盧鳳鳳，周培嵐，蘇瑞斌

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

腎上腺素受體（adrenergic receptor，AR）包括α1-AR，α2-AR和β-AR，屬于G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）超家族。α2-AR在藥理學(xué)上又分為α2A，α2B和α2C3種亞型，分別位于10，2和4號(hào)染色體上。研究發(fā)現(xiàn)，嚙齒類動(dòng)物的α2D-AR在氨基酸序列上與人α2A-AR有高度同源性，是α2A-AR的種屬變體，故被列為α2A-AR亞型［1］。

α2A-AR主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，如藍(lán)斑外側(cè)、臂旁核、腦橋核、海馬旁回和大腦皮質(zhì)等；α2B-AR主要分布在外周組織，如腎、肝、肺、心及血管組織等，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中只存在于丘腦核團(tuán)和腦干孤束核；α2C-AR主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，如紋狀體、嗅球、海馬和大腦皮質(zhì)等，但表達(dá)量遠(yuǎn)小于α2A-AR［2-4］。研究表明，α2-AR介導(dǎo)的鎮(zhèn)靜、麻醉催眠等作用主要通過中樞α2A-AR發(fā)揮作用，但少量分布在脊髓的α2A-AR可介導(dǎo)鎮(zhèn)痛；α2B-AR主要參與外周血管的收縮；α2C-AR參與調(diào)節(jié)多種腦功能，如感覺運(yùn)動(dòng)整合和應(yīng)激反應(yīng)［5］。

1 α2腎上腺素受體關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)

1.1 保守性關(guān)鍵受體氨基酸位點(diǎn)

1.1.1 3.32位天冬氨酸（aspartic acid，Asp）3.32關(guān)鍵位點(diǎn)

對(duì)于經(jīng)典的保守性氨基酸殘基，如α2-AR的Asp3.32在已知與胺配體結(jié)合的所有GPCR中是保守的，激動(dòng)劑的陽離子氮在α2A-AR，α2B-AR和α2C-AR 3種亞型中與帶負(fù)電荷的Asp羧酸鹽側(cè)鏈形成鹽橋［6-7］，兒茶酚胺類配體的β-OH基團(tuán)與Asp殘基之間相互作用，一系列咪唑啉衍生物配體的陽離子基團(tuán)與Asp3.32相互作用［8］。若用天冬酰胺（asparagi?nate，Asn）取代Asp3.32則可消除受體以高親和力結(jié)合育亨賓的能力，且降低激動(dòng)劑抑制cAMP的作用。以上研究表明，α2-AR的Asp3.32在高親和力配體結(jié)合及受體功能中至關(guān)重要。

1.1.2 絲氨酸（serine，Ser）5.42和Ser5.46關(guān)鍵位點(diǎn)

位于受體第5跨膜區(qū)（transmembrane 5，TM5）中的2個(gè)保守絲氨酸殘基Ser5.42和Ser5.46與兒茶酚胺羥基形成氫鍵作用，Ser5.42與兒茶酚胺環(huán)的meta-OH基團(tuán)相互作用，而Ser5.46通過para-OH基團(tuán)形成氫鍵，有助于穩(wěn)定活性受體的構(gòu)象［7，9］。定點(diǎn)突變研究發(fā)現(xiàn)，α2-AR的Ser5.46與兒茶酚胺的對(duì)羥基結(jié)合，而β2-AR的Ser5.46與兒茶酚胺的間羥基形成氫鍵作用［10］，但Ser5.46位點(diǎn)在 α1A-AR，α1B-AR，α1C-AR，α2A-AR，α2B-AR，α2C-AR，β1-AR，β2-AR和β3-AR 9種AR中高度保守［11-12］。Ser5.42和Ser5.46突變?yōu)榘腚装彼幔鰪?qiáng)α2-AR與UK14，304的部分親和力，但降低兒茶酚胺激活α2-AR的能力［13］。

以上3個(gè)保守性氨基酸殘基可形成受體的分子對(duì)接中心［6］（圖1），對(duì)于α2-AR 3種亞型受體的結(jié)構(gòu)研究至關(guān)重要。

圖1 α2A腎上腺素受體（左）、α2B腎上腺素受體（中）、α2C腎上腺素受體（右）與配體的分子對(duì)接圖［6］

1.1.3 Asp2.50關(guān)鍵位點(diǎn)

Asp2.50在94%的A類GPCR中是保守的，且是跨膜區(qū)埋腔的一部分，盡管Asp2.50不直接參與與配體的結(jié)合，但已被證明參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及受體激活相關(guān)的構(gòu)象變化［14-15］，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，Asp2.50附近的水分子保守簇與保守殘基之間的相互作用參與受體激活［16-17］。Asp突變?yōu)锳sn會(huì)降低α2-AR與激動(dòng)劑的親和力，且會(huì)導(dǎo)致受體與K+通道選擇性解偶聯(lián)［18］。以上提示Asp2.50參與α2-AR的功能變化，雖然目前該受體晶體結(jié)構(gòu)尚未被解析，但Asp2.50可能是參與晶體結(jié)構(gòu)解析并參與受體活化的微開關(guān)［19］。

1.2 非保守性關(guān)鍵受體氨基酸位點(diǎn)

近期研究表明，通過α2-AR 3種亞型受體的分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)某些非保守性氨基酸位點(diǎn)可能是α2-AR所特有的，并可能指導(dǎo)今后α2-AR的高選擇性藥物研發(fā)。

1.2.1 不同于 β腎上腺素受體的非保守性關(guān)鍵受體氨基酸位點(diǎn)

α2A-AR 的酪氨酸（tyrosine，Tyr）6.55、半胱氨酸（cysteine，Cys）5.43、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）7.39等非保守性氨基酸可能參與受體的功能發(fā)揮。Tyr6.55與腎上腺素、去甲腎上腺素等激動(dòng)劑形成氫鍵，當(dāng)Tyr6.55突變?yōu)锳sn，取消了α2A-AR所介導(dǎo)的雙重效應(yīng)［20］，而在β受體（β1和β2受體）中，該位置的殘基是Asn，并認(rèn)為Asn與其配體形成的氫鍵作用是激活β受體的標(biāo)志［21］。UK14，304通過與暴露在結(jié)合腔中的Cys5.43的巰基側(cè)鏈形成共價(jià)鍵，介導(dǎo)受體失活，而在Ser突變體中，受體與配體的親和力降低［9］。α2A-AR的Phe7.39通過 π-π 鍵與胍基苯和UK14，304等激動(dòng)劑相互作用［22-23］，然而β2受體的Asn通過氫鍵作用與配體結(jié)合，當(dāng)α2A-AR的Phe7.39突變?yōu)锳sn時(shí)，對(duì)β2受體的2種選擇性配體沙美特羅和沙丁胺醇無反應(yīng)，提示Phe7.39位點(diǎn)有可能是α2-AR與激動(dòng)劑結(jié)合的特異性位點(diǎn)［23］。

1.2.2 α2-AR 3種亞型間的非保守性關(guān)鍵受體氨基酸位點(diǎn)

位于第2個(gè)細(xì)胞外環(huán)（extracellular loop 2，ECL2）的谷氨酰胺（glutamine，Gln）以及Gln7.36等非保守性氨基酸可能為設(shè)計(jì)α2B-AR的選擇性配體化合物提供新方向。α2A-AR和α2C-AR在ECL2的Asp通過帶負(fù)電荷的側(cè)鏈羧基與帶正電荷的配體形成穩(wěn)定的鹽橋作用，而α2B-AR在ECL2的Gln可通過氫鍵與配體的羥基結(jié)合。位于α2B-AR的Gln7.36也存在相似的氨基酸關(guān)聯(lián)，而位于α2A-AR和α2C-AR該位點(diǎn)的是帶正電荷的賴氨酸，不能通過氫鍵作用與配體的羥基結(jié)合［23］。

α2C-AR選擇性拮抗劑JP1302中帶正電荷的胺基與AspECL2形成鹽橋，并且與Tyr6.58形成陽離子-π相互作用，α2C-AR 具有由 AspECL2、精氨酸（argi?nine，Arg）ECL3和Tyr6.58形成的特殊交互網(wǎng)絡(luò)，而該網(wǎng)絡(luò)在α2B-AR和α2C-AR中不存在。α2C-AR三重突變體D206A/R409A/Y405T取消了選擇性拮抗劑JP1302的拮抗功能，表明3個(gè)非保守性關(guān)鍵受體氨基酸位點(diǎn)對(duì)于α2C-AR的亞型選擇性至關(guān)重要［11］。關(guān)于α2-AR亞型選擇性的重要氨基酸位點(diǎn)仍需進(jìn)一步探索。

2 基于 α2腎上腺素受體關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的藥物研究

2.1 基于關(guān)鍵受體氨基酸位點(diǎn)的藥物篩選

研究發(fā)現(xiàn)，在α2A-AR突變體介導(dǎo)的鈣離子反應(yīng)中，激動(dòng)劑右美托咪定和可樂定等對(duì)受體的最大激活幅度不受Asp2.50突變的影響，UK 14304和羥甲唑啉的最大幅度均顯著降低，BHT 920可誘導(dǎo)更高的鈣離子響應(yīng)；拮抗劑在α2A-AR D79N突變體中對(duì)鈣離子的響應(yīng)值由強(qiáng)到弱順序?yàn)椋喊⑻孢哌颍綛RL 44408=咪唑克生≈SKF 86466＞地塞米松。而在α2A-AR突變體T373K中，不同的激動(dòng)劑與拮抗劑引起鈣離子的反應(yīng)與79位突變體有所不同［24］，說明Asp79和373位蘇氨酸在α2A-AR藥物篩選中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這為今后指導(dǎo)臨床用藥奠定理論基礎(chǔ)。α2-AR除了介導(dǎo)鎮(zhèn)痛、麻醉等藥理作用外，本實(shí)驗(yàn)室研究還發(fā)現(xiàn)α2-AR也可介導(dǎo)致死性毒性作用（待發(fā)表），但目前針對(duì)該受體介導(dǎo)致死性毒性作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)尚未報(bào)到，而針對(duì)該關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的拮抗性藥物篩選更是未見報(bào)道。

2.2 基于關(guān)鍵受體氨基酸位點(diǎn)的臨床藥物研究

對(duì)α2-AR選擇性激動(dòng)劑的鎮(zhèn)痛和麻醉特性的研究已有幾十年的歷史，開發(fā)這些激動(dòng)劑的臨床應(yīng)用仍然是一個(gè)令人感興趣的領(lǐng)域，特別是作為疼痛治療的佐劑和麻醉劑［25］。研究發(fā)現(xiàn)，α2-AR激動(dòng)劑與阿片類激動(dòng)劑在鎮(zhèn)痛方面具有協(xié)同作用，這是臨床疼痛管理中的一個(gè)重要特性，因?yàn)閰f(xié)同作用使劑量降低，可能使副作用最小化，尤其在治療慢性阿片類不敏感疼痛狀態(tài)方面［26-28］。與野生型小鼠相比，在D79N突變小鼠中，α2A-AR激動(dòng)劑UK14303或右美托咪定與阿片類激動(dòng)劑DAMGO聯(lián)合應(yīng)用，兩者抗傷害或鎮(zhèn)痛的協(xié)同作用消失，表明α2A-AR的Asp2.50對(duì)這種相互作用是必要的［29］?？蓸范ㄅc右美托咪定的聯(lián)用，在野生型小鼠中表現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛協(xié)同作用，然而在α2A-AR D79N突變小鼠中此協(xié)同作用消失，說明Asp79對(duì)于受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用至關(guān)重要，而且α2-AR激動(dòng)劑除了與阿片受體激動(dòng)劑聯(lián)合應(yīng)用外，不同的α2-AR激動(dòng)劑之間也可聯(lián)用［27］。目前，基于α2-AR關(guān)鍵受體氨基酸位點(diǎn)的臨床藥物研究較少，仍需進(jìn)一步研究。

3 α2腎上腺素受體與配體相互作用的常用研究方法

3.1 受體與配體相互作用的結(jié)合口袋

α2-AR 3種亞型分別有由450，450和461個(gè)氨基酸殘基組成，N端有2個(gè)糖基化位點(diǎn)，與一般GPCR結(jié)構(gòu)相似，為7次跨膜結(jié)構(gòu)，7條跨膜束由3條細(xì)胞內(nèi)單環(huán)和3條細(xì)胞外單環(huán)首尾相連，7個(gè)疏水性跨膜區(qū)中的氨基酸序列在α2-AR的3種亞型受體中高度保守，但第3胞內(nèi)環(huán)較長，其氨基酸序列在各亞型間存在較大的異質(zhì)性，胞外區(qū)與配基識(shí)別有關(guān)［30］。每個(gè)跨膜區(qū)由20～26個(gè)氨基酸形成α螺旋，并形成對(duì)鑒定和結(jié)合配體分子至關(guān)重要的口袋。目前研究表明，疏水性氨基酸形成的“口袋”就是受體結(jié)合配體的關(guān)鍵部位，該“口袋”結(jié)構(gòu)也被稱為“結(jié)合口袋”。結(jié)合口袋是研究受體和配體相互作用的重點(diǎn)關(guān)注部位，決定著與配體結(jié)合的特異性。

3.2 同源模建和分子對(duì)接

獲得該結(jié)合口袋處的對(duì)接信息可輔助確定與配體結(jié)合特異性有關(guān)的氨基酸位點(diǎn)。α2-AR作為GPCR超家族的成員之一，具有GPCR的一般特性，即不溶于水，自然豐度大，在溶劑中不易穩(wěn)定存在，結(jié)晶難度較大［31］。晶體結(jié)構(gòu)對(duì)明晰其與配體之間的相互作用意義重大，但α2-AR晶體結(jié)構(gòu)尚未被成功解析。生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域的應(yīng)用有助于解決這一問題［32］。

具體研究方法有：①同源模建法：首先確定模板，采用單序列或多序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建基于模板3D結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)模型，獲取建模蛋白序列的空間結(jié)構(gòu)；② 分子動(dòng)力學(xué)（molecular dynamics，MD）模擬：采用分子力學(xué)與MD的方法，根據(jù)物理化學(xué)基本原理，從理論上計(jì)算蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)［33］。一般GPCR經(jīng)過同源模建后需要進(jìn)行MD模擬優(yōu)化，MD模擬方法有2種，一種是先構(gòu)建蛋白與脂水膜體系，然后用MD研究整個(gè)蛋白-膜-水體系；另一種是構(gòu)建蛋白-水體系，主要用來研究配體結(jié)合性［34］。模型建立后，將目標(biāo)受體與配體進(jìn)行分子對(duì)接，是受體空腔與配體小分子進(jìn)行相互識(shí)別的過程，它們的識(shí)別過程遵循幾何能量匹配和化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)的原則，首先通過搜尋受體分子結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)，將小分子置于活性口袋中，然后分子對(duì)接程序計(jì)算活性中心的各個(gè)方位，打分函數(shù)搜尋小分子的最佳結(jié)合方式［35］。生物信息學(xué)方法雖可高效率地預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白與配體的相互作用模式，但確證這些關(guān)鍵受體氨基酸位點(diǎn)仍需定點(diǎn)突變這樣的生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

4 展望

α2-AR是介導(dǎo)麻醉鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和催眠的重要靶點(diǎn)之一，明確其發(fā)揮生理及藥理作用的關(guān)鍵受體氨基酸位點(diǎn)有助于α2-AR高選擇性靶點(diǎn)藥物研發(fā)，降低藥物的不良反應(yīng)，為今后在臨床的藥物應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。α2-AR的保守性關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)研究逐漸偏向非保守性關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，可能是未來研發(fā)亞型高選擇性藥物的微開關(guān)。目前，已有研究證明了α2-AR與其配體相互作用的某些關(guān)鍵受體氨基酸位點(diǎn)，但大多數(shù)研究主要關(guān)注單個(gè)氨基酸位點(diǎn)的關(guān)鍵性作用。實(shí)際上，受體結(jié)合口袋的不同氨基酸殘基與不同配體之間的作用既有相似之處，又有差別，單一氨基酸的改變可能會(huì)影響受體構(gòu)象的改變，也有可能需要多個(gè)氨基酸同時(shí)改變影響受體構(gòu)象變化，從而引起受體功能的改變，聯(lián)合突變研究可能為探索關(guān)鍵的受體氨基酸位點(diǎn)提供新反向。