郭佳，落繼先

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）是最早發(fā)現(xiàn)的一類多功能細(xì)胞因子，在胚胎發(fā)育、血管生成、免疫調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、組織修復(fù)與器官纖維化，以及細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理病理過(guò)程中具有重要作用[1]。TGF-β分為很多種，其中最受關(guān)注的是TGF-β1。TGF-β1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，例如口腔鱗癌、乳腺癌和膀胱癌等[2]。TGF-β1 通常以自分泌或旁分泌的方式作用于細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesen?chymal transition，EMT）。TGF-β1 通路與 EMT 進(jìn)程密不可分[3]，因此 TGF-β1 常常作為 EMT 發(fā)生的陽(yáng)性對(duì)照物[4]。

EMT 是指上皮細(xì)胞失去特性獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的一種現(xiàn)象。EMT 分為3 類：Ⅰ型EMT 與胚胎發(fā)育進(jìn)程有關(guān)；Ⅱ型EMT 與創(chuàng)傷愈合、組織再生和器官纖維化的過(guò)程有關(guān)；Ⅲ型EMT 發(fā)生在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中[5]。Ⅰ、Ⅲ型EMT 較為相似，都是形成新的上皮細(xì)胞，而Ⅱ型EMT 則發(fā)生組織和器官纖維化。盡管EMT 類型各異，但都具有相同的生化背景，所以在生物學(xué)標(biāo)志物和研究方法上有許多共通之處。

EMT 的標(biāo)志性變化包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)和基因的表達(dá)量[6]。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變包括具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成具有活動(dòng)能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞[7]；在EMT 過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去原有的細(xì)胞形態(tài)和特征，變成類似間質(zhì)細(xì)胞的紡錘形[8]?；虮磉_(dá)量的改變包括：①α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)量增加。α-SMA 是肌成纖維細(xì)胞的重要組成蛋白，能夠控制收縮肌細(xì)胞特異性運(yùn)動(dòng)，其含量間接反映肌成纖維細(xì)胞的增殖、活化狀態(tài)和纖維化程度[9]；②β連環(huán)素（βcatenin）逐漸由細(xì)胞質(zhì)更多地進(jìn)入細(xì)胞核。βcatenin 具有雙重調(diào)節(jié)功能，并且能夠獨(dú)立發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，一是作為一種重要的細(xì)胞間黏附分子和細(xì)胞骨架成分，與E-鈣黏蛋白（E-cadherin）結(jié)合形成復(fù)合體均勻分布在細(xì)胞膜上，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附；二是參與Wnt 經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]；③鋅指轉(zhuǎn)錄因子1（SNAI1）表達(dá)量增加。SNAI1 具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT 和腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的作用，SNAI1 表達(dá)量升高會(huì)下調(diào)E-cadherin 的表達(dá)量，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[11]；④E-cadherin 表達(dá)量減少。E-cad?herin 是上皮細(xì)胞間黏附分子，E-cadherin 表達(dá)量減少，會(huì)減弱上皮細(xì)胞間的相互作用[12]。

在本研究中，我們采用TGF-β1 刺激人肺支氣管上皮細(xì)胞（human bronchial epithelial cells，HBEC），觀察細(xì)胞形態(tài)和檢測(cè)EMT 標(biāo)志基因mRNA 的表達(dá)量，研究 TGF-β1 對(duì) HBEC 的影響。關(guān)于EMT 已有一些研究，加深對(duì)EMT 相關(guān)調(diào)控因子的探討，不僅有助于更好地理解EMT 的發(fā)生，而且為了解腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)機(jī)制提供了新思路，同時(shí)以EMT 為靶點(diǎn)的抗腫瘤新型藥物的研發(fā)也將是一個(gè)新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

HBEC 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素、鏈霉素）的DMEM 高糖培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco 公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；TGF-β1 購(gòu)自 PeproTech 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ購(gòu)于TaKaRa 公司；TRIzol 購(gòu)于 Invitrogen 公司；DAPI 和FITC-鬼筆環(huán)肽購(gòu)于索萊寶公司。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

將HBEC 消化離心后制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，加入DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，直至細(xì)胞貼壁均勻生長(zhǎng)至70%左右，加入約2 mL DMEM高糖培養(yǎng)基（無(wú)血清），過(guò)夜饑餓細(xì)胞16 h 后加入TGF-β1（10 ng/mL），每天固定時(shí)間換液（含 10 ng/mL TGF-β1 的完全培養(yǎng)基）。培養(yǎng)0、1、2、3、4和5 d 時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.3 免疫熒光技術(shù)

實(shí)驗(yàn)組用10 ng/mL TGF-β1 處理HBEC 4 d（對(duì)照組用PBS，其余條件完全一致），然后將2 組細(xì)胞鋪板，PBS 洗滌2 次；4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS 洗滌 3 次，每次 10 min；用 1% Triton-100 室溫下透化 15 min；加入 200 μL FITC-鬼筆環(huán)肽（5 μg/mL），覆蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育 30 min，PBS 洗滌玻片 3 次，每次 5 min；用 200 μL DAPI 溶液（100 nmol/L）對(duì)細(xì)胞核染色5 min，PBS 洗滌蓋玻片，滴加封片劑封片；于顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

從 NCBI 數(shù) 據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取人SNAI1、E-cadherin、α-SMA和β-catenin的基因轉(zhuǎn)錄本，利用Primer 5 設(shè)計(jì)特異性引物（引物序列見(jiàn)表1）。將引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證后用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。

用TRIzol 提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)EMT 標(biāo)志基因的mRNA 表達(dá)量。15 μL 反應(yīng)體系包括SYBR green Premix Ex TaqⅡ 7.5 μL，滅菌雙蒸水 3.45 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.3 μL，上、下游引物各 0.375 μL（10 μmol/L），cDNA 3 μL?？瞻讓?duì)照組模板為滅菌的雙蒸水。反應(yīng)程序?yàn)?50℃ 2 min、95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，記錄擴(kuò)增曲線、熔解曲線及樣本的循環(huán)閾值（Ct），以GAPDH為內(nèi)參基因，通過(guò) 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[13]。每個(gè)樣品同時(shí)設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理

運(yùn)用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±SD表示，采用 ANOVA 單因素方差分析檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間差異的顯著性，2組組間比較采用t檢驗(yàn)，*P＜0.05 表示差異顯著，**P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1可以誘導(dǎo)HBEC發(fā)生類似EMT的形態(tài)改變

HBEC 經(jīng) 10 ng/mL TGF-β1 處理 0、1、2、3、4和5 d 后，用相差光學(xué)顯微鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1。TGF-β1 刺激 2 d 時(shí)就可以誘使 HBEC 發(fā)生類似EMT 的形態(tài)改變，3、4 和 5 d 處理組尤為明顯。HBEC 空白對(duì)照組呈經(jīng)典的鵝卵石上皮細(xì)胞形態(tài)，但是經(jīng)過(guò)TGF-β1 處理后，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)榧忓N形，更多地呈現(xiàn)間質(zhì)纖維細(xì)胞形態(tài)（類似EMT 形變細(xì)胞已用紅色箭頭標(biāo)出）。

表1 引物及序列

圖1 TGF-β1 誘導(dǎo) HBEC 形態(tài)變化

2.2 TGF-β1引起細(xì)胞骨架發(fā)生改變

實(shí)驗(yàn)組用10 ng/mL TGF-β1 處理HBEC 4 d（對(duì)照組用PBS，其余實(shí)驗(yàn)條件完全一致），在顯微鏡下觀察HBEC 骨架，結(jié)果如圖2。與對(duì)照組相比，TGF-β1 處理HBEC 4 d 時(shí)細(xì)胞骨架發(fā)生明顯改變，逐漸變?yōu)榧忓N形（紅色箭頭）。

2.3 TGF-β1對(duì)HBEC中EMT標(biāo)志基因mRNA表達(dá)量的影響

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)TGF-β1 處理細(xì)胞 0、1、3 和 6 h 的 mRNA 表達(dá)量。如圖3 所示，與對(duì)照組相比，SNAI1在 3 h、E-cadherin在 6 h 的mRNA 表達(dá)量顯著升高，α-SMA和β-catenin在各時(shí)間點(diǎn)mRNA 表達(dá)量都顯著下降。

圖2 TGF-β1 誘導(dǎo)細(xì)胞骨架變化

圖3 TGF-β1 處理 HBEC 0～6 h EMT 標(biāo)志基因 mRNA 的表達(dá)量

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)TGF-β1 處理細(xì)胞 0、1、2、3、4 和 5 d 的 mRNA 表達(dá)量。如圖4 所示，與對(duì)照組相比，SNAI1在 1 d 時(shí)的 mRNA 表達(dá)量極顯著上升，而后各時(shí)間點(diǎn)的mRNA 表達(dá)量都呈現(xiàn)不同程度的下降，2、4 和 5 d 的 mRNA 表達(dá)量顯著下降；α-SMA在 1 d 時(shí)的 mRNA 表達(dá)量極顯著上升，而后各時(shí)間都呈現(xiàn)不同程度的下降，3 和4 d 的 mRNA 表達(dá)量顯著下降；E-cadherin在 2、3和 5 d 的 mRNA 表達(dá)量都顯著下降；β-catenin的mRNA 表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著變化。

3 討論

本研究所用細(xì)胞為人正常支氣管上皮細(xì)胞，其發(fā)生EMT 為Ⅱ型EMT-組織纖維化。免疫熒光及形態(tài)學(xué)觀察證實(shí)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，與對(duì)照組相比，10 ng/mL TGF-β1 處理組細(xì)胞伸展?fàn)顟B(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)榧忓N形，從這種意義上來(lái)說(shuō)，由TGF-β1 誘導(dǎo)的HBEC 發(fā)生的EMT屬于Ⅱ型EMT。細(xì)胞從接收刺激到做出反應(yīng)需要一定的時(shí)間。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TGF-β1刺激HBEC 后，轉(zhuǎn)錄因子SNAI1 分別在3 h 和1 d做出了響應(yīng)（圖3C 和圖4C）。SNAI1在 3 h 時(shí)mRNA 水平的上調(diào)，可能與SNAI1 所調(diào)控應(yīng)激性基因的表達(dá)有關(guān)；TGF-β1 刺激細(xì)胞 1 d 時(shí)，SNAI1的mRNA 表達(dá)量增加到對(duì)照組的2.5 倍左右（圖4C）。這提示我們，由SNAI1 調(diào)控的靶基因可能會(huì)隨之升高或降低其表達(dá)量。SNAI1 通過(guò)結(jié)合E-box 抑 制 E-cadherin 的 轉(zhuǎn) 錄[14]。 結(jié) 果 表 明 ，E-cadherin的 mRNA 表達(dá)量在 TGF-β1 處理細(xì)胞 2、3和5 d 時(shí)均顯著下降，雖然在TGF-β1 刺激4 d時(shí)，較對(duì)照沒(méi)有顯著差異（圖4D）。

圖4 TGF-β1 處理 HBEC 0～5 d EMT 標(biāo)志基因 mRNA 的表達(dá)量

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1 刺激6 h 內(nèi)，α-SMA和β-catenin的 mRNA 表達(dá)量均顯著降低（圖3A 和圖3B），E-cadherin的 mRNA 表達(dá)量在 6 h 時(shí)顯著升高（圖3D）。這似乎與EMT 的發(fā)生需要一定的時(shí)間有關(guān)。在本研究TGF-β1 刺激0～5 d 的時(shí)間范圍內(nèi)，SNAI1和α-SMA的 mRNA 表達(dá)水平先升高后下降（圖4C 和圖4A），E-cadherin的mRNA 表達(dá)量在 2、3 和 5 d 都顯著下降（圖4D），標(biāo)志著EMT 的發(fā)生；在4 d 時(shí)無(wú)差異，原因可能是發(fā)生刺激后首先響應(yīng)應(yīng)答，而后隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，正常細(xì)胞具有一定的自我調(diào)節(jié)修復(fù)能力，通過(guò)自我調(diào)節(jié)修復(fù)能力回到正常表達(dá)水平。而β-catenin的mRNA 表達(dá)量并未發(fā)生改變（圖4B），推測(cè)是β-catenin 在細(xì)胞中表達(dá)位置發(fā)生改變，由細(xì)胞質(zhì)更多地進(jìn)入細(xì)胞核，總含量不變。

EMT 在腫瘤診斷、分期和治療中都有著重要作用。加深對(duì)EMT 相關(guān)調(diào)控因子的研究，不僅有助于更好地理解EMT 發(fā)生的機(jī)制，而且為了解腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了新的思路，以EMT 為靶點(diǎn)的抗腫瘤新型藥物的研發(fā)也將是一個(gè)新的研究方向[15]。因此，深入探討EMT 相關(guān)調(diào)控因子，可為腫瘤治療提供新的線索，即通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞EMT 進(jìn)程而降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性，可作為腫瘤常規(guī)療法的補(bǔ)充，進(jìn)而成為一種新的個(gè)性化腫瘤治療方法。