沈文敏，陶鈺榮，張 琳，孟令嬌，劉 麗，劉樹真

（山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東省動(dòng)物抗性生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014）

多氯聯(lián)苯（polychlorinated biphenyls，PCB）又稱氯化聯(lián)苯，是20世紀(jì)70年代人工合成的一種環(huán)境雌激素類的持久性有機(jī)污染物。PCB可在大氣、水和土壤中循環(huán)，遍布全球，其在空氣、水、沉積物、魚類、野生動(dòng)物及人體脂肪組織和血清中都有檢出［1-4］。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將PCB歸類為“第一類人類致癌物”［5］，其可分為類二噁英和非類二噁英同系物2大類。

2，3’，4，4’，5-五氯聯(lián)苯（2，3’，4，4’，5-penta?chlorobiphenyl，PCB118）屬于類二噁英類PCB的一種［6］，具有強(qiáng)穩(wěn)定性和親脂性，可在動(dòng)物脂肪中積累，并通過食物鏈進(jìn)行生物富集。與其他PCB同系物相比，PCB118的毒性較強(qiáng)［7］。PCB118與芳香烴受體結(jié)合后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白（aryl hydrocarbon receptor nuclear transportor，ARNT）形成異源二聚體［8］，識(shí)別并結(jié)合靶基因上游區(qū)的生物異源物質(zhì)效應(yīng)元件，并與相關(guān)因子結(jié)合，導(dǎo)致下游基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)異常，引發(fā)毒性效應(yīng)［9-12］。

研究表明，PCB可降低雄性大鼠精子數(shù)量和活力，影響精子發(fā)生過程［13-14］。流行病學(xué)調(diào)查也證實(shí)這一點(diǎn)［15-16］。睪酮可與雄激素受體（androgen receptor，AR）結(jié)合，參與曲細(xì)精管生精上皮的維持和精子發(fā)生進(jìn)程，對(duì)機(jī)體雄性化、個(gè)體發(fā)育和男性生育力的維持起重要作用［17-18］。研究發(fā)現(xiàn)，睪酮合成通路的改變與PCB的毒性作用有關(guān)。例如，大鼠哺乳期暴露PCB的商品化混合物——Aroclor 1254，導(dǎo)致出生后60 d的子代雄鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中睪酮合成相關(guān)酶的表達(dá)降低，致使血清睪酮水平下降［19］。Aroclor 1254暴露的體外實(shí)驗(yàn)也得到類似結(jié)果［20］。以往研究大多針對(duì)PCB的混合物對(duì)精子和（或）睪酮的影響，PCB單體在此方面的研究較少，迄今未見PCB118對(duì)精子發(fā)生與睪酮合成通路的影響及其關(guān)系的研究報(bào)道。本研究根據(jù)越南人每日從食品中攝入PCB的量換算成小鼠每日暴露劑量（即500 μg·kg-1）［21-23］，通過檢測(cè)PCB118暴露對(duì)青春期ICR雄鼠睪酮合成過程和精子生成的影響，探索PCB118影響精子發(fā)生過程的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

PCB118，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度≥99.8%；玉米油，美國(guó)Sigma公司；碘［125I］睪酮放射免疫分析試劑盒，天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Q711-02/03）、HiS?cript?ⅡQ Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（R233-01）和ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（E412-01），南京諾唯贊生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒（ZLI-9017），北京中杉金橋生物科技有限公司；兔抗小鼠AR單克隆抗體（ab133273），美國(guó)Abcam公司；兔抗小鼠增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體（13110），美國(guó)CST公司；兔抗小鼠α微管蛋白單克隆抗體，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔（H+L）IgG（ZB-5301），北京中杉金橋生物科技有限公司。冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher公司；數(shù)字切片掃描儀，匈牙利3DHISTECH公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；凝膠成像儀，北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司；熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀，美國(guó)Roche公司；精子活力分析儀，德國(guó)Minitube公司；GC-911 γ放射免疫計(jì)數(shù)器，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

1.2 動(dòng)物和分組

36只SPF級(jí)雄性ICR小鼠，3周齡，體質(zhì)量14～16 g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（魯）2019-0003。飼養(yǎng)環(huán)境室溫20～24℃，相對(duì)濕度40%～50%，12 h/12 h晝夜明暗交替，小鼠自由飲水、攝食。

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后的小鼠隨機(jī)分為3組：溶媒（玉米油）對(duì)照組和PCB118（50和500 μg·kg-1）組，每組12只。分別ig給予不同劑量PCB118或等體積溶媒，每日1次，連續(xù)4周。期間每日稱量小鼠體質(zhì)量，染毒結(jié)束次日，ip給予3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，心臟穿刺取血，全血室溫放置2～3 h，先后以1 246×g和312×g室溫離心3 min，收集血清，于-80℃保存。處死小鼠后，迅速取睪丸、附睪、肝、腎和脾稱重，附睪立即用于精子質(zhì)量檢測(cè)，左側(cè)睪丸于-80℃保存，右側(cè)睪丸放入Bouin’s固定液用于組織切片分析。

1.3 體質(zhì)量和臟器系數(shù)的測(cè)定

計(jì)算實(shí)驗(yàn)前后雄鼠體質(zhì)量之差，記作體質(zhì)量增長(zhǎng)量。臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100。

1.4 HE染色觀察睪丸組織病理?yè)p傷

將右側(cè)睪丸放入Bouin’s固定液固定24～48 h，用石蠟包埋，制備5 μm組織切片。切片經(jīng)HE染色后，用數(shù)字切片掃描儀拍照，觀察組織病理學(xué)改變，隨機(jī)選取不同視野，用Case Viewer軟件統(tǒng)計(jì)50個(gè)曲細(xì)精管的直徑、生精上皮的厚度和15個(gè)曲細(xì)精管中精原細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目（相對(duì)數(shù)目=精原細(xì)胞數(shù)/曲精細(xì)管直徑）。

1.5 精子數(shù)、精子活力和精子畸形率檢測(cè)

將1 mL體外受精培養(yǎng)液置于37℃CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)熱0.5 h，使用前1 h加入人血清白蛋白。將小鼠左側(cè)附睪尾用生理鹽水清洗后置于體外受精培養(yǎng)液中，將附睪尾剪碎，37℃溫育15 min，取適量上層精子懸液稀釋，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板記數(shù)精子數(shù)。取5 μL上層精子懸液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，于精子活力分析儀中自動(dòng)檢測(cè)精子活力（即精子快速前進(jìn)、緩慢前進(jìn)、環(huán)狀移動(dòng)和原地移動(dòng)的活力之和）。取右側(cè)附睪尾置于1 mL 37℃預(yù)熱的0.9%生理鹽水中并剪碎，于CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育10 min，取20 μL上層精子懸液，在載玻片上均勻涂片，室溫自然干燥，75%乙醇固定10 min，隨后加入0.5%伊紅染液染色15 min，去離子水緩慢沖洗多余染液，室溫中自然晾干，每份精液樣品制片3張，于顯微鏡下隨機(jī)取不少于1000個(gè)精子，記錄無鉤、香蕉型、胖頭、雙頭、雙尾、尾折疊和無定型7種類型畸形精子的數(shù)目，計(jì)算精子畸形率。

1.6 放射免疫法檢測(cè)血清睪酮水平

取1.2收集的小鼠血清，根據(jù)碘［125I］睪酮放射免疫分析藥盒說明書進(jìn)行操作，用GC-911 γ放射免疫計(jì)數(shù)器測(cè)得睪酮水平，每份樣品重復(fù)3次。

1.7 RT-qPCR法檢測(cè)睪酮合成相關(guān)酶和Ar mRNA水平

用Trizol法提取小鼠睪丸組織總RNA，參照HiScript?ⅡQ Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒步驟合成cDNA，參照 ChamQ Uni?versal SYBR qPCR Master Mix試劑盒步驟進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。除內(nèi)參的引物應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)外，其余基因引物序列來源于文獻(xiàn)［24］，引物序列見表1。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，經(jīng)PAGE純化，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 Western印跡法檢測(cè)睪丸組織中AR和PCNA蛋白表達(dá)

取30 mg冰凍睪丸組織放入預(yù)冷的200 μL RIPA裂解液中，冰上勻漿后，超聲處理（每次1 min，重復(fù)3次），4℃ 18 845×g離心10 min，取上清，用BCA法蛋白定量后，取80 μg總蛋白在5%濃縮膠和10%的分離膠中電泳后，轉(zhuǎn)膜2 h。用脫脂奶粉封閉1 h，一抗〔AR 和 PCNA（1∶3000）、α 微管蛋白（1∶5000）〕4℃搖床孵育過夜，二抗〔AR（1∶5000）、PCNA（1：10 000）〕室溫?fù)u床孵育2 h，用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯色，并通過凝膠成像儀拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行積分吸光度分析，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)睪丸組織中AR和PCNA蛋白表達(dá)

將睪丸組織切片55℃烘烤后脫蠟、復(fù)水，用檸檬酸鹽修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，用1% BSA 37℃封閉1 h，一抗〔AR（1∶200）、PCNA（1∶4000）〕4℃孵育過夜，二抗（1∶200）室溫孵育40 min，用DAB顯色試劑盒顯色，在顯微鏡下觀察信號(hào)強(qiáng)弱，3～5 min左右停止顯色。經(jīng)蘇木素染核、分化、反藍(lán)、脫水后，用樹膠封片，用數(shù)字切片掃描儀拍照，隨機(jī)選取8個(gè)視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行光密度分析，以平均光密度值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PCB118暴露對(duì)小鼠體質(zhì)量和臟器系數(shù)的影響

與溶媒對(duì)照組相比，PCB118 50和500 μg·kg-1組體質(zhì)量增長(zhǎng)量及睪丸、附睪、腎和脾系數(shù)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2），但PCB118 500 μg·kg-1組肝系數(shù)明顯下降（P＜0.01），提示PCB118對(duì)雄鼠造成一定程度的肝損傷。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

Tab.2 Effect of PCB118 on body mass gain and organ coefficient in male mice

2.2 PCB118暴露對(duì)小鼠睪丸病理結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果（圖1）顯示，與溶媒對(duì)照組相比，PCB118 2個(gè)劑量組睪丸組織均出現(xiàn)精原細(xì)胞缺失和曲細(xì)精管空泡化現(xiàn)象。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，曲細(xì)精管直徑、生精上皮細(xì)胞厚度和精原細(xì)胞相對(duì)數(shù)目均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.1 Histological analysis of testis in male mice treated with PCB118 by HE staining（×400）.See Tab.2 for the mouse treatment.The arrows in the Fig.A indicate the vacuolation of seminiferous epithelium in seminiferous tubules.Relative number of spermatogonia=number of spermatogonia/the diameter of seminiferous tubules.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with vehi?cle control group.

2.3 PCB118暴露對(duì)小鼠精子質(zhì)量的影響

附睪中精子質(zhì)量分析結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，與溶媒對(duì)照組相比，PCB118 50和500 μg·kg-1組精子數(shù)量均顯著下降（P＜0.05），精子畸形率均顯著升高（P＜0.05），總精子活力雖然呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Tab.3 Effect of PCB118 on sperm quality in male mice

2.4 PCB118對(duì)血清睪酮水平的影響

血清睪酮水平分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與溶媒對(duì)照組〔（6.04±2.04）μg·L-1〕相比，PCB118 50和500 μg·kg-1組小鼠血清睪酮水平〔（3.47±0.60）μg·L-1和（2.90±0.55）μg·L-1〕均顯著降低（P＜0.05）。

2.5 PCB118對(duì)睪酮合成相關(guān)酶和Ar mRNA水平的影響

與溶媒對(duì)照組相比，小鼠睪丸組織中類固醇合成急性調(diào)節(jié)酶（steroidogenic acute regulatory，Star）、膽固醇側(cè)鏈裂解酶（cholesterol side-chain cleav?age enzyme，Cyp11a1）、3β-羥基類固醇脫氫酶（3beta-hydroxysteroid dehydrogenase，Hsd3b1）、17-20裂解酶（cytochrome P450 17α-hydroxylase/17，20-lyase，Cyp17a1）、17β-羥基類固醇脫氫酶（17beta-hydroxysteroid dehydrogenase，Hsd17b1）5種與睪酮合成相關(guān)酶和Ar的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）（圖2）。

Fig.2 Effect of PCB118 on mRNA levels of testosterone synthesis-related enzymes and Ar in testis.See Tab.2 for the mouse treatment.±s，n=6.＊P＜0.05，compared with vehicle control group.

2.6 PCB118對(duì)睪丸組織AR和PCNA蛋白表達(dá)的影響

Western印跡法（圖3）和免疫組織化學(xué)（圖4）檢測(cè)結(jié)果表明，與溶媒對(duì)照組相比，PCB118 50和500 μg·kg-1組睪丸組織AR和PCNA蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.3 Effect of PCB118 on protein expression of AR and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in testis by Western blotting.See Tab.2 for the mouse treatment.C was the semi-quantitative result of A and B.±s，n=6.＊P＜0.05，compared with vehicle control group.

Fig.4 Effect of PCB118 on protein expressions of AR and PCNA in testis by immunohistochemistry.See Tab.2 for the mouse treatment.B and C were the semi-quantita?tive results of A.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with vehi?cle control group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，青春期雄鼠暴露于與日常欽食攝入量相當(dāng)?shù)牡蛣┝縋CB118（50～500 μg·kg-1）時(shí)，小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)量及睪丸、附睪、腎和脾系數(shù)未出現(xiàn)顯著變化，表明PCB118對(duì)雄鼠的生長(zhǎng)發(fā)育未造成病理性影響。然而，本研究中PCB118使雄鼠睪丸組織出現(xiàn)精原細(xì)胞缺失、曲細(xì)精管空泡化、曲細(xì)精管直徑顯著減小、生精上皮厚度明顯減小和精原細(xì)胞相對(duì)數(shù)目明顯降低的現(xiàn)象，表明青春期低劑量暴露PCB118可對(duì)雄鼠睪丸造成損傷。有研究報(bào)道，Aroclor 1254混合物500 μg·kg-1造成雄鼠睪丸組織曲細(xì)精管中生精細(xì)胞間隙增大［25］。在本研究中，同等劑量的PCB118單體也對(duì)睪丸組織造成損害，說明PCB118單體對(duì)睪丸的毒性作用較強(qiáng)。本研究還發(fā)現(xiàn)精子數(shù)量顯著降低，精子畸形率顯著升高，而精子數(shù)量的降低可能與精原細(xì)胞減少和睪丸空泡化相關(guān)。

睪酮作為關(guān)鍵的雄激素對(duì)精子發(fā)生的起始和維持發(fā)揮關(guān)鍵作用［26］。睪酮合成通路中有StAR，CYP11A1，3β-HSD，CYP17A1和17β-HSD等多種酶的參與［27］。其中StAR和CYP11A1是睪酮合成過程中關(guān)鍵的限速酶［28-29］。研究報(bào)道，血清或睪丸內(nèi)睪酮水平的異常降低會(huì)引起睪丸萎縮，并伴有生殖細(xì)胞數(shù)量的減少［30］。成年期雄鼠暴露高劑量PCB會(huì)對(duì)其睪酮水平及睪酮合成產(chǎn)生影響［31］，母鼠哺乳期暴露PCB也會(huì)抑制F1代雄鼠睪酮合成［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，青春期小鼠低劑量暴露PCB118使上述睪酮合成相關(guān)酶mRNA表達(dá)水平均顯著下降，提示血清睪酮水平的下降可能是這些酶的基因表達(dá)水平下降所致。

在雄性哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中，睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮。睪酮作用的經(jīng)典和非經(jīng)典途徑都需要通過AR介導(dǎo)以調(diào)控精子發(fā)生過程［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，PCB118 2個(gè)劑量組均造成睪丸中AR蛋白表達(dá)水平顯著降低。睪丸中缺乏AR會(huì)對(duì)精子發(fā)生過程產(chǎn)生損害［33］，精母細(xì)胞數(shù)量明顯減少且無法完成減數(shù)分裂及形成圓形精子細(xì)胞［26，34-35］。本研究發(fā)現(xiàn)，PCB118引起血清睪酮水平和AR蛋白表達(dá)水平顯著降低，從而影響AR介導(dǎo)的睪酮對(duì)精子發(fā)生過程的調(diào)控。

睪丸的生長(zhǎng)發(fā)育過程實(shí)際上也是生精細(xì)胞分裂、分化、動(dòng)態(tài)更新的過程，精子發(fā)生受細(xì)胞增殖與凋亡動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)［36］。PCNA蛋白在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)中起關(guān)鍵作用，參與生精細(xì)胞增殖過程中DNA的復(fù)制，是評(píng)估生殖細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的重要分子標(biāo)志物［37］。該蛋白表達(dá)水平可評(píng)估睪丸生精功能，包括生精細(xì)胞的增殖［38］。本研究發(fā)現(xiàn)，青春期雄鼠PCB118暴露導(dǎo)致PCNA蛋白表達(dá)水平下降，與文獻(xiàn)［25］報(bào)導(dǎo)的PCB使小鼠睪丸PCNA表達(dá)水平下降一致。精子發(fā)生過程中，生精細(xì)胞的增殖受AR介導(dǎo)的睪酮合成通路的調(diào)控［39］。因此，雄鼠PCB118暴露導(dǎo)致睪酮水平降低，影響AR介導(dǎo)的生精細(xì)胞的增殖過程，從而引起精子質(zhì)量下降，并通過影響PCNA進(jìn)而影響生精細(xì)胞DNA的復(fù)制。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，青春期雄鼠暴露于PCB118后血清睪酮水平下降，精子質(zhì)量降低，其機(jī)制可能與睪酮合成相關(guān)酶基因水平下調(diào)，AR蛋白和基因表達(dá)降低，及PCNA蛋白表達(dá)下降有關(guān)。PCB118是否影響下丘腦-垂體-性腺軸以及其他與生精細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路，從而作用于精子發(fā)生過程，還需深入研究。