韓宏曉，洪 煬，傅志強，彭金彪，林矯矯

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室，上海200241；2.上海市閔行區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，上海201109）

日本血吸蟲病是一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病，目前血吸蟲病的防治主要依賴于抗血吸蟲藥物吡喹酮的使用，但存在對童蟲藥效差、不能預(yù)防重復(fù)感染和潛在耐藥性風(fēng)險等問題[1]。當(dāng)前我國血吸蟲病防控已從疫情控制轉(zhuǎn)入疫情消除階段，建立更為靈敏、特異和可用于早期感染診斷的技術(shù)，是做好血吸蟲病消除工作的迫切需求[2]。童蟲是血吸蟲在終宿主體內(nèi)早期發(fā)育的蟲體階段，血吸蟲童蟲階段cDNA文庫構(gòu)建、免疫源性相關(guān)基因的篩選及重要童蟲階段差異表達(dá)基因的功能分析等研究，對篩選血吸蟲早期診斷抗原分子和疫苗候選分子等都具有重要意義[3-4]。

本研究構(gòu)建了日本血吸蟲7 d童蟲cDNA文庫，利用日本血吸蟲感染10 d和42 d的小鼠血清篩選該文庫，獲取感染10 d的抗血清特異陽性克隆，對陽性克隆進(jìn)行測序驗證和分析，為加深理解日本血吸蟲的生長發(fā)育機制，并對血吸蟲早期診斷抗原分子和疫苗候選分子的發(fā)現(xiàn)提供新信息。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和酶 Trizol試劑購自Invitrogen公司；cDNA文庫構(gòu)建試劑盒SMARTTMcDNA Library Construction Kit購自Clontech公司；Gigapack?ⅢGold Packaging Kit購自Stratagene公司；HRP-羊抗鼠IgM酶標(biāo)二抗購自Sigma公司；IPTG、X-gal等分子生物學(xué)試劑購自Promega公司；硝酸纖維素膜購自Whatman公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物和血清 新西蘭白兔（雄性，2.5～3.0 kg）購自上海羅涇飛達(dá)實驗動物養(yǎng)殖場；BALB/c小鼠購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心；尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供；新西蘭白兔以腹部貼片法分別感染15 000條血吸蟲尾蚴，在感染后7 d剖殺，以肝門靜脈灌注法收集日本血吸蟲童蟲備用；日本血吸蟲感染小鼠的10 d和42 d血清由本實驗室制備。

1.3 日本血吸蟲7 d童蟲總RNA的提取和純化 按照說明書用Trizol對新鮮收集的日本血吸蟲7 d童蟲提取總RNA，并使用Nanodrop對提取的RNA進(jìn)行定量。以RNase-free DNase Ⅰ消化、RNA easyTMMini Kit試劑盒純化去除基因組DNA污染。

1.4 日本血吸蟲7d童蟲cDNA文庫的構(gòu)建和鑒定 在日本血吸蟲7 d童蟲純化后總RNA中加入CDS Ⅲ/3'PCR primer、SMART Ⅳ Oligonucleotide、dNTP Mix后，以Primer Script Reverse Transcriptase Ⅲ反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；再分別加入mRNA 5'端Cap區(qū)和3'端polyA區(qū)通用引物、dNTPs和polymerase Mix合成雙鏈cDNA。雙鏈cDNA經(jīng)蛋白酶K消化和SfiI酶切消化后過柱去除小片段cDNA；將收集的cDNA片段與λTriplEx2噬菌體的兩臂連接，轉(zhuǎn)化到宿主菌XL1-Blue構(gòu)建包裝好的初始文庫。鋪LB平板對初始文庫進(jìn)行滴度和容量的測定，藍(lán)白斑篩選預(yù)估初始文庫重組率；提取噬菌體DNA，以通用引物PCR擴(kuò)增測定重組子插入片段大小。

1.5 7 d童蟲cDNA文庫的免疫學(xué)篩選 日本血吸蟲感染小鼠的10 d和42 d血清用大腸桿菌蛋白裂解液預(yù)吸收，以去除抗大腸桿菌抗體[5]。將日本血吸蟲7 d童蟲cDNA擴(kuò)增文庫稀釋鋪板，共鋪15塊板，將2張IPTG預(yù)處理的NC膜吸附每個LB平板上的噬菌斑并標(biāo)記定位再將吸附噬菌斑的NC膜分別與預(yù)處理的血吸蟲感染小鼠的10 d和42 d血清孵育過夜，用胎牛血清封閉、HRP-羊抗鼠IgM二抗孵育和DAB顯色。比對10 d和42 d孵育的2張NC膜，篩選出10 d血清孵育的NC膜上特有陽性斑點（42 d血清孵育的NC膜上不顯色的陽性斑點），并復(fù)篩3次。復(fù)篩獲得的陽性克隆轉(zhuǎn)化至宿主菌、擴(kuò)增并提取噬菌體DNA、PCR鑒定后送測序，對獲得的EST序列進(jìn)行分析。

1.6 RT-qPCR法驗證表達(dá)基因 將篩選出來的7個差異表達(dá)基因利用在線設(shè)計軟件https://www.idtdna.com/scitools設(shè)計實時定量PCR特異性引物，分別以純化的10 d和42 d日本血吸蟲cDNA作為模板，應(yīng)用RT-qPCR法在ABI 7500 real-time PCR系統(tǒng)上按照2-ΔΔCt法對差異表達(dá)基因進(jìn)行相對定量分析[6]，以日本血吸蟲NADH-ubiquinone reductase基因為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primers used for RT-qPCR analysis

2 結(jié)果與討論

日本血吸蟲生活史復(fù)雜，不同生活階段蟲體蛋白表達(dá)譜不斷的發(fā)生變化，對宿主的免疫應(yīng)答機制亦不同，尤其是處于早期發(fā)育階段的童蟲，因蟲體小而成為宿主免疫應(yīng)答的重要靶標(biāo)。日本血吸蟲肝期童蟲是性別分化和發(fā)育的最快階段，感染后7 d的童蟲剛進(jìn)入肝門靜脈，蟲體處于細(xì)胞分化期，開展童蟲cDNA文庫的構(gòu)建及免疫篩選可為分離、鑒定早期童蟲發(fā)育和分化相關(guān)基因提供了技術(shù)手段，對探討血吸蟲的免疫逃避機制、篩選血吸蟲早期診斷抗原分子和疫苗候選分子具有重要意義[7]。

2.1 日本血吸蟲7 d童蟲cDNA文庫構(gòu)建與鑒定 測定提取的日本血吸蟲7 d童蟲總RNAD260/D280比值為1.90，RNA濃度為520 μg /mL，純化后其D260/D280的比值為1.98，RNA濃度為345 μg/mL。合成雙鏈cDNA階段對雙鏈cDNA的合成循環(huán)數(shù)進(jìn)行篩選分析，發(fā)現(xiàn)19個循環(huán)合成效率最好。構(gòu)建的日本血吸蟲7 d童蟲cDNA文庫鋪平板測定其初始文庫滴度為2.4106pfu/mL，對初始文庫進(jìn)行擴(kuò)增鋪平板，擴(kuò)增后文庫滴度為1.6×109pfu/mL，符合文庫滴度要求。cDNA文庫稀釋后鋪平板，加入IPTG、X-gal，培養(yǎng)9～16 h，計數(shù)平板的藍(lán)白斑，計算cDNA文庫重組率為98%。隨機挑取單個噬菌斑擴(kuò)增，提取噬菌體DNA，用測序通用引物T3、T7進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA瓊脂糖凝膠電泳分析，文庫插入片段為0.5～3.0 kb，見圖1。

2.2 日本血吸蟲7 d童蟲cDNA文庫的免疫學(xué)篩選及分析 將日本血吸蟲7 d童蟲cDNA擴(kuò)增文庫稀釋鋪板，每板約1000個噬菌斑的密度共鋪平板15塊，將2張IPTG預(yù)處理的NC膜吸附至一塊平板上的噬菌斑并標(biāo)記定位，后每塊平板對應(yīng)的2張吸附噬菌斑的NC膜分別與預(yù)處理的小鼠的10 d和42 d血清孵育、封閉、二抗孵育和DAB顯色，篩選出10 d血清孵育的NC膜上特有陽性斑點50個，復(fù)篩后獲得25個陽性克隆，PCR電泳和測序分析得到出17條有效EST序列。有效EST序列經(jīng)NCBI比對分析，17條EST序列分別編碼7個基因，見表2。他們分別為：復(fù)制蛋白（2 ESTs）、肝再生增強因子（3 ESTs）、血小板活化因子（6 ESTs）、鈣調(diào)理蛋白基因（3 EST）、絲束蛋白（1 ESTs）、核糖體RNA（1 EST）和還原型輔酶脫氫酶基因（1 EST）。

圖1 PCR擴(kuò)增日本血吸蟲7 d童蟲cDNA文庫插入片段分析Fig.1 PCR analysis of insert DNA fragment from 7-day schistosomula cDNA library

表2 免疫篩選獲得日本血吸蟲童蟲階段特異表達(dá)ESTs序列分析Table 2 Analysis of the schistosomula stage-specific expressed ESTs screened from the cDNA library

復(fù)制蛋白A（RPA）是當(dāng)前國內(nèi)外研究細(xì)胞DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)的一個熱點，RPA為真核細(xì)胞中主要的單鏈結(jié)合蛋白，在DNA復(fù)制和修復(fù)過程中有重要作用[8-9]。在血吸蟲早期感染階段，血吸蟲遭遇新的生存、生長發(fā)育環(huán)境，復(fù)制蛋白也可能在DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用。肝臟再生增強因子是肝細(xì)胞的生存必需的重要因子，存在于線粒體、胞漿、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及胞核之中，肝臟再生增強因子由肝細(xì)胞分泌，在Kupffer細(xì)胞中通過G-蛋白耦聯(lián)的受體刺激一系列免疫因子如腫瘤壞死因子、白介素-6和一氧化氮的合成[10]。血小板活化因子是一種強效生物活性磷脂類細(xì)胞因子，由白細(xì)胞、血小板、肺臟、肝臟和腎臟等多種細(xì)胞和器官產(chǎn)生，在血栓形成、急性炎癥等病理生理過程中起重要作用[11]。日本血吸蟲7 d童蟲處于細(xì)胞分化期，日本血吸蟲可能通過釋放內(nèi)源性類肝臟再生增強因子和類血小板活化因子來減少免疫應(yīng)激，維持其正常生長發(fā)育，具體功能還有待進(jìn)一步試驗驗證。鈣調(diào)理蛋白為一類具有多種功能的運動相關(guān)蛋白，曼氏血吸蟲研究發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)理蛋白可對幼蟲發(fā)育、尾蚴建立感染和產(chǎn)卵等具有作用[12]，日本血吸蟲早期童蟲處于生長發(fā)育階段，鈣調(diào)理蛋白的特異性表達(dá)可能具有與曼氏血吸蟲類似的功能。

2.3 免疫篩選的差異表達(dá)基因驗證分析 RT-qPCR分析結(jié)果表明，免疫篩選出的差異表達(dá)基因在10 d和42 d日本血吸蟲表達(dá)各異，其中復(fù)制蛋白、肝臟再生增強因子、血小板活化因子、鈣調(diào)理蛋白和絲束蛋白在10 d童蟲表達(dá)量顯著高于42 d成蟲（＞2倍），而核糖體RNA和還原型輔酶脫氫酶基因在10 d童蟲和42 d 成蟲表達(dá)量差異并不顯著（圖2）。究其原因可能源于cDNA免疫篩選方法的局限性所致，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，為精細(xì)分析不同發(fā)育階段蟲體蛋白質(zhì)表達(dá)差異提供了可能。

總之，本研究成功構(gòu)建了日本血吸蟲7 d童蟲cDNA文庫，并使用日本血吸蟲感染小鼠10 d和42 d血清免疫篩選該文庫，獲得多個日本血吸蟲早期童蟲階段特異表達(dá)基因，如復(fù)制蛋白、肝臟再生增強因子、血小板活化因子、鈣調(diào)理蛋白基因等，可為深入研究血吸蟲早期童蟲的生長發(fā)育機制，篩選血吸蟲病疫苗候選分子、藥物靶標(biāo)和早期診斷抗原提供基礎(chǔ)。

圖2 差異表達(dá)基因RT-qPCR分析Fig.2 Analysis of differential expressed genes in 10-day and 42-day S. japonicum by RT-qPCR