孫衛(wèi)國，張靈霞，史閱韓，翟斐，孫雯娜，侯江厚

1.解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心 結(jié)核病研究所，全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2.昆明市婦幼保健院，云南 昆明 560013

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一類結(jié)構(gòu)中含有鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分，包括基膜膠原質(zhì)、間質(zhì)膠原蛋白、纖維蛋白和各種蛋白聚糖[1]，在誘導(dǎo)腫瘤血管生成，細(xì)胞遷移、增殖、凋亡和結(jié)締組織退化中發(fā)揮核心作用。MMP-12 是MMP 中的重要成員，又稱為人巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶，由活化的炎癥巨噬細(xì)胞分泌，與許多疾病的病理過程關(guān)系密切。MMP-12 與直腸癌疾病進(jìn)展和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)；在皮膚基底細(xì)胞和鱗狀細(xì)胞癌組織中，MMP-12的mRNA 表達(dá)水平明顯比癌前病變高，且參與腫瘤分化和侵襲；在肝切除術(shù)后肝癌患者中，MMP-12 成為總生存率和腫瘤復(fù)發(fā)的一個(gè)可靠的預(yù)后標(biāo)志物[2]。MMP-12 與肺部疾病密切相關(guān)，在肺鱗癌中MMP-12 過度表達(dá)，明顯高于肺腺癌[3-4]。MMP-12 可促進(jìn)病毒、細(xì)菌的侵入及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，促進(jìn)一些急性和慢性肺部疾病如過敏性哮喘、肺氣腫、肺癌和肺部感染等的宿主免疫反應(yīng)和發(fā)病機(jī)制，是肺部疾病活動(dòng)的標(biāo)志[5]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，耐藥性結(jié)核病患者相對(duì)于藥敏患者而言，由于長(zhǎng)期服用抗結(jié)核藥，造成肺部損傷，MMP-12 特異性表達(dá)上調(diào)，因此我們認(rèn)為特異性抑制MMP-12 的功能將有可能減輕肺部組織損傷。MMP-12 自 N 端至 C 端依次有 3 個(gè)功能區(qū)，即前肽區(qū)、催化區(qū)和血紅素結(jié)合蛋白區(qū)域，催化區(qū)行使該蛋白的酶學(xué)功能。我們通過原核表達(dá)并采用腸激酶酶切和二次純化的方法獲得了高純度的MMP-12 蛋白，包含其催化區(qū)和血紅素結(jié)合蛋白區(qū)域，全長(zhǎng)365 個(gè)氨基酸殘基，擬以此為靶標(biāo)進(jìn)行MMP-12 特異性抗體和抑制劑篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Rosetta（DE3）及其感受態(tài)細(xì)胞、原核表達(dá)載體pET-24a 由本室制作保存；全基因由華大基因公司合成，PCR、質(zhì)粒提取、核酸回收等常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶購自NEB 公司；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量marker 購自Sigma 公司；重組腸激酶由本室表達(dá)純化；Ni-Sep?harose Chelating Sepharose Fast Flow 親和樹脂填料購自GE 公司，本室裝填純化柱；LB 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液配制試劑等其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 全基因合成

參照NCBI Pubmed 登錄號(hào)NP002417.2，選定MMP-12 蛋白的氨基酸序列為 Gly106～Cys470，N端加入6×His 標(biāo)簽和腸激酶序列DDDDK。融合蛋白對(duì)應(yīng)的核酸序列按照利于原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的原則進(jìn)行優(yōu)化和全基因合成，合成編號(hào)為WHC195480，同時(shí)3′端加入大腸桿菌終止密碼子taa，5′端和3′端分別引入限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)序列。

1.3 pET-MMP-12表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ對(duì)全基因合成的克隆載體pMV-MMP-12 以及表達(dá)載體pET-24a 分別進(jìn)行雙酶切，回收酶切后的MMP-12 核酸片段和pET-24a，與T4DNA 連接酶按摩爾比3∶1混合后于16℃連接過夜，取5 μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Rosetta（DE3），次日挑選10 個(gè)克隆轉(zhuǎn)接 5 mL 含 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)3 h，加入IPTG 至終濃度為0.2 mmol/L，37℃振蕩誘導(dǎo)5 h，12% SDS-PAGE 分析各菌落的表達(dá)情況，選擇表達(dá)量高的菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定，獲得表達(dá)工程菌株。

1.4 重組MMP-12融合蛋白的原核表達(dá)與純化

取陽性工程菌株于37℃振蕩培養(yǎng)8 h 進(jìn)行活化，隔日按 1∶50 的比例轉(zhuǎn)接至含 50 μg/mL 卡那霉素的2 L LB 培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液D600nm值約為0.4 時(shí)加入IPTG 使其終濃度為0.2 mmol/L，37℃振蕩誘導(dǎo)7 h；菌液離心，對(duì)沉淀的菌體進(jìn)行冰浴，4℃條件下超聲波破碎，取上清和沉淀加入變性上樣緩沖液，SDS-PAGE 分析重組蛋白的表達(dá)形式。超聲沉淀以1%的Triton X-100 充分洗滌2 次，洗滌后的沉淀用6 mol/L 尿素+PBS 溶液充分溶解，12 000 r/min 離心30 min，上清以1 mL/min 的速度結(jié)合鎳離子螯合的親和層析柱，PBS 緩沖液緩慢平衡層析柱5 個(gè)柱積，用30 mmol/L 咪唑除去菌體自身雜蛋白，150 mmol/L 咪唑洗脫收集目的蛋白，150 mmol/L 咪唑+6 mol/L尿素洗脫未復(fù)性蛋白，12% SDS-PAGE 分析重組蛋白的純度。純化的MMP-12 融合蛋白水透析后，冰凍保存。

1.5 重組MMP-12融合蛋白的腸激酶酶切

取純化的MMP-12 重組蛋白用PBS 稀釋至1 mg/mL，按1∶3000 加入重組腸激酶充分混勻，分別于4℃和25℃條件下進(jìn)行酶切。每8 h 取酶切后的樣品加入上樣緩沖液，煮沸10 min，SDSPAGE 分析酶切效率，選取最佳酶切條件。優(yōu)化最佳酶切條件后，取20 mg MMP-12 融合蛋白于4℃酶切過夜備用。

1.6 重組MMP-12蛋白的二次純化

融合蛋白酶切后，N 端切除部分帶有6×His 標(biāo)簽，同時(shí)所用腸激酶也帶有6×His 標(biāo)簽，因此采用鎳離子螯合的親和層析方法對(duì)酶切后的蛋白混合液進(jìn)行分離提純。取酶切后的MMP-12 融合蛋白混合液，以1 mL/min 的速度重復(fù)結(jié)合鎳離子螯合的親和層析柱2 次，小心收集穿過液，用PBS 緩沖液緩慢平衡層析柱2 個(gè)柱積，用150 mmol/L 咪唑進(jìn)行洗脫，純化后的MMP-12 蛋白用HPLC 進(jìn)行純度測(cè)定，充分水透析后，凍干保存。

2 結(jié)果

2.1 全基因合成

選定MMP-12 蛋白催化區(qū)和血紅素結(jié)合區(qū)Gly106～Cys470 氨基酸序列進(jìn)行原核重組表達(dá)，同時(shí)在該肽段的N 端加入6×His 標(biāo)簽和腸激酶序列DDDDK。合成的序列全長(zhǎng)376 個(gè)氨基酸殘基，按照利于原核系統(tǒng)表達(dá)的原則進(jìn)行核酸序列優(yōu)化，進(jìn)行全基因合成，氨基酸序列如下：

HHHHHHDDDDKGPVWRKHYITYRINNYTPDMNREDVDYAIRKAF QVWSNVTPLKFSKINTGMADILVVFARGAHGDFHAFDGKGGILA HAFGPGSGIGGDAHFDEDEFWTTHSGGTNLFLTAVHEIGHSLGL GHSSDPKAVMFPTYKYVDINTFRLSADDIRGIQSLYGDPKENQR LPNPDNSEPALCDPNLSFDAVTTVGNKIFFFKDRFFWLKVSERP KTSVNLISSLWPTLPSGIEAAYEIEARNQVFLFKDDKYWLISNL RPEPNYPKSIHSFGFPNFVKKIDAAVFNPRFYRTYFFVDNQYWR YDERRQMMDPGYPKLITKNFQGIGPKIDAVFYSKNKYYYFFQGS NQFEYDFLLQRITKTLKSNSWFGC

2.2 MMP-12原核表達(dá)載體的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

將合成的全核酸表達(dá)序列克隆構(gòu)建表達(dá)載體 pET-MMP-12，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Rosetta（DE3），次日挑選10 個(gè)克隆進(jìn)行常規(guī)誘導(dǎo)表達(dá)，12% SDSPAGE 分析各菌落表達(dá)情況，選擇表達(dá)量高的菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定。結(jié)果如圖1，在獲得的10 個(gè)克隆中，9 個(gè)菌株有外源蛋白重組表達(dá)。對(duì)測(cè)序正確的菌株加入20%甘油混勻后超低溫保存，獲得表達(dá)工程菌株pET-MMP-12。

2.3 MMP-12融合蛋白的原核表達(dá)與純化

取陽性工程菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，優(yōu)化誘導(dǎo)溫度、時(shí)間和IPTG 濃度。取誘導(dǎo)后的工程菌高速離心，收集沉淀后在冰水混合條件下超聲波破碎，取上清和沉淀煮沸10 min，SDS-PAGE 分析重組蛋白的表達(dá)形式。結(jié)果如圖2，重組蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白40%以上，相對(duì)分子質(zhì)量為42×103，和預(yù)期一致，但幾乎都以包涵體形式存在，高表達(dá)量為后期的復(fù)性純化提供了保證。

圖1 MMP-12 表達(dá)菌株的表達(dá)篩選電泳分析

圖2 MMP-12 原核表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)形式分析

超聲沉淀用1%的Triton X-100 洗滌除去脂類物質(zhì)，然后用6 mol/L 尿素+PBS 充分溶解，上清以緩慢速度流經(jīng)鎳離子螯合的親和層析柱，再用PBS 緩沖液緩慢平衡層析柱5 個(gè)柱積，進(jìn)行緩慢柱上復(fù)性。分別用150 mmol/L 咪唑洗脫收集目的蛋白，150 mmol/L 咪唑+6 mol/L 尿素洗脫梯度未復(fù)性蛋白。12% SDS-PAGE 結(jié)果顯示（圖3），經(jīng)過柱上復(fù)性后，MMP-12 包涵體復(fù)性率將近50%，親和純化后，復(fù)性后的MMP-12 融合蛋白純度在95%以上。

2.4 MMP-12融合蛋白的腸激酶酶切條件優(yōu)化

MMP-12 融合蛋白的N 端帶有腸激酶位點(diǎn)DDDDK，將腸激酶與重組蛋白按1∶3000 充分混合，分別于4℃和25℃條件下酶切。分別取8 h 間隔樣品進(jìn)行SDS-PAGE 分析，結(jié)果見圖4，腸激酶對(duì)MMP-12 重組蛋白具有較高的酶切效率，4℃條件下，8 h 內(nèi)幾乎完全酶切。

圖3 MMP-12 融合蛋白的復(fù)性與純化電泳分析

2.5 重組MMP-12蛋白的二次純化

采用鎳離子螯合的親和層析方法對(duì)酶切后的蛋白混合液進(jìn)行分離提純。將酶切后MMP-12融合蛋白混合液以緩慢的速度重復(fù)結(jié)合鎳離子螯合的親和層析柱，收集穿過液進(jìn)行12%的SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)純化后的MMP-12 相對(duì)分子質(zhì)量為40.8×103，符合預(yù)期，考馬斯亮藍(lán)染色純度在95%以上（圖5）。對(duì)純化后的MMP-12 蛋白用HPLC 進(jìn)行純度測(cè)定，純度為97%（圖6）。

3 討論

圖4 MMP-12 融合蛋白的腸激酶酶切電泳分析

圖5 MMP-12 蛋白二次親和純化的電泳分析

圖6 純化后MMP-12 蛋白的HPLC 純度測(cè)定圖

MMP-12 作為彈性蛋白的降解者，是慢性阻塞性肺疾?。–OPD）形成過程中的重要損傷性因子，導(dǎo)致肺泡壁的破壞并導(dǎo)致肺氣腫發(fā)展，可作為減緩肺氣腫進(jìn)展的潛在靶點(diǎn)[6]。MMP-12 特異性抑制物基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）能選擇性抑制蛋白酶活性，減輕肺組織的損傷，可能為抗感染治療提供新途徑[7]。目前國內(nèi)外有關(guān)MMP-12 的研究報(bào)道較少，MMP-12 的功能、調(diào)節(jié)及致病機(jī)制等尚不完全明確。對(duì)MMP-12 及其抑制劑更多的科學(xué)性研究，可以為腫瘤、肺部疾病以及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病提供新的診斷和治療方向，因而具有重大的臨床意義。MMP-12 沒有特異性強(qiáng)的抑制劑，這就需要通過體外篩選或分子模擬方法去獲得其化合物抑制劑或生物抑制劑，普遍存在的缺陷是獲得的MMP-12 抑制劑效價(jià)偏低，缺少系統(tǒng)的虛擬篩選方法。我所在研究中也發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期用藥導(dǎo)致的肺損傷中，MMP-12 呈特異性高表達(dá)，通過體外獲得MMP-12 治療性抗體或生物抑制劑，有望限制MMP-12 活性，達(dá)到抑制肺損傷的作用，而獲得高純度的MMP-12 蛋白是后期實(shí)驗(yàn)成功的前提。目前通過原核重組獲得高表達(dá)和易純化的重組蛋白，大都采用融合表達(dá)和親和標(biāo)簽的方法，其弊端是引入了冗余氨基酸序列，影響后期篩選獲得抑制分子的特異性。我們?cè)诒狙芯恐校捎媚c激酶酶切的方法通過二次純化獲得高純度的MMP-12 蛋白，剔除了冗余氨基酸短肽，獲得了純度97%以上的目的蛋白，方法可靠、穩(wěn)定。本方法的建立，為大規(guī)模獲得高純度重組蛋白奠定了基礎(chǔ)，也為隨后開展以MMP-12 為靶標(biāo)的相關(guān)抑制劑篩選以及更深層次的MMP-12 相關(guān)機(jī)制研究提供了可靠保證。