4，PBS、酶、樣品、 Na2CO3溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Sigmaplot 10.0繪圖，結(jié)果均用“平均值±方差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于16S rDNA的序列相似性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將菌株的16S rDNA基因序列與在Gen Bank中序列大小相近的已知菌株的序列進(jìn)行比對(duì)后, 選取與菌株序列相似性較高的菌株序列, 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 結(jié)果如圖1。 由圖1可知,菌株與Bacillusmethylotrophicus261AY3在同一分支上,且置信度支持率高, 可將菌株鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)。目前對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌EPS的研究較少，本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件及其生物活性進(jìn)行研究。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1碳源的影響

圖2 碳源對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of carbon sources on yield of EPS

碳源對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖有至關(guān)重要的作用，對(duì)胞外多糖產(chǎn)量也有重要影響。對(duì)于不同的菌株，最適合其生長(zhǎng)的碳源種類(lèi)及質(zhì)量濃度不一定相同，因此，選擇合適的碳源及添加量是十分必要的。已有研究發(fā)現(xiàn)，在蔗糖質(zhì)量濃度為25.449 g/L時(shí)，枯草芽孢桿菌胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大值[12]。本實(shí)驗(yàn)選取5種不同的碳源進(jìn)行研究，結(jié)果如圖2(a)。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌能利用多種碳源合成EPS，其中當(dāng)蔗糖作為碳源時(shí)，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌EPS的產(chǎn)量最大。

圖3 氮源對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on yield of EPS

研究進(jìn)一步測(cè)定了添加不同質(zhì)量濃度的蔗糖時(shí)胞外多糖的產(chǎn)量，結(jié)果如圖2(b)。當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度低于20 g/L時(shí)，隨蔗糖添加量升高，胞外多糖產(chǎn)量升高，胞外多糖產(chǎn)量最大值為434.9 mg/L；但超過(guò)20 g/L時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。趙雯等[13]對(duì)解淀粉芽孢桿菌GSBa- 1產(chǎn)EPS的培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蔗糖的質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)，EPS產(chǎn)量有明顯的提升，當(dāng)超過(guò)40 g/L時(shí)出現(xiàn)下降的趨勢(shì)?？赡苡捎谡崽呛肯鄬?duì)過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生滲透壓脅迫，抑制菌體的生長(zhǎng)及EPS的合成。

2.2.2氮源的影響

氮源主要影響菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)，與其次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選取6種不同的氮源進(jìn)行探究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(a)。當(dāng)加入的氮源為大豆蛋白胨時(shí)，胞外多糖的產(chǎn)量明顯升高，為434.5 mg/L。 因此，選取大豆蛋白胨進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

不同大豆蛋白胨質(zhì)量濃度下胞外多糖的產(chǎn)量如圖3(b)。添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的大豆蛋白胨時(shí)，菌株產(chǎn)生胞外多糖的能力不相同。隨添加量的增加，胞外多糖產(chǎn)量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)添加量達(dá)到30 g/L時(shí)，菌株胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大值。根據(jù)姜云蕓等[14]的研究，植物乳桿菌K25也是以大豆蛋白胨為最佳氮源，當(dāng)其質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí), EPS的產(chǎn)量有顯著提升。在添加量過(guò)低時(shí)，大豆蛋白胨不足以為菌體的生長(zhǎng)提供氮元素，導(dǎo)致產(chǎn)糖量偏低；當(dāng)添加量過(guò)大時(shí)，可能由于大豆蛋白胨對(duì)菌體的滲透壓脅迫作用導(dǎo)致產(chǎn)糖量偏低。

2.2.3培養(yǎng)基初始pH值的影響

本研究選擇培養(yǎng)基初始pH值為5～9進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4。隨著pH值的升高，胞外多糖的產(chǎn)量先呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH值為7時(shí)，產(chǎn)糖量達(dá)到最大值；當(dāng)pH值大于7時(shí)，EPS產(chǎn)量逐漸下降。不同菌體所要求的生長(zhǎng)環(huán)境pH值不同，研究發(fā)現(xiàn)，酒酒球菌(Oenococcusoeni)在pH值為4.3時(shí)EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值[15]。因此，酸性過(guò)大或者堿性過(guò)大都可能導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)緩慢，進(jìn)而影響次級(jí)代謝物的產(chǎn)量；這可能是由于pH值能夠影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及酶的活性。

圖4 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of initial pH of growth medium on yield of EPS

2.2.4發(fā)酵溫度的影響

每株菌都有適宜自身生長(zhǎng)的最適溫度，生產(chǎn)不同代謝產(chǎn)物的菌株的最適溫度不相同。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了在不同溫度下胞外多糖的產(chǎn)量，結(jié)果如圖5。隨著發(fā)酵溫度的升高，胞外多糖產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在37 ℃條件下達(dá)到最大值，在此條件下，產(chǎn)糖量為313.7 mg/L。張愛(ài)梅等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，菌株TT207的EPS產(chǎn)量隨溫度變化也呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到34 ℃時(shí)，EPS產(chǎn)量最高，說(shuō)明溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于EPS的產(chǎn)生。溫度過(guò)低，可能不利于微生物的生長(zhǎng)代謝及次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成；溫度過(guò)高可能導(dǎo)致微生物體內(nèi)合成胞外多糖的酶活性降低甚至失去活性。因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度，合適的溫度可以使菌株的生長(zhǎng)速度加快，進(jìn)而提高胞外多糖的產(chǎn)量。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation temperatures on yield of EPS

2.2.5轉(zhuǎn)速的影響

轉(zhuǎn)速對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速低于140 r/min時(shí)，產(chǎn)糖量隨轉(zhuǎn)速的升高而增多；但超過(guò)140 r/min時(shí)，產(chǎn)糖量呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)?？赡苁怯捎诋?dāng)轉(zhuǎn)速過(guò)低時(shí)，菌液的透氣性不好，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢；轉(zhuǎn)速過(guò)高時(shí)，雖然菌液透氣性較好，但可能會(huì)由于震蕩過(guò)于劇烈而對(duì)菌體造成機(jī)械損傷，生物量偏低，也導(dǎo)致產(chǎn)糖量偏低。

圖6 轉(zhuǎn)速對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of shaking speed on yield of EPS

2.2.6接種量的影響

接種量會(huì)對(duì)生物量造成直接影響，從而間接影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量(見(jiàn)圖7)。由圖7可知，當(dāng)接種量為4%時(shí)，產(chǎn)糖量達(dá)到最大值，為355.9 mg/L。接種量過(guò)低時(shí)，生物量也偏低；隨著接種量增加，產(chǎn)糖量并非持續(xù)增加。接種量過(guò)高時(shí)，培養(yǎng)基中的養(yǎng)分可能不足以為菌體提供足夠的營(yíng)養(yǎng)，EPS合成能力不足，還可能由于氧氣供應(yīng)量較低導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢、次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量偏低。

圖7 接種量對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of inoculum on yield of EPS

2.2.7發(fā)酵時(shí)間的影響

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of fermentation time on yield of EPS

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，胞外多糖產(chǎn)量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵48 h時(shí)達(dá)到最大值，見(jiàn)圖8。發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，只能保證菌體自身生長(zhǎng)，而胞外多糖可能尚未有效產(chǎn)出。曹永強(qiáng)等[2]和Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，植物乳桿菌YW11和植物乳桿菌C88的EPS產(chǎn)量都出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，可能由于菌體自身產(chǎn)生了降解EPS的酶，使EPS產(chǎn)量下降[18]。因此，選擇合適的培養(yǎng)時(shí)間至關(guān)重要。

2.3 主因素選取結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)以多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值Y，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析見(jiàn)表3、表4。

從表4方差分析中可以看出此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜值為0.004小于0.05，且R2=0.976 0,R2(調(diào)整)=0.933 9，表明此模型顯著，擬合性好。由T值可得知轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、氮源、碳源、接種量對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響是正向的，培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH值對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響是負(fù)向的。

表3 Plackett- Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值變化

表4 Plackett- Burman試驗(yàn)方差分析

*表示顯著水平(P<0.05)，**表示極顯著水平(P<0.01)。

由表4可知，大豆蛋白胨對(duì)EPS產(chǎn)量影響非常顯著(P<0.01)，蔗糖、培養(yǎng)基初始pH值對(duì)EPS產(chǎn)量影響顯著(P<0.05)。由此得知，大豆蛋白胨添加量、蔗糖添加量、培養(yǎng)基初始pH值對(duì)EPS影響最大，以上述3個(gè)因素為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.4.1響應(yīng)面結(jié)果分析

響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果如表5，以胞外多糖產(chǎn)量作為響應(yīng)值，得到Y(jié)對(duì)自變量A、B、C的二次多項(xiàng)擬合方程：

Y=496.40+37.69A+5.88B-10.26C+36.65AB-
92.13AC-27.25BC-56.84A2-52.56B2-80.24C2。

模型方差分析見(jiàn)表6，模型F值為135.95，P<0.000 1，影響極顯著；失擬項(xiàng)F值為5.94，P值為0.059 0>0.05，失擬項(xiàng)不顯著。且函數(shù)的相關(guān)系數(shù)為R2=0.984 3，R2(調(diào)整)=0.977 0，說(shuō)明該模型能夠充分反應(yīng)胞外多糖產(chǎn)量的情況。通過(guò)比較各因素的F值，各個(gè)因素對(duì)胞外多糖產(chǎn)量影響的大小順序依次是大豆蛋白胨添加量、培養(yǎng)基初始pH值、蔗糖添加量。單獨(dú)分析各因素可知，大豆蛋白胨添加量影響極顯著，培養(yǎng)基初始pH值影響顯著，所有二次項(xiàng)以及交互項(xiàng)的影響極顯著。由此可知，各因素對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響不是線(xiàn)性關(guān)系。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果

圖9 大豆蛋白胨和蔗糖含量對(duì)EPS 產(chǎn)量的影響Fig.9 Effects of soy peptone concentrations and sucrose concentrations on EPS yield

表6 回歸模型的方差分析

*表示顯著水平(P<0.05)，**表示極顯著水平(P<0.01)。

2.4.2響應(yīng)面交互作用分析

各個(gè)因素之間的相互作用如圖9至圖11，其含義為當(dāng)其中一個(gè)因素取0水平時(shí)，另兩個(gè)因素之間的相互作用，等高線(xiàn)圖可表示交互作用的強(qiáng)弱，其中圓形表示相互作用較弱，橢圓形則表示交互作用顯著。

圖10 大豆蛋白胨含量和初始pH 值對(duì)EPS 產(chǎn)量的影響Fig.10 Effects of soy peptone concentrations and initial pH on EPS yield

圖11 蔗糖含量和初始pH值對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig.11 Effects of sucrose concentrations and initial pH on EPS yield

大豆蛋白胨含量與蔗糖含量交互作用的等高線(xiàn)圖呈橢圓形，說(shuō)明二者交互作用比較顯著(如圖9)。當(dāng)固定pH值為7時(shí)，相同蔗糖質(zhì)量濃度下，大豆蛋白胨質(zhì)量濃度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量有較大影響，隨大豆蛋白胨質(zhì)量濃度的增大而呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。

大豆蛋白胨含量與培養(yǎng)基初始pH值交互作用的等高線(xiàn)圖呈橢圓形，說(shuō)明二者交互作用比較顯著(如圖10)。固定蔗糖添加量為20 g/L時(shí)，相同大豆蛋白胨質(zhì)量濃度下，隨pH值的升高，胞外多糖產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。

蔗糖含量與培養(yǎng)基初始pH值交互作用的等高線(xiàn)圖呈橢圓形，說(shuō)明二者交互作用比較顯著(如圖11)。固定大豆蛋白胨的添加量為30 g/L時(shí)，蔗糖含量的等高線(xiàn)更為緊密，培養(yǎng)基初始pH值等高線(xiàn)更為稀松，這說(shuō)明培養(yǎng)基初始pH值對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響更大。

由Design-Expert軟件分析可得出，優(yōu)化發(fā)酵條件為酵母提取物5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、蔗糖26.0 g/L、大豆蛋白胨40.0 g/L、pH值 6.26、接種量4%、溫度37 ℃、時(shí)間48 h、轉(zhuǎn)速140 r/min，預(yù)測(cè)胞外多糖產(chǎn)量為522.8 mg/L。利用軟件給出的培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，對(duì)測(cè)量結(jié)果取平均值。經(jīng)驗(yàn)證在此條件下，胞外多糖產(chǎn)量為(520.1±1.2) mg/L，與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

2.5 EPS抗氧化活性分析

DPPH自由基是一個(gè)穩(wěn)定的自由基，若能將其清除，則表明樣品具有較強(qiáng)的自由基清除能力，因而DPPH自由基清除能力常作為評(píng)價(jià)某物質(zhì)抗氧化性的有效指標(biāo)[19]。圖12是不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)EPS的抗氧化活性。如圖12(a)，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌EPS對(duì)DPPH自由基有一定清除能力，且清除能力與EPS質(zhì)量濃度有關(guān)。董樂(lè)等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EPS質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，EPS對(duì)DPPH自由基的清除率為19.32%。本實(shí)驗(yàn)研究中，當(dāng)EPS為10 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率已經(jīng)達(dá)到40.04%。隨著EPS質(zhì)量濃度的升高，DPPH自由基清除能力繼續(xù)升高；在EPS質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除能力達(dá)到70.67%。這可能是由于EPS存在一些官能團(tuán)使自由基轉(zhuǎn)化成了更穩(wěn)定的形式，或與自由基反應(yīng)終止了其鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[21]。不同來(lái)源的EPS在DPPH自由基清除能力上存在差異，可能與EPS的單糖組成、羥基和羧基的含量以及供氫能力有關(guān)。

圖12 不同質(zhì)量濃度胞外多糖的抗氧化活性Fig.12 Antioxidant activity of EPS with different concentrations

ABTS+自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，在抗氧化劑存在的情況下，ABTS+自由基將會(huì)減少[22]。如圖12(b)，當(dāng)EPS質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+自由基的清除能力超過(guò)了50%。隨著EPS質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，ABTS+自由基清除能力也隨之增強(qiáng)，EPS質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，ABTS+自由基清除能力達(dá)到71.69%。

鐵是各種金屬離子中最強(qiáng)的促氧化劑，催化脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞成分的氧化反應(yīng)[23]。金屬螯合劑可以將這些過(guò)渡金屬轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的化合物，通過(guò)螯合作用抑制氧化反應(yīng)。如圖12(c)，EPS在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，沒(méi)有螯合作用，但隨著EPS含量的提高，逐漸體現(xiàn)其螯合作用；當(dāng)EPS質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，螯合作用最大為55.25%。據(jù)報(bào)道，具有-OH，-SH，-COOH，-PO3H2，-CO，-NR2，-S-和-O-官能團(tuán)中兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)的化合物可以顯示金屬螯合活性[24]。因此甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌產(chǎn)生的EPS可能含有一部分以上官能團(tuán)。

2.6 EPS降血糖活性分析

食物中的淀粉、雙糖等較大的分子不能直接被人體吸收，需通過(guò)協(xié)同作用生成單糖后才能被人體吸收，因此可以通過(guò)阻止α-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)降低血糖的效果[25]。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌產(chǎn)生的EPS對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定抑制作用，且抑制率與EPS質(zhì)量濃度有關(guān)(如圖13)。當(dāng)EPS質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，抑制率為33.79%；當(dāng)EPS質(zhì)量濃度繼續(xù)升高時(shí)，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率也呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。已有研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于Probio 65的EPS也對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用，且當(dāng)EPS質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，抑制率為7.05%[26]，低于本實(shí)驗(yàn)中的研究結(jié)果。不同來(lái)源的EPS對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果存在差異，可能是由于EPS結(jié)構(gòu)的不同。

圖13 不同質(zhì)量濃度EPS對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率Fig.13 Different concentrations of EPS on inhibition of α-glucosidase activity

3 結(jié) 論

一株從傳統(tǒng)酒曲中分離的產(chǎn)EPS的菌株，經(jīng)16S rDNA鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌GSBm- 1。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化發(fā)酵條件為氯化鈉10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、蔗糖26.0 g/L、大豆蛋白胨40.0 g/L、pH值6.26、溫度37 ℃、時(shí)間48 h、轉(zhuǎn)速140 r/min、接種量4%，在此條件下胞外多糖的產(chǎn)量達(dá)到最大值，為(520.1±1.2) mg/L。與優(yōu)化前相比，EPS產(chǎn)量提高了33.8%。將提取得到的EPS進(jìn)行體外抗氧化能力及降血糖活性的測(cè)定，結(jié)果表明，EPS具有DPPH、ABTS+自由基清除能力、Fe2+螯合能力，表現(xiàn)出一定的抗氧化性；且對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用，對(duì)降血糖有一定效果。因此，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌GSBm- 1具有高產(chǎn)EPS的能力，其EPS具有多種生物學(xué)功能，在功能食品研發(fā)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。