馮 春 ，楊 帆 ，喬丹丹 ，秦愛建 ,3，錢 琨 ,3

（1.揚州大學(xué) 教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，揚州 225009；2.揚州大學(xué) 江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，揚州 225009；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

馬立克氏病（Marek's disease，MD）是由α皰疹病毒科馬立克氏病病毒（Marek's disease virus，MDV）感染引起的惡性T細(xì)胞淋巴瘤，導(dǎo)致家禽嚴(yán)重的免疫抑制，給家禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1]。目前MD的防控主要是疫苗免疫，常用的疫苗包括血清I型弱毒疫苗CVI988、814株，Ⅱ型疫苗SB-1以及Ⅲ型疫苗HVT[2]。研究表明臨床使用的MDV疫苗能保護機體不發(fā)生急性惡性腫瘤，但并未能阻止體內(nèi)病毒的復(fù)制和釋放。在疫苗選擇壓力下，MDV毒力不斷進(jìn)化，近年來有免疫雞群暴發(fā)MD的報導(dǎo)[3]，提示MDV有突破現(xiàn)有疫苗保護的趨勢。因此，在研發(fā)更加有效疫苗的基礎(chǔ)上，尋求有效抗病毒藥物也是一種控制疾病發(fā)生、發(fā)展的途徑。

中草藥源遠(yuǎn)流長，其提取物中含大量生物活性物質(zhì)，部分提取物或代謝產(chǎn)物具有廣譜的抗病毒作用和多種免疫調(diào)節(jié)功能，無藥物殘留，目前得到國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注[4]。姜黃素（Curcumin，Cur）是一種橙色晶體狀粉末，為酸性多酚類化合物，從姜黃的根莖中提取得到?；瘜W(xué)式為C21H20O6（3-甲氧基-4-羥基-苯基-1，6-庚二烯-3，5-二酮），不僅具有二酮類結(jié)構(gòu)，也具有多酚類結(jié)構(gòu)。姜黃素結(jié)構(gòu)的特殊性和稀有性決定了其抗病毒的化學(xué)藥理作用[5]。Du等[5]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過阻礙病毒脫衣殼以及病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合現(xiàn)象抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）內(nèi)化進(jìn)入MARC-145細(xì)胞；Bryan等[6]發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）和基孔肯尼雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）等囊膜病毒吸附到細(xì)胞表面從而抑制病毒感染；Zhu等[7]發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制牛Ⅰ型皰疹病毒BoHV-1進(jìn)入MDBK細(xì)胞；Kutluay等[8]發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制單純皰疹病毒的早期即刻（Herpes simplex virus immediate-early，HSV-IE）基因的表達(dá)影響病毒復(fù)制。然而，姜黃素對家禽病毒病的療效還鮮有報道。

本研究旨在探究姜黃素對MDV超強毒株RB-1B在雞胚成纖維細(xì)胞（chick embryo fibroblast cell，CEF）中復(fù)制產(chǎn)生的影響，為防控MD有效抗病毒藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 生物材料和試劑 雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）由9～10日齡的SPF雞胚制得；MDV超強毒株RB-1B由本實驗室保存；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和DMEM均購自GIBCO公司；姜黃素購自SIGMA公司；針對血清I型MDV糖蛋白gB的單抗BA4由本實驗室制備并保存；內(nèi)參抗體α-Tubulin購自SIGMA公司；細(xì)胞裂解液RIPA buffer購自康為世紀(jì)公司；CCK-8溶液、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FITC標(biāo)記的山羊抗鼠二抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購自Jackson公司；HRP化學(xué)發(fā)光底物液購自Bio-Rad公司；總RNA提取試劑盒購自Axygen公司；PrimerScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser（Perfect for Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBR熒光染料購自TaKaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞毒性實驗 姜黃素溶于DMSO中，配置貯存濃度為20 mmol/L，于-20℃保存?zhèn)溆?。藥物?xì)胞毒性檢測按照CCK-8說明書操作，簡述如下：姜黃素用含1%FBS的DMEM稀釋至5、10、20、25、40、80 μmol/L。將不同濃度的姜黃素加入到細(xì)胞孔內(nèi)，每個濃度設(shè)置4個重復(fù)，分別設(shè)置DMSO以及各個濃度有藥物無細(xì)胞的對照，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，37℃繼續(xù)孵育0.5～4 h，酶標(biāo)儀于D450處讀取數(shù)值。細(xì)胞存活率=

1.3 姜黃素對MDV復(fù)制的影響 為觀察不同濃度姜黃素對MDV復(fù)制的影響，選擇0、2、20 μmol/L濃度姜黃素在12孔細(xì)胞板中預(yù)處理細(xì)胞4 h，然后每孔加入200 pfu病毒與不同濃度姜黃素的混合物，設(shè)置4個重復(fù)，并使用含姜黃素的維持液培養(yǎng)96 h后，收集細(xì)胞分別用于RNA提取、蛋白裂解、間接免疫熒光和病毒噬斑計數(shù)。為觀察姜黃素作用的時間效應(yīng)，參考文獻(xiàn)[9]，將姜黃素（20 μmol/L）與MDV的混合物共同加入到CEF細(xì)胞中，設(shè)置僅接種MDV不加姜黃素組作為對照組，分別于接種MDV后24、48、72、96 h測定MDV基因表達(dá)水平和增殖情況。

1.4 不同時間點加入姜黃素對MDV復(fù)制的影響 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4, 9-10]，確定姜黃素抑制MDV復(fù)制作用的時間點，分別在MDV感染前中后的不同時間段加入姜黃素（20 μmol/L）處理CEF細(xì)胞，實驗方案簡述如下，第一種方案（P1）：MDV感染前4 h用姜黃素（20 μmol/L）預(yù)處理CEF細(xì)胞，PBS清洗后接種MDV，1%含F(xiàn)BS的DMEM于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h；第二種方案（P2）：姜黃素和MDV的混合物共同加入到CEF細(xì)胞中，吸附4 h 后PBS洗滌，加入含1%FBS的DMEM于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h；第三種方案（P3）：MDV感染CEF細(xì)胞4 h后，使用PBS洗滌細(xì)胞并用含姜黃素和1% FBS的DMEM于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h；第四種方案（P1+P2+P3）：細(xì)胞預(yù)處理階段、MDV吸附感染階段以及MDV后期復(fù)制階段，細(xì)胞培養(yǎng)液中均含有20 μmol/L的姜黃素，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h，測定MDV滴度驗證姜黃素對MDV復(fù)制不同階段的抑制情況。

1.5 姜黃素直接對病毒感染性的影響 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7, 11]設(shè)計實驗如下：分別將MDV與姜黃素（20 μmol/L）混合物或者M(jìn)DV與DMEM混合物在37℃孵育1.5 h，然后將混合物接種至單層CEF細(xì)胞中，96 h后分別測定病毒基因表達(dá)量以及病毒增殖情況。

1.6 Western blot檢測 收集細(xì)胞利用RIPA buffer裂解，并使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。采用常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)印、5%脫脂乳封閉、一抗（gB蛋白的單克隆抗體BA4和內(nèi)參α-tubulin）和二抗（HRP羊抗鼠1∶10 000）的孵育、顯色等步驟，最終使用HRP增強型化學(xué)底物避光顯色5 min后，于超靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照保存。

1.7 間接免疫熒光檢測 MDV接種于CEF細(xì)胞96 h后，利用固定液（丙酮∶乙醇=3∶2）室溫固定CEF細(xì)胞5 min，PBS洗滌后加入BA4抗體孵育60 min后，在加入二抗FITC標(biāo)記的羊抗鼠孵育30 min后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 病毒噬斑計數(shù) 將含病毒的細(xì)胞懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋后的10-1～10-7病毒懸液分別接種至96孔細(xì)胞板中的CEF細(xì)胞，4～5 d后對相應(yīng)稀釋梯度的噬斑進(jìn)行計數(shù)，計算方式如下：病毒滴度（pfu/mL）=（平均每孔噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)）/每孔接種病毒量（mL）

1.9 real-time PCR檢測 病毒基因gB、Meq的表達(dá)量采用real-time PCR來檢測。real-time PCR引物序列見表1。按照說明書提取RNA并取1 μg總RNA作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，cDNA加入體系之前用ddH2O進(jìn)行10倍稀釋。反應(yīng)體系為：SYBR Premix ExTaqTMⅡ 10 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL、ddH2O 6 μL、模板2 μL，共20 μL。real-time PCR在ABI 7500系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，共40個循環(huán)。以18s為內(nèi)參基因?qū)颖具M(jìn)行歸一化處理，每個樣本3個重復(fù)。

1.10 數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計分析 利用GraphPad (version 5.0)軟件對結(jié)果進(jìn)行Student-t分析，以確定不同組別之間是否具有顯著性差異。*代表p＜0.05，表現(xiàn)為差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義；**代表p＜0.01，表現(xiàn)為差異極顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義；***代表P＜0.001，表現(xiàn)為差異極極顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對CEF的細(xì)胞毒性實驗 不同濃度的姜黃素與CEF細(xì)胞孵育96 h后，每孔加入CCK-8檢測姜黃素對CEF細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，姜黃素在濃度20 μmol/L內(nèi)對CEF細(xì)胞的生長沒有明顯影響，甚至在濃度10 μmol/L時還具有一定的促生長作用，結(jié)果見圖1。因此，本研究最終選擇2、20 μmol/L作為工作濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 姜黃素明顯抑制MDV的復(fù)制和增值 在MDV接種前4 h以及接種后96 h整個過程中加入姜黃素顯著抑制了MDVMeq、gB基因的表達(dá)，并且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖2A、2B；噬斑計數(shù)結(jié)果顯示姜黃素在濃度20 μmol/L時，顯著降低MDV在CEF細(xì)胞中的增殖，結(jié)果見圖2C；間接免疫熒光和Western blot結(jié)果也顯示，姜黃素明顯抑制了MDV的復(fù)制和增殖，見圖2D、2E。

2.3 姜黃素抑制MDV復(fù)制具有時間依賴性 在MDV接種CEF細(xì)胞后96 h內(nèi)，不同時間點收集CEF細(xì)胞進(jìn)行檢測。加姜黃素組與不加姜黃素對照組MDVgB基因的表達(dá)量以及噬斑數(shù)量差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。結(jié)果表明，姜黃素在CEF細(xì)胞中抑制MDV的復(fù)制，且具有時間依賴性。

表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time PCR

圖1 姜黃素在CEF細(xì)胞中的毒性檢測Fig.1 The cytotoxic effect of curcumin on CEF cells

2.4 姜黃素抑制MDV復(fù)制過程解析 為了解姜黃素抑制病毒感染的作用環(huán)節(jié)，設(shè)計四種不同的加藥方案，均于接種MDV后96 h收取細(xì)胞，用于MDV RNA提取及MDV滴度測定。結(jié)果表明，在MDV與CEF細(xì)胞吸附階段和MDV復(fù)制后期階段加入姜黃素均能抑制MDV復(fù)制，以細(xì)胞吸附階段作用最顯著，而藥物預(yù)處理CEF細(xì)胞時，對MDV復(fù)制沒有影響，見圖4。

2.5 姜黃素直接影響MDV的感染性 為了進(jìn)一步明確姜黃素對MDV感染性作用，將MDV與姜黃素在37℃共同孵育1.5 h后感染CEF細(xì)胞，real-time PCR和噬斑計數(shù)結(jié)果均顯示，姜黃素處理組的MDV基因表達(dá)和增殖均明顯減弱，表明姜黃素能直接影響MDV的感染性，結(jié)果如圖5所示。

2.6 姜黃素對病毒感染細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)的影響 有文獻(xiàn)[12-14]報道，姜黃素可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號因子影響病毒的增殖。本研究檢測了經(jīng)姜黃素處理與未處理的被MDV感染CEF細(xì)胞中的IL-1β、IL-6、IFN-β、ISG12-2、Mx-1和OASL等細(xì)胞因子的表達(dá)水平，見圖6。結(jié)果顯示，姜黃素處理組中，IFN-β、ISG12-2 、Mx-1和OASL表達(dá)水平明顯下降，而炎癥相關(guān)因子IL-1β和IL-6表達(dá)水平顯著升高。

3 討論

馬立克氏病是MDV引起的一種高度接觸傳染性、淋巴組織增生性疾病。該病是第一個可以用疫苗預(yù)防的腫瘤性疾病[2]。但到目前為止，還沒有有效的方法可以完全治療患病雞，阻止病毒在體內(nèi)復(fù)制，只能通過疫苗免疫雞群來控制疾病的發(fā)生。藥物抗病毒可減少病毒在體內(nèi)的復(fù)制，有研究表明，姜黃素通過不同機制發(fā)揮抗病毒活性，這些機制涉及直接抑制病毒復(fù)制機制或抑制病毒復(fù)制所必需的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑。已有研究表明，姜黃素通過影響CHIKV、ZIKV、HCV、BoHV-1和PRRSV囊膜的流動性干擾病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合抑制病毒感染[5-7,15]，或者通過影響細(xì)胞內(nèi)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)或細(xì)胞凋亡過程來降低JEV、DENV、CVB3的感染性[12-14]，此外姜黃素還通過顯著影響HSV-1 IE基因表達(dá)，從而降低了HSV-1啟動裂解感染周期的能力[8]。

圖2 姜黃素抑制病毒基因表達(dá)呈劑量依賴性Fig.2 Inhibition of virus replication by Curcumin in a dose dependent manner

圖3 姜黃素抑制病毒復(fù)制呈時間依賴性Fig.3 Inhibition of virus replication by Curcumin in a time dependent manner

本研究結(jié)果表明，姜黃素能劑量和時間依賴性的抑制MDV基因的表達(dá)以及病毒在CEF中的增殖，這些結(jié)果與以往姜黃素抑制BoHV-1、ZIKV和CHIKV在細(xì)胞中的復(fù)制結(jié)果相似[6-7]，提示姜黃素對家禽病毒也同樣具有一定的抑制作用。不同時間點加入姜黃素的實驗結(jié)果顯示，病毒在細(xì)胞吸附階段抑制作用最顯著，這或許和藥物能直接影響MDV的感染性有關(guān)，這與姜黃素抑制IAV病毒吸附和后期復(fù)制階段類似[16]。由于MDV感染細(xì)胞的受體及傳播機制還未明晰，所以姜黃素抑制病毒吸附細(xì)胞的具體機制有待日后深入研究。以往報道顯示姜黃素可以通過調(diào)控細(xì)胞信號因子的表達(dá)而影響病毒的復(fù)制，例如姜黃素通過調(diào)控宿主細(xì)胞泛素蛋白體系統(tǒng)及細(xì)胞凋亡相關(guān)過程影響病毒復(fù)制[12-14]。本研究選擇了部分抗病毒細(xì)胞因子及炎癥相關(guān)因子進(jìn)行realtime PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)常見的抗病毒因子都隨著病毒復(fù)制減少而降低，而炎癥因子IL-6和IL-1β卻相反，顯著升高，提示炎癥反應(yīng)可能與MDV的復(fù)制相關(guān)，其中具體機制還有待進(jìn)一步研究。在動物體內(nèi)實驗中，姜黃素口服給藥在小鼠模型中顯示出抗癌作用；在巨細(xì)胞病毒感染的模型中，姜黃素胃內(nèi)給藥顯著降低了病毒DNA載量和IgM水平，表明姜黃素在體內(nèi)抗病毒活性的潛力[17]；未來姜黃素通過口服給藥預(yù)防體內(nèi)MDV的劑量及安全性還需要今后的體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)來確定。本研究結(jié)果表明，姜黃素以劑量和時間依賴的方式抑制MDV在CEF細(xì)胞中的復(fù)制。此外，姜黃素還通過直接影響病毒的感染性來抑制MDV在CEF細(xì)胞中的復(fù)制。這些結(jié)果提示，中藥姜黃素具有開發(fā)為抗MDV有效藥物的潛力。

圖4 姜黃素在不同加入時間抑制 MDV增殖的作用Fig.4 Antiviral effects of Curcumin on MDV proliferation at different time points

圖5 姜黃素直接影響MDV的感染性Fig. 5 Direct virucidal activity of Curcumin on MDV

圖6 姜黃素對MDV感染CEF細(xì)胞因子表達(dá)影響Fig.6 Effects of Curcumin on cytokines expression in MDV infected cells