牛春艷，楊佳怡，王 晶，李 晶，劉文軍

（1.中國計量科學(xué)研究院，北京 100029；2.中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又稱豬藍耳病，是近年來造成養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)嚴重經(jīng)濟損失的高度傳染性疾病[1]，最初在1980年左右于北美及歐洲被報道[2]。該疾病的病原體豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）為單股正鏈RNA病毒，隸屬套式病毒目動脈炎病毒科動脈炎病毒屬。根據(jù)血清學(xué)和遺傳特性的差異，PRRSV可分為2個型，即歐洲型（LV株為代表株）和美洲型（VR2332株為代表株）[3-4]。我國分離得到的毒株多為美洲型。2006年，我國多地區(qū)出現(xiàn)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV）[5-6]，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失?；蚪M測序結(jié)果顯示，相比于典型豬繁殖與呼吸綜合征病毒，HP-PRRSV（變異株）在病毒GP5及Nsp2蛋白區(qū)域存在氨基酸突變及缺失[7]。

PRRSV的檢測方法最初為病毒培養(yǎng)法，但是此方法耗時長且診斷敏感性低[8]。近年來發(fā)展的巢式PCR、實時熒光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）[9-10]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)等方法極大縮短了檢測時間，提高了檢測敏感性。但是，qPCR對樣本的定量分析依賴于標準曲線。數(shù)字PCR方法是最近發(fā)展起來的不依賴于外標對核酸分子進行定量的技術(shù)。由于數(shù)字PCR具有更高的靈敏度和準確性，已在微量核酸樣本檢測、稀有突變檢測等方面有廣闊應(yīng)用前景，并受到越來越多的關(guān)注。對于RNA分子的定量檢測，通常需要在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將RNA分子逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，從而進行擴增定量。因此，逆轉(zhuǎn)錄過程是RNA分子定量檢測的關(guān)鍵步驟。本研究利用建立的逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR定量檢測方法，分析了不同逆轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)品對PRRSV定量結(jié)果的影響。

1 材料和方法

1.1 病毒和試劑 HP-PRRSV毒株HuN4及PRRSV毒株CH-1a為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。病毒RNA提取試劑盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit）及QuantiTect Reverse Transcription Kit購自QIAGEN公司；ProtoScript Ⅱ cDNA 第一鏈合成試劑盒購自NEB公司；Reverse Transcription System購自Promega公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser購自Takara公司； SuperScriptTMIV First-Strand Synthesis System 購自Invitrogen公司；TaqManTMGene Expression Master Mix購自Applied Biosystem（AB）公司；微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)液SuperMix for Probes、微滴發(fā)生專用油、微滴分析專用油購自Bio-Rad公司。

1.2 引物設(shè)計 將GenBank數(shù)據(jù)庫中PRRSV基因序列進行比對，選擇序列相對保守區(qū)域ORF6，設(shè)計引物及探針。F1：5'-CTAGGCCGCAAGTACATTCT-3'；R1：5'- GACGACAAATGCGTGGTTATC-3'；P1：5'- FAM-ATTTGCCGCAATCGGATGAAAGC C-BHQ1-3'。所有引物及探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 按照QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN）試劑盒使用說明書，進行病毒基因組RNA提取。RNA保存于-80℃。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將6 μL所提取的RNA在20 μL的反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。cDNA保存于-20℃。

1.4 熒光定量PCR實驗 以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行熒光定量PCR實驗。實驗反應(yīng)體系：TaqManTMGene Expression Master Mix（AB）12.5 μL，上、下游引物各1 μL（終濃度200 nmol/L），探針1 μL（終濃度400 nmol/L），cDNA模板2 μL，加ddH2O補足終體積至25 μL。擴增條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 變性30 s，60℃退火1 min，40個循環(huán)；98℃變性10 min。用包含PRRSV ORF6及ORF7基因序列的線性化質(zhì)粒（中國計量科學(xué)研究院制備并定值）繪制標準曲線，對不同濃度的PRRSV cDNA進行定量檢測。

1.5 數(shù)字PCR實驗 以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行數(shù)字PCR實驗。反應(yīng)體系為：SuperMix for Probes（Bio-rad）10 μL，上、下游引物各0.8 μL（終濃度400 nmol/L），探針0.8 μL（終濃度240 nmol/L），cDNA模板4 μL，加ddH2O補足終體積至20 μL。將20 μL反應(yīng)混合液分裝至對應(yīng)微滴生成卡的sample孔位中，在微滴生成卡的Oil孔位中加入70 μL 微滴發(fā)生專用油，進行微滴生成。將生成的微滴（40 μL）轉(zhuǎn)入96孔深孔板中進行PCR反應(yīng)。擴增條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 變性30 s，54℃退火1 min，40個循環(huán)；98℃ 變性10 min。數(shù)字PCR反應(yīng)擴增結(jié)束后，利用Droplet Reader進行結(jié)果的讀取。選擇反應(yīng)中產(chǎn)生的可接受的平均微滴數(shù)目大于10 000的結(jié)果用于分析，保證定量分析的準確性。

1.6 數(shù)字PCR反應(yīng)線性關(guān)系及重復(fù)性研究 將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行梯度稀釋，每個濃度梯度設(shè)置6次重復(fù)，進行數(shù)字PCR反應(yīng)的線性關(guān)系研究。以6次重復(fù)實驗的結(jié)果計算變異系數(shù)（CV），研究數(shù)字PCR反應(yīng)重復(fù)性。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)重復(fù)性及再現(xiàn)性研究 利用NEB公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，設(shè)置3次獨立重復(fù)逆轉(zhuǎn)錄實驗，將得到的cDNA稀釋后作為模板，進行數(shù)字PCR擴增，并在不同時間內(nèi)分別進行獨立重復(fù)逆轉(zhuǎn)錄實驗，研究逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)重復(fù)性及再現(xiàn)性。

1.8 不同逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的擴增結(jié)果比較 使用5種逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA模板逆轉(zhuǎn)錄，設(shè)置3次獨立重復(fù)逆轉(zhuǎn)錄實驗。將得到的cDNA稀釋后作為模板，進行數(shù)字PCR定量分析。比較不同逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對定量結(jié)果的影響。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)字PCR方法的參數(shù)優(yōu)化 采用熒光定量PCR對引物及探針的濃度進行優(yōu)化，設(shè)置引物濃度為100、200、300、400、800 nmol/L，設(shè)置探針濃度為120、240、400 nmol/L。綜合考慮Cq值及熒光擴增信號，并選擇在數(shù)字PCR反應(yīng)中能將陰性擴增信號與陽性擴增信號明顯分開的條件作為最優(yōu)條件。最終選擇的體系為：引物濃度400 nmol/L，探針濃度240 nmol/L。設(shè)置退火溫度梯度為50℃～60℃。根據(jù)陰性擴增信號與陽性擴增信號差異最大的原則，選擇54℃作為退火條件（圖1）。

2.2 數(shù)字PCR方法的線性關(guān)系及重復(fù)性 在利用數(shù)字PCR方法檢測核酸濃度時，需要將核酸濃度稀釋到數(shù)字PCR的檢測范圍內(nèi)進行檢測。將cDNA梯度稀釋后進行數(shù)字PCR擴增反應(yīng)，結(jié)果表明，實驗所建立的數(shù)字PCR方法至少在5個數(shù)量級范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，HuN4及CH-1a對應(yīng)的R2分別為0.9995及0.9999（圖2）。以6次重復(fù)實驗的結(jié)果計算變異系數(shù)，結(jié)果如表1所示，實驗所建立的數(shù)字PCR方法在4個數(shù)量級范圍內(nèi)變異系數(shù)小于10%（1.01%～9.61%，最小變異系數(shù)為1.01%），實驗在此范圍內(nèi)重復(fù)性良好。

圖1 數(shù)字PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperature for ddPCR

2.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的重復(fù)性及再現(xiàn)性 由于實驗擬考察不同逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品對于數(shù)字PCR定值結(jié)果的影響，因此必須首先保證實驗方法的可重復(fù)性與可再現(xiàn)性。從結(jié)果2.2可以看到，對于同一逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）進行數(shù)字PCR定量分析，最小變異系數(shù)為1.01%，證明基于數(shù)字PCR定量方法的重復(fù)性較好。通過設(shè)置不同逆轉(zhuǎn)錄獨立重復(fù)實驗，并在不同時間內(nèi)分別進行反應(yīng)，計算實驗結(jié)果變異系數(shù)，反映逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)重復(fù)性及再現(xiàn)性。如表2及圖3所示，三次平行反應(yīng)間的變異系數(shù)為0.69%～3.00%，三次不同時間獨立重復(fù)實驗間的變異系數(shù)分別為2.38%及2.47%。

2.4 數(shù)字PCR與熒光定量PCR檢測結(jié)果的比較 利用10倍梯度稀釋的線性化質(zhì)粒繪制標準曲線，標曲斜率為-3.3927，對應(yīng)擴增效率為97%，R2為0.9993。將10倍梯度稀釋的HuN4與Ch-1a兩種病毒cDNA分子分別利用數(shù)字PCR與熒光定量PCR進行定量檢測，并將二者的檢測結(jié)果進行相關(guān)性分析，如圖4所示，發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR與熒光定量PCR方法之間存在良好的線性相關(guān)性（R2分別為0.998及0.994）。

圖2 數(shù)字PCR線性關(guān)系Fig.2 Linearity of ddPCR

表1 數(shù)字PCR方法的重復(fù)性Table 1 Repeatability of ddPCR

2.5 不同逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對PRRSV定量檢測結(jié)果的影響 利用5種不同逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，對HuN4及CH-1a兩種病毒RNA進行逆轉(zhuǎn)錄后，用逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR方法進行定量檢測。從圖4可以看到，對于同一種RNA，利用5種不同逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，最后的定量結(jié)果有所不同。利用試劑盒A進行逆轉(zhuǎn)錄，HuN4及CH-1a兩種樣品的定量結(jié)果均為最低；利用試劑盒B、C、D、E進行逆轉(zhuǎn)錄，將HuN4及CH-1a兩種樣品得到的定量結(jié)果分別進行統(tǒng)計學(xué)分析，均發(fā)現(xiàn)p＜0.01，因此利用這4個試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，得到的結(jié)果存在顯著性，具有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究采用5種不同逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對同種病毒RNA進行逆轉(zhuǎn)錄后，采用同種逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR方法進行定量檢測，且逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR方法的線性、重復(fù)性及再現(xiàn)性均經(jīng)過確認和驗證，由此可見不同逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得的不同結(jié)果是由逆轉(zhuǎn)錄試劑盒本身所造成的。

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的重復(fù)性及再現(xiàn)性Table 2 Repeatability and reproducibility of reverse transcription process

圖3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的重復(fù)性及再現(xiàn)性Fig.3 Repeatability and reproducibility of reverse transcription process

3 討論

數(shù)字PCR的原理是將一個PCR反應(yīng)體系分配到大量微小的反應(yīng)單元中，在每個微反應(yīng)器中包含或不包含1個或多個拷貝的目標核酸分子，進行“單分子模板”PCR擴增[11]。擴增結(jié)束后，通過陽性反應(yīng)單元（通過終點熒光信號判斷）的數(shù)目和統(tǒng)計學(xué)方法計算原始樣本中目標基因的拷貝數(shù)。因此，數(shù)字PCR可以實現(xiàn)核酸分子的絕對定量。對于RNA定量，首先需要將RNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，才能進行擴增定量。如果逆轉(zhuǎn)錄過程中沒有將RNA分子全部轉(zhuǎn)換為cDNA，則無法被準確定量。因此逆轉(zhuǎn)錄的過程直接影響最后的定量結(jié)果。逆轉(zhuǎn)錄酶已有商品化試劑，或是整合了逆轉(zhuǎn)錄酶及反應(yīng)所需的緩沖液、核苷酸、引物等，形成的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。實驗室在通常情況下，都是選擇一種逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品進行方法研究。本文通過建立的PRRSV逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR定量檢測方法，探討了不同逆轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)品對定量結(jié)果的影響。

圖4 PRRSV數(shù)字PCR及熒光定量PCR檢測Fig. 4 Quantification of PRRSV by ddPCR and qPCR

圖5 不同逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對PRRSV定量檢測結(jié)果的影響Fig.5 The effect of different reverse transcription kits on the quantitative results of PRRSV

針對PRRSV RNA分子的檢測，本實驗建立了逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR定量方法。首先利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)品將RNA分子逆轉(zhuǎn)錄，將得到的cDNA作為模板進行數(shù)字PCR擴增?？梢钥吹?，對于同一種逆轉(zhuǎn)錄酶得到的cDNA模板，建立的數(shù)字PCR方法線性及重復(fù)性良好，并且與建立的熒光定量PCR方法的檢測結(jié)果具有良好的線性相關(guān)性，因此可用于比較逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品對定量結(jié)果的影響[9]。本研究共選擇了5種不同逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行比較，其中利用試劑盒A進行逆轉(zhuǎn)錄，對HuN4及CH-1a兩種菌株的RNA分子定量結(jié)果均明顯低于其他試劑盒[6]。利用其他4種試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，得到的定量結(jié)果通過統(tǒng)計分析組內(nèi)差異與組間差異，發(fā)現(xiàn)存在統(tǒng)計學(xué)差異。而且，對于HuN4及CH-1a兩種模板，不同試劑盒定量結(jié)果差異的程度有所不同。分析數(shù)字PCR定量結(jié)果存在差異原因，可能有兩個方面：一方面，可能由于不同廠家所生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄酶活力、純度等有所不同，造成目標RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA的數(shù)量有所不同，未被逆轉(zhuǎn)錄的目標RNA則不會被擴增；另一方面，可能由于不同廠家試劑盒生產(chǎn)試劑盒中加入的試劑不同，對后續(xù)PCR反應(yīng)有不同程度的抑制作用存在，造成逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA不能被完全擴增定量，從而影響了后續(xù)基于數(shù)字PCR的定量檢測結(jié)果。

因此，在對RNA分子進行定量檢測時，無論擴增反應(yīng)優(yōu)化的程度如何，逆轉(zhuǎn)錄的過程都將直接影響定量結(jié)果。在涉及逆轉(zhuǎn)錄過程的定量檢測方法建立的過程中，應(yīng)對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品進行考察和選擇。