馬冰濤，范恩帝，李澤霞，張煜行，張志民，陳葉福，肖冬光，郭學(xué)武,,*

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院/工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457； 2.河北衡水老白干釀酒(集團(tuán))有限公司 ， 河北 衡水 053000)

中國白酒歷史悠久，是世界六大蒸餾酒之一，因具備歷史、品牌、價(jià)值、口感、經(jīng)典等因素而躋身世界名酒之列[1]。到目前為止，中國白酒共分為12種香型，其中又以清、濃、醬、米4種香型為基本香型，其余香型則由其中2種或2種以上的基本香型復(fù)合所派生[2]，如老白干香型。有研究表明，老白干香型白酒中的主要酯類物質(zhì)是乙酸乙酯和乳酸乙酯，而這兩者比值高達(dá)1∶1.5至1∶2.0，遠(yuǎn)高于其他香型白酒[3]，這也正是老白干香型的獨(dú)特所在。老白干香型典型代表為衡水老白干，其香氣清雅、自然協(xié)調(diào)、綿柔醇和、回味悠長[4]，這不僅得益于衡水獨(dú)特的氣候和地理環(huán)境，更取決于其獨(dú)特的大曲(純小麥中溫曲，原料不潤料，不加母曲，曲柸水分含量低)[5]。

微生物在白酒釀造過程中具有舉足輕重的作用，如：細(xì)菌(芽孢桿菌、乳酸菌、放線菌和梭菌等)能產(chǎn)生酯類、有機(jī)酸、吡嗪、萜烯等微量成分，從而影響白酒的風(fēng)味與品質(zhì)[6]；霉菌具有較強(qiáng)的糖化能力、液化力以及蛋白質(zhì)分解能力，也能產(chǎn)生少量的風(fēng)味物質(zhì)和風(fēng)味前體物質(zhì)，主要集中在醇類、酚類和呋喃類[7-8]；酵母菌對于酒精發(fā)酵以及相關(guān)酶系的產(chǎn)生起著重要的作用，具有較強(qiáng)的生香功能[8]，并且能抑制發(fā)酵過程中一些腐敗微生物的繁殖[9]，同時(shí)也有研究表明，除了酯、酸、高級醇和醛外，酵母菌還能產(chǎn)生一些α-Terpineol等萜烯類物質(zhì)[10]。白酒中的微量成分是形成各種香型白酒獨(dú)特風(fēng)味的直接決定性因素，同時(shí)部分微量成分還具有保健作用[11]。研究微生物與微量成分之間的關(guān)系對指導(dǎo)白酒生產(chǎn)有著重要意義。王鵬等[12]通過高通量測序技術(shù)結(jié)合頂空固相微萃取氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS- SPME- GC- MS)技術(shù)，得出白酒釀造過程中的核心微生物群，認(rèn)為該核心微生物群推動(dòng)了風(fēng)味的演變；王鵬等[13]通過高通量測序方法解析了綿甜型白酒酒醅中的微生物群落結(jié)構(gòu)；孫樂平等[14]同樣借助HS- SPME- GC- MS技術(shù)結(jié)合高通量測序的方法，研究了燕麥黃酒中的微生物群落結(jié)構(gòu)，并分析了燕麥黃酒中的高級醇與微生物之間的關(guān)系，認(rèn)為燕麥可以增加黃酒中高級醇的種類和含量。這些研究借助高通量技術(shù)很好地解析了樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)，并分析了微生物對部分風(fēng)味成分的影響，但對微生物與整體風(fēng)味成分的關(guān)系，以及微生物之間的相互作用分析較少。本研究正是建立在此基礎(chǔ)上，通過高通量測序技術(shù)對老白干香型酒醅進(jìn)行測序，探究白酒釀造過程中的微生物多樣性和群落演替，同時(shí)利用HS- SPME- GC- MS技術(shù)監(jiān)測白酒釀造過程中微量成分的組成和變化，分析釀酒過程中微生物對微量成分的貢獻(xiàn)情況，以期為提高白酒品質(zhì)、改良標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 酒醅樣品的采集

酒醅樣品取自河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司釀酒車間，衡水老白干作為老白干香型的典型代表，其研究結(jié)果更具代表性。隨機(jī)抽取一個(gè)釀酒車間，從車間再隨機(jī)抽取兩個(gè)班組，一個(gè)作為實(shí)驗(yàn)班組，一個(gè)作為對照班組。從酒醅入池第一天開始跟蹤取樣，取樣時(shí)間點(diǎn)根據(jù)發(fā)酵溫度變化選擇[15]，分別取0、3、5、7、14、21、30 d(出池)7種樣品，每種進(jìn)行兩次平行實(shí)驗(yàn)，以確保樣品的代表性和穩(wěn)定性。每次使用取樣器取同一地缸上中下層酒醅，在無菌環(huán)境下充分混勻后四分法取樣，每個(gè)樣品取兩份，每份50 g，一份置于-20 ℃用于微量成分分析，一份置于-80 ℃用于高通量測序。

1.2 儀器與試劑

7890A- 5975C型氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS型萃取頭，美國Supelco公司；HJ- 2A型磁力加熱攪拌器，上海維誠儀器有限公司；FA2004型電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；20 mL頂空萃取瓶，美國Agilent公司。

色譜純標(biāo)準(zhǔn)品：癸酸乙酯(110-38-3)、己酸乙酯(123-66-0)、乳酸乙酯(97-64-3)、乙偶姻(513-86-0)、β-石竹烯(87-44-5)、β-環(huán)檸檬醛(432-25-7)、香葉基丙酮(3796-70-1)、α-石竹烯(6753-98-6)、正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液，美國 Sigma-Aldrich 公司；乳酸(50-21-5)、乙酸(64-19-7)、己酸(142-62-1)、乙醛(75-07-0)、異戊醛(590-86-3)、愈創(chuàng)木酚(90-05-1)、苯酚(108-95-2)、苯乙醇(60-12-8)、乙醇(64-17-5)、乙酸乙酯(141-78-6)、異戊醇(123-51-3)、2,3-丁二醇(513-85-9)、川芎嗪(1124-11-4)，百靈威科技有限公司。NaCl (分析純)，天津市化學(xué)試劑一廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1微量成分的檢測

參照王敏等[16]測定白酒中風(fēng)味物質(zhì)的方法，使用頂空固相微萃取配合氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測酒醅中風(fēng)味成分，優(yōu)化部分參數(shù)。

1.3.1.1 色譜條件的確定

HP- 5MS型色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。升溫程序：40 ℃保持30 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持1 min，以6 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。注射模式：不分流進(jìn)樣。載氣：He(>99.999%)。載氣流量1 mL/min，解吸附8 min。

1.3.1.2 質(zhì)譜條件的確定

離子源為EI源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，電子倍增器電壓870 V，質(zhì)量掃描范圍m/z35～500 u。質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)庫為NIST14(Agilent公司)。

1.3.1.3 萃取方法

10 g酒醅水浴加熱浸提，提取溫度80 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，提取時(shí)間1.5 h，料液比(g/mL)1∶15。在頂空瓶中加入5 mL酒醅提取液，2.5 g NaCl，采用固相微萃取方法，通過萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)水浴加熱萃取，吸附時(shí)間60 min，萃取溫度60 ℃，平衡時(shí)間5 min。

1.3.2保留指數(shù)的計(jì)算

取0.1 μL正構(gòu)烷烴混標(biāo)，按照1.3.1的方法進(jìn)樣分析，記錄每個(gè)正構(gòu)烷烴對應(yīng)的保留時(shí)間和樣品各色譜峰的保留時(shí)間，各揮發(fā)性化合物保留指數(shù)的計(jì)算如式(1)。

(1)

式(1)中：RI為揮發(fā)性化合物的保留指數(shù)；n為該化合物碳標(biāo)的原子數(shù)；RTx為該化合物的保留時(shí)間；RTn為碳數(shù)n正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間；RTn+1為碳數(shù)n+1正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。

1.4 高通量測序

1.4.1基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

采用SDS方法對樣本的基因組進(jìn)行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。 取適量的樣本DNA于離心管中，用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物(Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer, New England Biolabs公司)和高效高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。細(xì)菌所用引物為338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 806R (5′-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，該引物針對細(xì)菌和古細(xì)菌16S rRNA基因序列中的V3、V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；真菌測序區(qū)域選擇ITS2區(qū)域，引物為ITS3F (5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。

1.4.2PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE 2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，剪切回收目標(biāo)條帶。

1.4.3文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

使用建庫試劑盒(Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns, ThermoFisher 公司)進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用Ion S5TMXL(ThermoFisher公司)進(jìn)行上機(jī)測序。測序得到的原始數(shù)據(jù)，存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，首先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)?；谟行?shù)據(jù)進(jìn)行OTUs(operational taxonomic units )聚類和物種分類分析。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，對OTUs進(jìn)行豐度、α和β多樣性分析。對不同樣本在97%一致性閾值下的α多樣性分析指數(shù)(Shannon、Chao1、樣品覆蓋率)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5 微量成分熱圖的繪制和聚類分析

熱圖和聚類分析可以清晰顯示制曲過程中各種微量成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，同時(shí)可以看出各個(gè)樣本之間的相似度。使用MSD化學(xué)工作站處理氣質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)，得到微量成分在各個(gè)樣本中的含量和種類，在初始閾值為12的前提下篩選匹配度大于800的成分作為有效數(shù)據(jù)。使用OmicShare云平臺(tái)(https:∥www.omicshare.com)對所有樣本進(jìn)行聚類分析和熱圖繪制。

1.6 核心微生物與微量成分的關(guān)系確定

參考王鵬等[12]研究中國白酒發(fā)酵過程中的核心微生物群及其與環(huán)境因子關(guān)系的方法，將所有樣品中檢測到的風(fēng)味成分和在屬水平選取的豐度top20的細(xì)菌和真菌作為變量，7個(gè)時(shí)間段檢測到的風(fēng)味成分含量和微生物含量(取平行樣品的均值)分別對應(yīng)每個(gè)變量，通過SPSS 24.0計(jì)算微生物與風(fēng)味物質(zhì)之間的Spearman相關(guān)系數(shù)(ρ)，選取系數(shù)絕對值大于0.8且相關(guān)性顯著的部分作為研究微生物與微量成分相關(guān)性的可視化對象；對于微生物之間的共現(xiàn)性分析，計(jì)算微生物之間的Spearman 相關(guān)系數(shù)，選取系數(shù)絕對值大于0.8且相關(guān)性顯著的部分作為可視化對象。使用Cytoscape 3.6.1軟件對酒醅微生物與微量成分的相關(guān)性和微生物之間的相互關(guān)系進(jìn)行可視化圖形繪制，分析他們之間的關(guān)系，明確微生物對微量成分的貢獻(xiàn)情況。

top20的選?。哼x取7個(gè)時(shí)間段樣品豐度排名前兩位的微生物共14個(gè)，繼續(xù)對比7個(gè)樣品豐度排名第三的微生物，選取豐度排名前6的微生物(如有相同微生物，則選取下一排名)。所有微生物豐度均是每個(gè)時(shí)間段平行樣品的平均值。top10的選取方法與top20相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物多樣性分析

利用高通量測序技術(shù)對老白干香型白酒釀造過程中的微生物進(jìn)行多樣性分析。對測序結(jié)果進(jìn)行嵌合體過濾，得到有效數(shù)據(jù)，后續(xù)所有分析將建立在有效數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行。細(xì)菌測序結(jié)果共得到1 076 932條高質(zhì)量的序列，平均每個(gè)樣本具有76 923±19 479條序；真菌測序結(jié)果共得到345 007條高質(zhì)量的序列，平均每個(gè)樣本具有24 643±14 856條序列。測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表1，所有樣本的樣品覆蓋率均大于0.998，保證了測序得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量科學(xué)可靠[17]。

對每個(gè)樣本的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行α多樣性分析，可以反映白酒釀造過程中微生物群落的豐富度和多樣性[18]。選取Chao1和Shannon兩個(gè)指數(shù)進(jìn)行分析(表1)(均一化時(shí)選取的數(shù)據(jù)量：cutoff=43 407)。Shannon指數(shù)用來估算樣品中微生物的多樣性，值越大，說明群落多樣性越高；Chao1指數(shù)是用Chao1算法估計(jì)群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)，值越大代表物種總數(shù)越多。

表1 測序數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)

通過對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs聚類和物種分類分析，根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣本在門水平(phylum)和屬水平(genus)上top10的微生物，生成微生物相對豐度柱形累加圖(圖1)，以便直觀查看各樣本在不同分類水平上，相對豐度較高的微生物及其比例。從圖1可知，細(xì)菌門主要包括Firmicutes和Proteobacteria，其中Firmicutes(50.63%～99.13%)為整個(gè)發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細(xì)菌門，Proteobacteria(34.81%)、Cyanobacteria(7.03%)、Actinobacteria(3.43%)只在0 d占據(jù)一定優(yōu)勢，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，幾乎消失，這些菌可能來自大曲，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵環(huán)境不利于它們生長，故逐漸喪失優(yōu)勢；優(yōu)勢真菌門則主要為Ascomycota(83.39%～93.78%)、Mucoromycota(3.38%～15.16%)和Basidiomycota(0.83%～11.33%)，在整個(gè)發(fā)酵過程中相對比較穩(wěn)定。在屬水平上，總共檢測到310個(gè)細(xì)菌屬和59個(gè)真菌屬，其中細(xì)菌屬Lactobacillus(13.90%～95.14%)、Pediococcus(1.08%～73.43%)、Weissella(0.20%～10.55%)和真菌屬Saccharomycopsis(20.67%～56.40%)、Issatchenkia(20.67%～49.63%)、Rhizopus(2.27%～15.26%)、Trichosporon(2.22%～11.19%)、Candida(1.83%～7.77%)、Aspergillus(3.55%～5.84%)在整個(gè)發(fā)酵過程中占據(jù)相對較大優(yōu)勢。

圖1 釀造過程中的微生物在門水平和屬水平的分布情況Fig.1 Distribution of microorganisms at phylum and genus levels during brewing

β多樣性分析是對不同樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析。首先根據(jù)所有樣本的物種注釋結(jié)果和OTUs的豐度信息，將相同分類的OTUs信息合并處理得到物種豐度信息表，同時(shí)利用OTUs之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，進(jìn)一步計(jì)算Unifrac距離(Unweighted Unifrac)[18-19]。Unifrac 距離是一種利用各樣本中微生物序列間的進(jìn)化信息計(jì)算樣本間距離，兩個(gè)以上的樣本，則得到一個(gè)距離矩陣，然后利用OTUs的豐度信息對Unifrac距離(Unweighted Unifrac)進(jìn)一步構(gòu)建Weighted Unifrac距離[20]。選用 Weighted Unifrac 距離和 Unweighted Unifrac 距離兩個(gè)指標(biāo)來繪制熱圖，以衡量兩個(gè)樣本間的相異系數(shù)，其值越小，表示這兩個(gè)樣本在物種多樣性方面存在的差異越小。β多樣性分析結(jié)果見圖2，發(fā)酵0～3 d是微生物群落變化最大的時(shí)候，尤其是細(xì)菌。酒醅在入池后開始迅速升溫，到第3天左右達(dá)到最高溫度[15]，巨大溫度變化可能是導(dǎo)致微生物群落發(fā)生變化的重要影響因素。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵溫度逐漸趨于平緩，微生物群落結(jié)構(gòu)也趨于穩(wěn)定。

同一方格中，上下兩個(gè)值分別代表Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離。圖2 β多樣性分析熱圖Fig.2 Heatmap of beta diversity

β多樣性分析(圖2)結(jié)合物種聚類分析(圖1)可知，老白干香型白酒在釀造過程中，微生物種類和數(shù)量變化呈現(xiàn)一定規(guī)律。0～3 d部分微生物豐度變化較大，0 d和3 d之間的Unifrac距離是整個(gè)發(fā)酵過程中相鄰樣本間Unifrac距離的最大值，是微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生重大變化的時(shí)期，這個(gè)階段發(fā)酵溫度迅速上升，并逐漸到達(dá)最高溫度，能夠適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境的微生物存留下來，形成逐漸穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)。3～21 d微生物豐度逐漸增大，相鄰兩樣本之間Unifrac距離較小，且變化不大，說明微生物群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，微生物開始迅速繁殖、代謝，產(chǎn)生大量風(fēng)味物質(zhì)，是影響白酒品質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。21～30 d發(fā)酵接近尾聲，部分微生物豐度減小，但相鄰兩樣本之間Unifrac距離較小，說明隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，乙醇濃度的逐漸升高，微生物生長受到抑制，但群落結(jié)構(gòu)并沒有太大變化。

2.2 微量成分檢測結(jié)果分析

監(jiān)測釀造過程中微量成分的變化情況，能夠更好地了解微生物群落變化所帶來的影響。通過HS- SPME- GC- MS技術(shù)，檢測酒醅中的微量成分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。由表2可知，酒醅中共檢測到可揮發(fā)性微量成分120種，其中包含37種酯類物質(zhì)、10種酸類物質(zhì)、10種酮類物質(zhì)、10種醛類物質(zhì)、19種醇類物質(zhì)、6種萜烯類物質(zhì)、14種碳?xì)漕惢衔铩?種酚類物質(zhì)、5種吡嗪類物質(zhì)和3種呋喃類物質(zhì)。通過半定量分析可以發(fā)現(xiàn)，酒醅中含量較多的微量成分主要為酯類物質(zhì)，其中以乙酸乙酯和乳酸乙酯為主，兩者比例大約在1∶1.2至1∶1.5，與丁云連等[3]報(bào)道的結(jié)果相近。

同時(shí)，檢測結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)了6種萜烯類物質(zhì)。萜烯類化合物是白酒中一種重要的微量風(fēng)味成分，由谷物和豆類材料發(fā)酵過程中的各種酵母菌產(chǎn)生，是自然界化合物中結(jié)構(gòu)多樣性最為豐富的物質(zhì)[21]。萜烯類化合物功能較多，包括抗菌活性、抗病毒活性、抗氧化活性、鎮(zhèn)痛活性、助消化活性和抗癌活性，等等，此次發(fā)現(xiàn)的α-石竹烯就具有抗氧化活性[22]。

對檢測到的微量成分進(jìn)行熱圖繪制，并進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，微量成分變化趨勢較為明顯，0～3 d是微量成分種類增加的一個(gè)小高峰，這可能與微生物群落結(jié)構(gòu)變化較大有關(guān)；3～14 d微量成分種類變化較小，結(jié)合酒醅中的微量成分相對含量(見表2)可以發(fā)現(xiàn)，這個(gè)階段是大部分微量成分逐漸增加的過程；14～21 d是微量成分種類變化的另一個(gè)高峰，大量酯類物質(zhì)在這一階段合成，酒醅中的微量成分進(jìn)一步豐富起來；21～30 d微量成分種類變化不大，數(shù)量持續(xù)增加，部分原料中帶來的微量成分趨于消失。

2.3 微生物核心群落與微量成分的關(guān)系

為進(jìn)一步研究微量成分與微生物之間的相關(guān)性，對兩者進(jìn)行相關(guān)性分析。通過計(jì)算微生物與微量成分之間的Spearman相關(guān)系數(shù)，繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。由圖4可知，Lactobacillus是與微量成分連接數(shù)最大的一個(gè)屬(42個(gè))，與它相關(guān)的微量成分包含了大部分的酯類、醇類和酸類，還有少量的醛類、芳香類和萜烯類。Lactobacillus屬于乳酸桿菌，對白酒風(fēng)味有較大影響，是白酒釀造過程中的核心微生物[23]。有研究表明，L.acetotolerans能夠促進(jìn)清香型白酒中酯類物質(zhì)的形成，如果在發(fā)酵過程中缺少這種菌，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵滯后，且產(chǎn)出的白酒中酯含量也較低[24]。此外，Bacillus、Fusarium、Oceanobacillus、Staphylococcus、Thelebolus和Weissella與微量成分也有很大相關(guān)性(連接數(shù)分別為30、39、32、26、32、33)。因此，由Lactobacillus、Bacillus、Fusarium、Oceanobacillus、Staphylococcus、Thelebolus和Weissella形成的微生物群對微量成分貢獻(xiàn)較大。

通過計(jì)算微生物之間的Spearman相關(guān)系數(shù)，選取系數(shù)絕對值大于0.8且相關(guān)性顯著的部分進(jìn)行微生物之間的共現(xiàn)性分析，以此探究微生物之間的相關(guān)性。微生物間的共現(xiàn)性見圖5，分析共得到28個(gè)有效節(jié)點(diǎn)和61個(gè)邊。連接數(shù)較多的菌屬包括Pediococcus、Thelebolus、Fusarium、Saccharomyces、Lactobacillus、Yamadazyma、Bacillus和Staphylococcus，主要分布在Bacillales、Saccharomycetales和Lactobacillales三個(gè)目中。結(jié)合圖4(a)所得結(jié)論，“由Lactobacillus、Bacillus、Fusarium、Oceanobacillus、Staphylococcus、Thelebolus和Weissella形成的微生物群對微量成分貢獻(xiàn)較大”，可以得出：在老白干酒釀造過程中，對微量成分具有較大貢獻(xiàn)的核心微生物群由Bacillus、Fusarium、Lactobacillus、Staphylococcus和Thelebolus組成。

表2 酒醅中的微量成分

續(xù)表2

續(xù)表2

“-”表示未檢測到該物質(zhì)；相對含量值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”。

圖3 釀造過程中微量成分變化的熱圖Fig.3 Heatmap of trace components during fermentation

節(jié)點(diǎn)大小表示此節(jié)點(diǎn)連接數(shù)的多少；實(shí)線代表極顯著，虛線代表顯著；黑線代表正相關(guān)，紅線代表負(fù)相關(guān)；連接線的粗細(xì)代表相關(guān)性的強(qiáng)弱。圖4 微生物和微量成分的相關(guān)性Fig.4 Correlation between microbial genera and trace components

已有研究表明：醬香型酒醅樣品中的細(xì)菌主要是Lactobacillus、Lactococcus、Acetobacter、Bacillus、Lysinibacillus，窖內(nèi)發(fā)酵酒醅中細(xì)菌的優(yōu)勢菌是乳桿菌屬Lactobacillus，是醬香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中最常見的重要微生物菌群[25]；濃香型酒醅中乳桿菌占據(jù)絕對優(yōu)勢，但豐度較低的梭菌綱微生物對酒醅風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)卻巨大[26]；清香型酒醅中的絕對優(yōu)勢菌為Acetobacteraceae、Lactobacillaceae、Candida和Pichiaceae[27]。結(jié)合本次研究結(jié)果可以看出，老白干香型酒醅中的核心微生物群與其他香型有較大區(qū)別，這很有可能是形成老白干香型白酒獨(dú)特風(fēng)味的重要因素。

節(jié)點(diǎn)大小表示此節(jié)點(diǎn)連接數(shù)的多少；實(shí)線代表極顯著，虛線代表顯著；黑線代表正相關(guān)，紅線代表負(fù)相關(guān)；連接線的粗細(xì)代表相關(guān)性的強(qiáng)弱。圖5 微生物之間的共現(xiàn)性Fig.5 Correlation of co-occurring microbial genera

通過提取微生物和微量成分的第一主成分進(jìn)行相關(guān)性分析，可以驗(yàn)證微生物與微量成分是否具有相關(guān)性，從而驗(yàn)證所得結(jié)論的科學(xué)性[12]。選取1.6中篩選出的豐度top20的細(xì)菌和真菌，對比7個(gè)取樣時(shí)間下這些菌的相對豐度，提取第一主成分作為微生物第一主成分；選取1.6節(jié)中篩選出的微量成分，對比7個(gè)取樣時(shí)間下這些微量成分的相對含量，提取第一主成分作為微量成分第一主成分。最后計(jì)算兩個(gè)第一主成分之間的相關(guān)性，結(jié)果如圖6。由圖6可知，微生物與微量成分具有顯著相關(guān)性(R2=0.602 1，ρ=0.797，P<0.05)，說明本次研究所得的核心微生物群對微量成分具有一定貢獻(xiàn)。

圖6 微生物第一主成分與微量成分第一主成分的相關(guān)性Fig.6 Correlation between microorganisms PC1 and trace components PC1

3 結(jié) 論

本研究通過高通量測序技術(shù)，分析了老白干香型白酒釀造過程中微生物多樣性及其演替規(guī)律，共得到310個(gè)細(xì)菌屬和59個(gè)真菌屬，其中優(yōu)勢細(xì)菌屬為Lactobacillus、Pediococcus、Weissella，優(yōu)勢真菌屬為Saccharomycopsis、Issatchenkia、Rhizopus、Trichosporon、Candida、Aspergillus。通過頂空固相微萃取- 氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測了釀造過程中微量成分的變化，共得到120種微量成分。0～3 d和14～21 d微量成分種類迅速增加，其他時(shí)間是微量成分含量逐漸增加的過程，其中21～30 d部分原料中帶來的微量成分趨于消失。最后通過分析微生物與微量成分之間的相關(guān)性以及微生物之間的相互關(guān)系，探明微生物對微量成分的貢獻(xiàn)情況。結(jié)果表明，以Lactobacillus為主，結(jié)合Bacillus、Fusarium、Staphylococcus和Thelebolus共同形成的核心微生物群對老白干香型白酒釀造過程中的微量成分具有一定貢獻(xiàn)。希望本研究能夠?yàn)檠芯坷习赘上阈桶拙频钠焚|(zhì)與釀酒微生物之間的關(guān)系提供一定的理論依據(jù)和參考。