許永亮，王佳星，李響，孫志杰，于海威，劉棟琦，張惟材，熊向華

1.遼寧大學 生命科學學院，遼寧 沈陽 1100361；2.軍事醫(yī)學研究院 生物工程研究所，北京 100071；3.沈陽師范大學 生命科學學院，遼寧 沈陽 110034；4.哈爾濱商業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150076

肉毒毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）是由肉毒梭菌芽孢桿菌（Clostridium botulinum）產(chǎn)生的，是目前已知毒性最強的細菌毒素[1]。BoNT 分為 A～G 共 7 個血清型[2]，其中已知能夠引起人類中毒的有 A、B、E 和 F 型[3]。各型毒素均由一條重鏈和一條輕鏈通過二硫鍵連接而成[4]。重鏈C 端能與特定受體結(jié)合[5]，同時也是理想的保護性抗原；重鏈N 端主要在毒素內(nèi)化過程中起作用[6]。輕鏈是肉毒毒素的毒性部分，是依賴Zn2+的肽鏈內(nèi)切酶，在重鏈的輔助下進入細胞并特異性地裂解突觸相關(guān)膜蛋白，阻斷神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放，從而造成肌肉松弛型麻痹[7]。

目前尚無有效的小分子化學藥物能治療BoNT 中毒[8]，臨床上使用的馬源血清可能存在病毒污染、過敏反應(yīng)、生產(chǎn)周期長、生產(chǎn)成本高等限制因素。單克隆抗體作為一種治療性的蛋白質(zhì)分子，已廣泛用于治療一系列危及生命的疾病[9]，目前已經(jīng)有40 多種單克隆抗體藥物被美國、日本和歐盟批準使用[10]，當前治療肉毒毒素的惟一有效手段就是中和抗體[11]。另外，在不同血清型BoNT 的防治工作中，最廣泛使用的福爾馬林滅活的五價疫苗只能針對A～E 型，不能針對F 型[12]。本研究以 F 型 BoNT（BoNT/F）重鏈 C 端（BoNT/FHc）為抗原免疫小鼠，通過雜交瘤技術(shù)篩選抗BoNT/F 抗體，成功篩選到一株高親和力的鼠源單克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性SPF 級BALB/c 小鼠（北京維通利華公司）；Sp2/0 細胞（本實驗室保存）；大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α（北京擎科生物技術(shù)有限公司）；HRP 標記的羊抗鼠IgG 二抗、DNA 膠回收試劑盒（Thermo 公司）；抗體亞型鑒定試劑盒（北京博奧龍免疫技術(shù)公司）；HiFi DNA 聚合酶（全式金生物技術(shù)有限公司）；ΜLtrapure RNA Kit 超純RNA提取試劑盒、HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit（北京康為世紀生物科技有限公司）；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇PEG1500、TMB 顯 色 液（Sigma 公 司）；DMEM、HAT、HT 培養(yǎng)基（Gibco 公司）；Hitrp Protein G HP色譜柱（GE 公司）。

1.2 小鼠免疫

取5 只BALB/c 小鼠，首次免疫時將弗氏完全佐劑與50 μg BoNT/FHc 等量混合，充分乳化后小鼠背部皮下多點注射；第21 d 進行第2 次免疫，將弗氏不完全佐劑與50 μg BoNT/FHc 等量混合并充分乳化，小鼠背部皮下多點注射；第42 d 進行第 3 次免疫，用 50 μg 抗原與 PBS 等量混合，每只小鼠腹腔注射[13]；第56 d 進行小鼠尾靜脈取血，4℃靜置1 h，4℃、3000 r/min 離心10 min后取血清，間接ELISA 測定其效價；取尾血效價最高的小鼠腹腔注射抗原200 μg 強化免疫，并于3 d 后進行細胞融合。

1.3 細胞融合

小鼠強化免疫3 d 后斷頸處死，75%乙醇消毒，無菌環(huán)境下摘取其脾臟并置于篩網(wǎng)內(nèi)，用注射器內(nèi)芯輕輕碾碎后收集脾臟細胞并活細胞計數(shù)；取生長狀態(tài)良好的Sp2/0 細胞與脾臟細胞按1∶5～1∶10 的比例混合于 50 mL 離心管內(nèi)，1000 r/min 離心8 min，棄上清，輕彈離心管底部使細胞松散；置37℃水浴中，在1 min 內(nèi)緩慢加入1 mL PEG1500，邊加邊輕輕搖動離心管，靜置90 s 后在第1 min 內(nèi)緩慢加入1 mL DMEM，第2 min 內(nèi)緩慢加入2 mL DMEM，以此類推共補加30 mL DMEM，800 r/min 離 心 6 min 后 棄 上 清 ；用 40 mL HAT 培養(yǎng)基將細胞重懸，加入鋪有飼養(yǎng)細胞的96 孔細胞板內(nèi)，每孔100 μL，轉(zhuǎn)移至37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 陽性細胞篩選及克隆化

待細胞培養(yǎng)生長至細胞96 孔板底面積的1/3～1/2 時，顯微鏡下觀察并計算細胞融合率，間接ELISA 測定融合細胞陽性率。陽性細胞經(jīng)傳代和擴大培養(yǎng)后，利用有限稀釋法對其進行克隆化。

1.5 抗體制備

選取 8～10 周齡雌性 BALB/c 小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 mL 弗氏不完全佐劑；7 d 后腹腔接種能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞0.5×106～1×106/只，同時注射同樣數(shù)量的小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0作為陰性對照；10 d 后收集腹水，SDS-PAGE 鑒定腹水中抗體的表達。

1.6 抗體純化

將收集的腹水8000 r/min 離心10 min，小心去除油脂和血細胞沉淀，將腹水與Protein G 株結(jié)合緩沖液等比例混合，用Protein G 柱進行親和層析純化，SDS-PAGE 后采用Gel-pro32 軟件分析純化抗體的純度，Lowrry 蛋白濃度測定試劑盒測定純化抗體蛋白濃度。

1.7 抗體親和力測定

采用非競爭ELISA 測定抗體的親和力常數(shù)。測 定 4 個 濃 度 的 抗 原 BoNT/FHc（5、2.5、1.25、0.625 μg/mL）與梯度稀釋為12 個濃度的抗體（500、250、125、62.5、……、0.244 μg/mL）的結(jié)合反應(yīng)曲線，按文獻報道的公式計算抗體親和力[14]。

1.8 抗體亞型鑒定

采用抗體亞型鑒定試劑盒，以BoNT/FHc 為抗原包板，雜交瘤細胞培養(yǎng)上清為一抗，分別以HRP 標記的抗 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM 以及κ、λ鏈抗體為二抗，利用間接ELISA 測定抗體輕重鏈亞型。

1.9 抗體可變區(qū)基因調(diào)取與氨基酸序列分析

采用RNA 提取試劑盒提取雜交瘤的RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，利用通用引物擴增雜交瘤細胞株對應(yīng)的抗體輕重鏈基因可變區(qū)，瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，與pMD-18T 載體在連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂LB（含氨芐青霉素）平板，37℃溫箱培養(yǎng)過夜，次日從平板上挑取單克隆至LB（含氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后測序，測序結(jié)果經(jīng)IgBLAST 比對分析抗體輕重鏈可變區(qū)核苷酸序列，再經(jīng)Vbase軟件分析抗體輕重鏈可變區(qū)氨基酸序列。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠尾血效價測定

BALB/c 小鼠經(jīng) BoNT/FHc 抗原 3 次免疫后，取尾血測效價，結(jié)果如圖1，5 只小鼠尾血效價均達到1∶16 000。其中2 號小鼠尾血效價最高（1∶32 000），因此選用2 號鼠進行后續(xù)細胞融合。

2.2 細胞融合與穩(wěn)定細胞株篩選

取2 號小鼠脾細胞與Sp2/0 骨髓瘤細胞進行細胞融合，2 周后鏡檢計算細胞融合率為74.48%（表1）。ELISA 篩選陽性細胞株，得到33 株陽性細胞，計算細胞陽性率為11.54%（表1）。33 株陽性細胞株經(jīng)傳代和擴大培養(yǎng)后，ELISA 再次篩選，有12 株保持陽性，這12 株陽性細胞再經(jīng)過2 次亞克隆，最終得到7 株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的陽性細胞株。選取其中細胞培養(yǎng)上清效價最高的1F4 雜交瘤細胞進行后續(xù)抗體制備實驗。

2.3 抗體制備

圖1 小鼠尾血效價測定

表1 雜交瘤細胞融合率和陽性率

在小鼠腹腔注射1F4 陽性雜交瘤細胞，2 周后抽取小鼠腹水并檢測腹水中1F4 抗體的表達情況。SDS-PAGE 結(jié)果（圖2A）表明，與 Sp2/0 細胞腹水（陰性對照）相比，1F4 雜交瘤細胞腹水在相對分子質(zhì)量 50×103和 25×103處有特異性表達條帶，與抗體重鏈和輕鏈分子大小相符。

2.4 抗體純化

小鼠腹水經(jīng)Protein G 柱親和層析純化后，SDS-PAGE 結(jié)果（圖2B）顯示 10 和 5 μL 均無其他雜帶，Gel-pro32 軟件分析表明純化的1F4 抗體純度大于95%。用Lowrry 蛋白濃度測定試劑盒測定純化后的1F4 抗體濃度為2 mg/mL。純化的1F4抗體按1 mg/瓶分裝后凍干，-20℃低溫保存。

2.5 抗體親和力測定

通過間接ELISA 建立4 個濃度的BoNT/FHc 抗原與12 個濃度的1F4 抗體的結(jié)合反應(yīng)曲線（圖3），按文獻報道的公式[14]計算，1F4 抗體與 BoNT/FHc 抗原的親和力常數(shù)為1.08×10-8mol/L，達到納摩爾每升的水平，表明抗體與抗原有很強的結(jié)合能力。

2.6 抗體亞型鑒定

采用抗體分型試劑盒，取陽性雜交瘤細胞株1F4 培養(yǎng)上清進行ELISA 測定，結(jié)果表明1F4 抗體重鏈為IgG1 型，輕鏈為κ型，均為最常見的亞型（圖4）。

圖2 SDS-PAGE 檢測小鼠腹水中的抗體表達（A）和1F4 抗體純度（B）

圖3 間接ELISA 測定1F4 抗體-BoNT/FHc 抗原的親和力常數(shù)

2.7 抗體可變區(qū)基因調(diào)取與氨基酸序列分析

提取1F4 細胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后通過特異性引物擴增出抗體輕重鏈可變區(qū)，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示擴增目的片段均為420 bp 左右，與預期的抗體輕重鏈可變區(qū)大小相符（圖5）。擴增的目的片段連入T 載體后測序，測序結(jié)果經(jīng)IgBLAST 比對分析后提取出抗體輕重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，再經(jīng)Vbase 軟件分析抗體輕重鏈可變區(qū)基因同源性與氨基酸序列?？贵w可變區(qū)由FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 組成，Vbase 軟件分析了各框架區(qū)（FR）和互補決定區(qū)（CDR）長度（氨基酸殘基數(shù)量）；而且抗體CDR3 是與抗原結(jié)合最重要的區(qū)域，其氨基酸序列在3 個CDR 中多樣性最顯著，所以重點分析了CDR3 的氨基酸序列。結(jié)果見表2，抗體輕鏈可變區(qū)基因與小鼠IGκV3-12*01 序列的同源性為98.2%，輕鏈可變區(qū)蛋白的 4 個 FR（FR1、FR2、FR3、FR4）長度分別為26、17、36、10 個氨基酸殘基，夾在 4 個 FR 之間的3 個 CDR（CDR、CDR2、CDR3）長度分別為 6、3、9個氨基酸殘基，其中CDR3 氨基酸序列為QQHYSTPWT；抗體重鏈可變區(qū)基因與小鼠IGHV1-5*01 序列的同源性為96.9%，重鏈可變區(qū)蛋白的 4 個 FR（FR1、FR2、FR3、FR4）長度分別為25、17、38、11 個氨基酸殘基，3 個 CDR（CDR1、CDR2、CDR3）長度分別為 8、8、12 個氨基酸殘基，其中CDR3 氨基酸序列為TRHGYFPSWFAY。

圖4 間接ELISA 鑒定1F4 抗體亞型

圖5 瓊脂糖凝膠電泳鑒定1F4 抗體可變區(qū)基因

表2 1F4 抗體輕重鏈可變區(qū)基因同源性與氨基酸序列分析

3 討論

雜交瘤技術(shù)自問世以來在醫(yī)學和生命科學研究中得到了廣泛應(yīng)用[15]。小鼠骨髓瘤細胞能在體內(nèi)外無限增殖和分泌無抗體活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾細胞具有產(chǎn)生抗體的能力，但不能無限增殖，通過融合劑聚乙二醇等將這2 種細胞融合成雜交瘤細胞，可以產(chǎn)生能夠永生、快速增殖并能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細胞株。這種由單克隆細胞繁殖后分泌的抗體具有特異性強、純度高、可大規(guī)模工廠化生產(chǎn)等優(yōu)點，所以本研究我們選用了雜交瘤技術(shù)來篩選BoNT/F 的單克隆抗體。

我們用BoNT/FHc 免疫BALB/c 小鼠，小鼠尾血效價均高于1∶16 000，為雜交瘤細胞融合提供了良好的免疫細胞。通過細胞融合和克隆化，最終篩選到7 株能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，選取其中的1F4 通過小鼠腹水制備抗體，純化的1F4 抗體與BoNT/FHc 抗原的親和力常數(shù)達到納摩爾每升水平。以上結(jié)果進一步說明雜交瘤技術(shù)是篩選高親和力單克隆抗體的有效手段，并為BoNT/F 檢測和中和抗體研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。