西仁阿依·西熱甫，雷秀英，張 瑜，伊力亞斯·艾薩，木塔力甫·艾買提，5，陳 倩，馮學(xué)召，李 飛，4，米 娜

（新疆醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院，2.第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，5.中心實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830011；4.中國藥科大學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童常見的顱外實(shí)體瘤，屬于胚胎性惡性腫瘤，在全世界兒童實(shí)體腫瘤發(fā)病率中位居第二，僅次于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占所有兒童惡性腫瘤總發(fā)病率的8%～10%［1-2］。神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種復(fù)雜的疾病，從轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到自發(fā)消退，其臨床過程不盡相同，1歲以上患兒出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性病灶的幾率較高，而1歲以下患兒卻往往呈現(xiàn)腫瘤自發(fā)消退的趨勢［3-4］。該病治愈率在低風(fēng)險患兒中＞90%，而在高風(fēng)險者中則＜50%，呈現(xiàn)極大差異［5］。

鹽酸去氫駱駝蓬堿（harmine hydrochloride，HMH）是自然界中豐富存在的β-咔啉類生物堿類去氫駱駝蓬堿（harmine，HM）的鹽酸鹽。研究表明，HM具有明顯的抗腫瘤活性，包括在體外實(shí)驗(yàn)中，抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［6］，抑制黑素瘤細(xì)胞血管的形成［7］，阻滯結(jié)腸癌細(xì)胞周期［8］，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡［6，9］等；以及在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中抑制多種腫瘤的生長，如黑素瘤［7］、肺癌［10］、乳腺癌［11］和肝癌［12］等。研究表明，HM能通過血腦屏障，在神經(jīng)系統(tǒng)富集［13］。到目前為止，HM對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤生存的影響及其相關(guān)機(jī)制研究報道較少。因此，本文研究了HMH對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的影響，并初步探討了其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

HMH（批號：H0002，純度＞98%），上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，使用前用DMSO配成40 mmol·L-1的母液，-20℃保存。DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS磷酸鹽緩沖液和青-鏈霉素，美國Hyclone公司；胎牛血清，以色列BI公司；DMSO、MTT、兔抗人胱天蛋白酶3、活化的胱天蛋白酶3、自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（microtubuler-associated protein light chain 3B，LC3B）、P62和β肌動蛋白單克隆抗體，及3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）和Hoechst-33342，美國Sigma公司；兔抗人Bax、Bcl-2、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of Rapa?mycin，mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）單克隆抗體，英國Abcam公司；兔抗人蛋白激酶B（pro?tein kinase B，Akt）和p-Akt單克隆抗體，美國CST公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，美國Southern Biotech公司。

超凈化工作臺、CO2孵育箱和酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；倒置光學(xué)顯微鏡，寧波舜宇儀器公司；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；激光共聚焦顯微鏡，日本Nikon公司；小型垂直電泳槽，美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素和1%谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)液中，在5% CO237℃的孵育箱中培養(yǎng)。每天倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞長至80%～90%融合度進(jìn)行傳代。

1.3 MTT法檢測SH-SY5Y細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞消化、計數(shù)并稀釋成5×107L-1的單細(xì)胞懸液，每孔200 μL，接種至96孔板培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分藥物組和細(xì)胞對照組，每組6個復(fù)孔。藥物組加入含HMH 10，20，40，80和 160 μmol·L-1的細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞對照組加入等量DMSO（體積分?jǐn)?shù)≤0.1%）。培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，置孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定吸光度（A490nm）值。細(xì)胞存活率（%）=（藥物組A490nm/細(xì)胞對照組A490nm）×100%。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測SH-SY5Y細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞消化、計數(shù)并稀釋成5×104L-1的單細(xì)胞懸液，每孔1 mL接種至12孔板，培養(yǎng)至貼壁。細(xì)胞分藥物組和細(xì)胞對照組，藥物組加入含HMH 2和4 μmol·L-1的細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞對照組加入等量DMSO（體積分?jǐn)?shù)≤0.1%）培養(yǎng)14 d，細(xì)胞長至在日光燈下肉眼可觀察到白色細(xì)胞團(tuán)時，PBS洗1次，4%多聚甲醛固定，0.05%結(jié)晶紫染色，觀察紫色細(xì)胞克隆團(tuán)的大小及數(shù)量，并采集圖像。克隆形成率（%）=形成克隆數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.5 Hoechst33342/PI染色法檢測SH-SY5Y細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞消化、計數(shù)并稀釋成2×108L-1的單細(xì)胞懸液，每孔500 μL接種至4孔玻底培養(yǎng)皿培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分組給藥同1.3，培養(yǎng)24 h后，加入Hoechst33342染色液和PI染色液，置孵育箱37℃孵育30 min，PBS洗滌，加500 μL完全培養(yǎng)液，用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，并采集圖像。

1.6 Western印跡法檢測Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶3、活化的胱天蛋白酶3、LC3B-Ⅱ、P62蛋白水平及Akt和mTOR蛋白磷酸化水平

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞消化、計數(shù)并稀釋成2×108L-1的單細(xì)胞懸液，每孔2 mL接種至6孔板培養(yǎng)24 h。在檢測Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶3、活化的胱天蛋白酶3、LC3B-Ⅱ和P62蛋白水平時，細(xì)胞分組給藥同1.3；在檢測聯(lián)用自噬抑制劑3-MA后LC3B-Ⅱ蛋白水平時，細(xì)胞分為藥物組、模型加藥物組和細(xì)胞對照組，藥物組加入含HMH 40 μmol·L-1的細(xì)胞培養(yǎng)液、模型加藥物組加入含HMH40μmol·L-1和3-MA 5 mmol·L-1的細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞對照組加入等量DMSO（體積分?jǐn)?shù)≤0.1%）；在檢測Akt和mTOR磷酸化水平時，細(xì)胞分藥物組和細(xì)胞對照組，藥物組加入HMH 40 μmol·L-1的細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞對照組加入等量DMSO（體積分?jǐn)?shù)≤0.1%）。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離總蛋白，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗5 min×3次，加入一抗〔Bax（1∶1000）、Bcl-2（1∶2000）、胱天蛋白酶3（1∶2000）、活化的胱天蛋白酶3（1∶2000）、LC3B（1∶5000）、P62（1∶5000）、Ak（t1∶5000）、p-Akt（1∶5000）、mTOR（1∶5000）、p-mTOR（1∶5000）和β肌動蛋白（1∶5000）〕，4℃孵育過夜。PBST洗10 min×3次，加入二抗（1∶5000），常溫孵育1 h。PBST洗10 min×4次，顯影，掃描，采用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行積分吸光度（integrated absor?bance，IA）值分析。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白條帶IA值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平；以磷酸化蛋白與總蛋白條帶IA值的比值表示蛋白磷酸化水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

各組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次。采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件及Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和制圖，結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMH對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

與細(xì)胞對照組相比，不同濃度的HMH作用24 h后，在 20～160 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞存活均有顯著抑制作用（P＜0.01）（表1）。

Tab.1 Effect of harmine hydrochloride（HMH）on via?bility of SH-SY5Y cells by MTT assay

2.2 HMH對SH-SY5Y細(xì)胞克隆形成的影響

與細(xì)胞對照組相比，HMH 2 和 4 μmol·L-1組SH-SY5Y細(xì)胞克隆形成率顯著降低（P＜0.01），分別為（75±5）%和（31±3）%（圖1）。

Fig.1 Effect of HMH on cloning formation of SH-SY5Y cells.The SH-SH5Y cells were treated with HMH 2 and 4 μmol·L-1 for 14 d.B was the qualitive result of A.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 HMH對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞對照組藍(lán)色細(xì)胞核色澤均勻，飽滿，呈淡藍(lán)色，紅色熒光微弱。當(dāng)HMH 10～160 μmol·L-1作用24 h后，隨著藥物濃度的增加藍(lán)色熒光增強(qiáng)，細(xì)胞核皺縮、分葉，形成凋亡小體，邊緣不清晰，最終碎裂，而紅色熒光也隨藥物濃度的增加逐漸增強(qiáng)，死亡細(xì)胞增多（圖2）。

Fig.2 Effect of HMH on SH-SY5Y cells apoptosis by Hoechst33342/PI staining（×600）.See Tab.1 for the cell treatment.The arrows show the chromatin condensation，nuclear fragmentation，cell shrinkage and necrosis.

2.4 HMH對Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶3和活化的胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)的影響

與細(xì)胞對照組相比，HMH作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，在20～160 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，SH-SY5Y細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白Bax/Bcl-2的比值顯著增加（P＜0.05），在40～160 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，活化胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3的比值顯著增加（P＜0.05）（圖3）。

Fig.3 Effect of HMH on protein expressions of Bax，Bcl-2，caspase 3 and cleaved-caspase 3 in SH-SY5Y cells by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.B and C were the semi-qualitive results of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.5 HMH對LC3B-Ⅱ和P62表達(dá)的影響

與細(xì)胞對照組相比，不同濃度的HMH作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，在 20～160 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，SH-SY5Y細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白P62的相對表達(dá)水平顯著減少（P＜0.01），LC3B-Ⅱ的相對表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01）（圖4）。

Fig.4 Effect of HMH on protein expressions of microtu?buler-associated protein light chain 3B-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）and P62 in SH-SY5Y cells by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.B was the semi-qualitive result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.6 HMH單用或與3-MA聯(lián)用對自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達(dá)的影響

藥物作用于SH-SY5Y細(xì)胞4 h后，與細(xì)胞對照組相比，HMH 40 μmol·L-1單獨(dú)處理組及同時給予HMH 40 μmol·L-1和自噬抑制劑 3-MA 5 mmol·L-1組細(xì)胞LC3B-Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平均無顯著變化。而藥物作用24 h后，與細(xì)胞對照組相比，HMH 40 μmol·L-1單獨(dú)處理組 SH-SY5Y 細(xì)胞 LC3B-Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01）；與HMH 40 μmol·L-1單獨(dú)處理組相比，同時給予 HMH 40 μmol·L-1和3-MA 5 mmol·L-1組細(xì)胞LC3B-Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平顯著減少（P＜0.05）（圖5）。

Fig.5 Effect of HMH on LC3B-Ⅱprotein expression in SH-SY5Y cells by Western blotting.The SH-SY5Y cells were treated with HMH 40 μmol·L-1or HMH 40 μmol·L-1+3-MA 5 mmol·L-1for 4 or 24 h，respectively.B was the semiqualitive result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with HMH group.

2.7 HMH對Akt和mTOR蛋白磷酸化水平的影響

與細(xì)胞對照組相比，HMH 40 μmol·L-1作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，Akt蛋白的表達(dá)水平無顯著變化，mTOR蛋白的表達(dá)水平有所增加但沒有顯著性差異，p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)水平減少，p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值顯著降低（P＜0.05）（圖6）。

Fig.6 Effect of HMH on phosphorylation levels of protein kinase B（Akt）and mammalian target of Rapamycin（mTOR）in SH-SY5Y cells by Western blotting.The SH-SY5Y cells were treated with HMH 40 μmol·L-1for 24 h.B was the semi-qualitive results of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

3 討論

MTT實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HMH在低濃度時即表現(xiàn)出顯著的SH-SY5Y細(xì)胞增殖抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率降低。Hoechst33342/PI染色結(jié)果顯示，HMH 20 μmol·L-1時細(xì)胞核開始皺縮，分葉，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞核內(nèi)形成凋亡小體，細(xì)胞核碎裂，死亡細(xì)胞逐漸增多。

凋亡途徑始終是抗腫瘤藥物起作用的最佳途徑［14-15］。凋亡途徑分內(nèi)源性凋亡和外源性凋亡，內(nèi)源性凋亡途徑又稱線粒體凋亡途徑［16］。本研究檢測了內(nèi)源性凋亡途徑關(guān)鍵蛋白Bax和Bcl-2，發(fā)現(xiàn)Bax蛋白的表達(dá)量隨藥物濃度的增加而增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平隨藥物濃度的增加而減少，Bax/Bcl-2的比值增加。此外，胱天蛋白酶家族是參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵家族，分為啟動子蛋白（如胱天蛋白酶8和9）和執(zhí)行子蛋白（如胱天蛋白酶3，6和7）。其中胱天蛋白酶3的剪切是凋亡發(fā)生的標(biāo)志性過程，同時它也是Bax和Bcl-2的下游蛋白［17］。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，活化的胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3的比值增加，說明HMH能夠啟動內(nèi)源性凋亡途徑。

自噬在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中是一把“雙刃劍”。自噬能抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)育，過度自噬可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自噬性死亡，相反，自噬也可以提高腫瘤細(xì)胞對應(yīng)激的耐受性，維持腫瘤細(xì)胞的存活［18-19］。本研究檢測了自噬標(biāo)志性蛋白LC3B-Ⅱ和P62的表達(dá)。LC3B蛋白有2種形式LC3B-Ⅰ與LC3B-Ⅱ，當(dāng)自噬發(fā)生時LC3B-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3B-Ⅱ，參與自噬體的形成［20］。本研究的結(jié)果顯示，LC3B-Ⅱ相對表達(dá)水平隨藥物濃度的增加而增加，P62蛋白的相對表達(dá)水平隨藥物濃度的增加而減少，說明HMH能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬。聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA 4 h后，HMH單獨(dú)給藥組LC3B-Ⅰ至LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化不明顯；而聯(lián)合應(yīng)用3-MA 24 h后，HMH單獨(dú)給藥組LC3B-Ⅰ至LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化明顯，且聯(lián)合應(yīng)用3-MA組LC3B-Ⅱ相對表達(dá)水平減少，說明HMH誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬具有時間依賴性。然而，這種自噬對腫瘤細(xì)胞具有保護(hù)作用還是協(xié)同細(xì)胞凋亡發(fā)揮對SH-SY5Y細(xì)胞的抑制作用尚不明確，還需進(jìn)一步研究。

Akt為PI3K/Akt/mTOR信號通路的中樞蛋白，參與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和自噬等多種生物過程［21］。Akt在多種腫瘤細(xì)胞中被異常激活，參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［22］。mTOR為Akt的下游蛋白，是參與細(xì)胞自噬過程的重要負(fù)調(diào)控因子［23］。有研究表明，HM能通過抑制Akt/mTOR信號通路發(fā)揮抗胃癌作用［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，HMH可抑制Akt/mTOR的磷酸化水平，說明HMH通過負(fù)調(diào)控Akt/mTOR通路誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡與自噬。

綜上所述，HMH能通過啟動腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞增殖，同時誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。該作用通過抑制Akt/mTOR信號通路實(shí)現(xiàn)。