王志仙，秘清靈，凌玨怡，賈婧宇，鮑 芳，王 昱，王鉅華，王建業(yè)，朱國強

（1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心 江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽用生物制劑創(chuàng)制重點實驗室，揚州 225009；2.揚州優(yōu)邦生物藥品有限公司，揚州 225008）

番鴨細小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）屬于細小病毒科細小病毒亞科依賴細小病毒屬，按照ICTV最新分類體系，在該屬下僅列有3個種，其中一個種為雁形目依賴細小病毒，MDPV和鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV）均列為該種下的毒株或者變種[1]。MDPV基因組約為5100個核苷酸的單鏈DNA，基因組兩側(cè)翼為末端倒置重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITR）。MDPV和GPV享有高度相似的基因組結(jié)構(gòu)，只是在ITR長度上，MDPV比GPV多出約12個堿基[2-4]。它們的基因組均包含2個閱讀框（open reading frame，ORF），左側(cè)ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白Rep，受P9啟動子調(diào)控，通過對mRNA的選擇性剪切可生成Rep1以及其他幾個分子量更小的Rep蛋白[5]。右側(cè)ORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白Cap，受P41啟動子調(diào)控，通過對mRNA選擇性剪切以及起始密碼子的選擇性使用，右側(cè)ORF可生成VP1、VP2和VP3 3個結(jié)構(gòu)蛋白，以約1∶1∶8的比例組成病毒衣殼[6]。

MDPV感染3周齡內(nèi)雛番鴨，患病番鴨表現(xiàn)以腹瀉、軟腳和喘氣為主要特征的臨床癥狀，發(fā)病率可達27%～62%，死亡率為22%～43%，俗稱番鴨“三周病”[7-8]。國內(nèi)雛番鴨細小病毒病的最早報道始于1986年前后[9]，此病還流行于其他番鴨養(yǎng)殖國家[10-12]。2010年6月，浙江金華某番鴨養(yǎng)殖場的7日齡雛番鴨暴發(fā)一起疑似MDPV感染的疫病，死亡率近50%，用番鴨胚從病死番鴨肝臟中分離到一株病毒，命名為JH10株。本研究中，為了明確該毒株的基因組特征，對JH10株的全基因組進行了PCR擴增和測序，并進行了重組分析，顯示JH10是一株重組型的MDPV。本研究為今后深入闡明重組型MDPV的致病機理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒與主要試劑 番鴨細小病毒JH10株由本實驗室分離保存。Primestar Max高保真聚合酶、TaqDNA聚合酶、DNA ligation kit購自大連寶生物工程有限公司；凝膠回收試劑盒購自天根生物科技有限公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank已發(fā)表的MDPV YY株基因組序列（GenBank登錄號：KX000918），借助Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計6對引物（表1），將基因組分成6個片段進行擴增，各片段相互重疊。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 病毒基因組提取 取400 μL JH10株番鴨胚傳代至第4代的尿囊液，9600×g，離心5 min，吸取上清，加入100 μL TE緩沖液（50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，pH 8.0）混合，繼續(xù)加入10% SDS和蛋白酶K至終濃度分別為1%和400 μg/mL，50℃水浴2 h。用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）和氯仿-異戊醇（24∶1）各抽提1遍。上清液加入2.5倍體積的無水乙醇和1/10體積醋酸鈉（pH 5.2），-20℃沉淀過夜。次日20 000×g，離心20 min，去上清液，核酸沉淀用70%無水乙醇洗滌1次，20 000×g，離心5 min，去上清液。沉淀用真空離心濃縮儀離心10 min以去除殘留酒精，DNA沉淀用30 μL去離子水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增和克隆 采用50 μL擴增體系，其中加入上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，Primestar Max高保真聚合酶混合物25 μL，不足部分用ddH2O補齊。PCR循環(huán)條件按照每1 kb延伸15 s，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳檢測后，采用凝膠回收試劑盒回收純化各片段。用Taq酶對各片段3'末端進行加“A”反應(yīng)，按照10×PCR buffer 1.2 μL，純化片段8 μL，dNTP 1 μL，去離子水1.5 μL，Taq酶0.3 μL。反應(yīng)管置于PCR儀，72℃反應(yīng)10 min。加“A”后的各片段立即與pMD19-T載體相連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，送陽性克隆至金唯智生物科技有限公司測序。采用DNAStar 5.0程序包中的SeqMan軟件對測序結(jié)果進行拼接。

1.5 重組分析和遺傳進化數(shù)構(gòu)建 采用DNAStar 5.0程序包中的MegAlign軟件和ClustalX 2.1軟件對JH10株進行同源性比對分析。重組分析軟件SimPlot version 3.5.1和RDP4 v.4.43用于檢測JH10株可能發(fā)生的重組事件。在RDP4重組分析中，采用RDP、GENCONV、MaxChi、BootScan、SicCAN、LARD、3SEQ 7種算法檢測重組事件，采用MEGA 6.01程序構(gòu)建遺傳進化樹。

表1 用于JH10株基因組擴增的引物Table1 The primers designed for amplifying the complete genome of strain JH10

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增和序列拼接 采用6對引物分別擴增JH10株基因組中的相應(yīng)片段。結(jié)果顯示，獲得的各目的片段，與預(yù)期相符（圖1），各片段分別為190、536、1406、1388、1437、582 bp。用SeqMan軟件將各目的片段進行序列拼接，獲得完整基因組序列，JH10株基因組全長5071個核苷酸，并將該毒株序列上傳至GenBank，其收錄號為MH807698。

圖1 PCR擴增JH10株基因組片段Fig.1 Amplification of the genomic fragments of strain JH10 by PCR

2.2 基因組ITR序列分析 經(jīng)ClustalX 2.1軟件對JH10株ITR序列進行比對分析，結(jié)果顯示，JH10株的ITR由424個核苷酸組成，其中385個核苷酸組成回文結(jié)構(gòu)，內(nèi)側(cè)的D序列則由39個核苷酸組成，與3'端ITR的D'序列反向互補，能夠使整個基因組分子在更大范圍內(nèi)形成一個大的回文結(jié)構(gòu)。JH10株ITR與經(jīng)典型MDPV FM和YY株進行序列比對顯示，其在莖部均存在14個核苷酸對的缺失（圖2）。此外，JH10株ITR在回文區(qū)莖部還存在額外的2個核苷酸缺失，但均處在互補位置，不影響其他核苷酸互補配對形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。JH10株ITR與經(jīng)典型MDPV YY株的同源性達到97.2%，而與經(jīng)典型GPV強毒株LH株ITR的同源性則為85.5%，表明JH10株ITR來自經(jīng)典型MDPV。

2.3 JH10株的重組分析 經(jīng)Simplot 3.5.1和RDP4軟件對JH10株基因組進行了重組分析，結(jié)果顯示，在其基因組的2個位置檢測到明顯的重組信號（圖3）。一個重組信號產(chǎn)生在P9啟動子區(qū)，重組發(fā)生在鵝胚化弱毒株SYG61v和經(jīng)典型MDPV YY株之間。RDP4檢測的重組斷裂點起始位置在424位堿基處，終點在615位核苷酸處，結(jié)果顯示JH10株P(guān)9啟動子序列與SYG61v具有100%的同源性。另一個重組信號產(chǎn)生在VP3區(qū)域，RDP4檢測的重組斷裂點起始位置在基因組的3120位核苷酸處，終點在4278位核苷酸處，大致位置從VP3基因起始密碼子下游約100個堿基處延伸至約基因組4300位核苷酸處，覆蓋了約1100 bp的范圍。重組產(chǎn)生在經(jīng)典型MDPV YY和GPV之間，參與重組的GPV包括國內(nèi)強毒株LH、匈牙利強毒株B和國內(nèi)弱毒疫苗株SYG61v，但SYG61v僅是參與了較小范圍內(nèi)的片段重組。本研究結(jié)果表明，JH10株是重組型的MDPV，但其包括ITR和Rep基因在內(nèi)的基因組主體骨架仍來自經(jīng)典型MDPV，只是在P9啟動子區(qū)和VP3基因內(nèi)部通過重組獲得了不同來源的GPV毒株序列。

圖2 JH10株與經(jīng)典型MDPV強毒株 FM和YY的5'ITR序列比對Fig.2 5'ITR sequence alignments between the JH10 isolate and the classical MDPV strain YY, FM

圖3 JH10株基因組的重組分析Fig.3 Recombination analyses were performed against the JH10 genome

2.4 JH10株的遺傳進化分析 以VP3基因重組區(qū)域的1100個核苷酸片段構(gòu)建遺傳進化樹，結(jié)果顯示，JH10株與所有8個經(jīng)典的GPV病毒株處于同一個進化分支中，而所有4個MDPV經(jīng)典株處于另一個分支上（圖4）。以重組區(qū)域上游的VP1氨基端694個核苷酸片段和重組區(qū)域上游VP1 羧基端405個核苷酸分別構(gòu)建遺傳發(fā)生樹，結(jié)果顯示，JH10均與經(jīng)典的MDPV毒株處于同一分支，而所有經(jīng)典型GPV毒株處于另一個分支。結(jié)果表明，針對JH10株不同基因節(jié)段繪制的遺傳進化樹分析結(jié)果與前述的重組分析結(jié)果完全吻合。

3 討論

JH10株全基因組的測序使得我們可以在全基因組水平上將之與經(jīng)典的GPV和MDPV病毒株展開重組分析比較，結(jié)果顯示JH10株既不同于經(jīng)典型GPV，也不同于經(jīng)典型MDPV，它的本質(zhì)是一種重組型MDPV（rMDPV）。JH10株基因組主體骨架仍來自于經(jīng)典型MDPV毒株，只是在P9啟動子區(qū)和VP3基因中部通過重組獲得了不同來源的GPV序列。近來，已有不同時期的MDPV分離株先后被鑒定為重組型MDPV[13-14]，因此我們可以推測這一類型毒株在我國番鴨群中流行已有多年，對番鴨養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)造成危害。

JH10株結(jié)構(gòu)蛋白基因和P9啟動子區(qū)域整合了GPV強毒株和弱毒株的相應(yīng)序列，結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組可以使重組病毒獲得不同于經(jīng)典型MDPV毒株的抗原性，以經(jīng)典型MDPV弱毒疫苗株免疫過的雛番鴨對rMDPV仍舊易感。rMDPV最為特征性的標志是結(jié)構(gòu)蛋白基因發(fā)生重組的同時也伴隨了P9啟動子的重組。P9啟動子的上游即是5' ITR，ITR上分布著多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點[2]，下游即為Rep蛋白表達框，rMDPV毒株與經(jīng)典型MDPV毒株在這兩部分的序列高度同源。因此，從基因適配性角度考量，rMDPV毒株采用經(jīng)典型MDPV的P9啟動子序列才更為合理，但事實卻是重組病毒的P9啟動子序列來自于GPV疫苗株SYG61v，而不是經(jīng)典型MDPV毒株或者GPV強毒株的P9啟動子序列。SYG61v毒株是一種鵝胚適應(yīng)的弱毒疫苗株，該毒株的親本強毒株為我國著名的獸醫(yī)學(xué)家方定一[15]于1961年所分離，SYG61v弱毒株制成的活疫苗在我國廣泛用于防治小鵝瘟[3,16]。鑒于rMDPV毒株對雛番鴨具有較高的致死率，因此，深入揭示一個相對弱化的P9啟動子在rMDPV毒力增強中發(fā)揮的作用具有重要意義。

圖4 JH10株與12個經(jīng)典GPV和MDPV病毒株基于VP1基因構(gòu)建的遺傳進化樹（括弧中為各毒株的GenBank基因登陸號）Fig.4 The phylogenetic trees constructed based on the different DNA fragments of the VP1 gene of strain JH10 and twelve classical MDPV and GPV strains (GenBank accession numbers are in parentheses)