鄧 婷，謝丹妮，王 平，李勁松，徐 穎，孫 濤

（成都中醫(yī)藥大學1.中藥材標準化教育部重點實驗室，2.西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137；3.廣元市第一人民醫(yī)院，四川 廣元 628017）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種多發(fā)于老年群體的神經(jīng)退行性疾病，最初由德國醫(yī)生Alois ALZHEIMER于1907年發(fā)現(xiàn)并命名［1］。據(jù)統(tǒng)計，全球約有＞5000萬AD患者，預計到21世紀中期將增加到≥1.52億，全球醫(yī)療總費用達到8180億美元，對醫(yī)療體系、社會經(jīng)濟造成沉重負擔［2］。AD主要臨床表現(xiàn)為早期記憶力逐漸下降、輕微認知損傷，中后期記憶力明顯下降，并出現(xiàn)語言和運動障礙及人格改變等。AD主要標志性病理學特征包括神經(jīng)元胞外β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）聚集成老年斑（senile plaques，SP）、tau蛋白異常磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT）和神經(jīng)元丟失等。由此，根據(jù)其病理特征提出相關(guān)發(fā)病機制的假說，包括氧化應激（oxidative stress，OS）損傷、tau蛋白異常磷酸化、膽堿能損傷、鋁中毒和Aβ毒性等，并在相關(guān)假說的基礎(chǔ)上建立AD動物模型，但目前尚缺乏一種能全面模擬AD病癥表現(xiàn)的模型。

基于此，本文總結(jié)了OS損傷、膽堿能損傷、鋁中毒、Aβ毒性和轉(zhuǎn)基因5類AD動物模型的發(fā)病機制、建模方法和指標評價，并進一步總結(jié)各模型的特點，從而為構(gòu)建符合臨床特征且覆蓋AD病癥表現(xiàn)的AD動物模型提供思路。

1 氧化應激損傷模型

研究顯示，自由基誘導的OS損傷在AD的發(fā)病機制中占有重要作用，自由基與其清除劑之間的不平衡，即氧化劑水平增加或抗氧化劑水平降低會引發(fā)OS［3］。自由基是在其外軌道上具有單個不成對電子的原子或分子。自由基中不成對的電子使其非常不穩(wěn)定，能與蛋白質(zhì)、DNA和脂肪酸等其他分子發(fā)生反應，導致細胞損傷、功能障礙，最終導致細胞死亡［3］。另一方面，自由基的產(chǎn)生也與Aβ［4］和晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end prod?ucts，AGE）［5］有關(guān)。同時，OS也可促進Aβ的產(chǎn)生并使其在腦內(nèi)聚積，進而導致神經(jīng)元退行性病變［4］。其動物模型主要有D-半乳糖（D-galactose，D-gal）模型和快速老化小鼠模型。

1.1 D-半乳糖模型

研究表明，長期大量皮下或腹腔注射D-gal后可轉(zhuǎn)化為半乳糖醇，并在細胞內(nèi)積累，引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性下降，導致細胞OS損傷；此外，D-gal也會形成AGE，促進腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1釋放導致炎癥反應，從而影響學習和記憶功能［6］。此模型出現(xiàn)與AD臨床表現(xiàn)相同的癥狀，如認知功能減退和學習記憶下降，但未發(fā)現(xiàn)SP和NFT等病理學特征。同時，造模過程中存在較多不確定因素，如給藥方法、周期、劑量等因素。此外，另有研究采用D-gal聯(lián)合亞硝酸鹽造模，促進了細胞的OS損傷［7］。具體造模方法及評價指標見表1。

1.2 快速老化小鼠模型

20世紀80年代，TAKEDA等［8］培育出一種快速老化小鼠（senescence accelerated mouse，SAM），包括快速老化亞系P系（SAMP）和正常衰老R系（SAMR）。多數(shù)P系表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的退化，且研究證明SAMP8和SAMP10小鼠具有壽命較短、學習記憶缺陷、情緒障礙和晝夜節(jié)律改變的表征［9］；此外，SAMR系SAMR1小鼠具有正常老化的特征，如生理指標及平均壽命均與正常衰老小鼠相似，因此常作為SAMP系小鼠的對照［10］。已有大量研究表明，與SAMR1小鼠相比，SAMP小鼠的各種組織（包括腦）的氧化狀態(tài)更高［11］，如丙二醛（malondial?dehyde，MDA）含量增多、SOD活性降低、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量減少等指標變化。同時，SAMP系小鼠也表現(xiàn)Aβ沉積、tau蛋白過度磷酸化、膽堿功能障礙和神經(jīng)元丟失等AD病理特征［11］。SAM小鼠在正常發(fā)育過程中表現(xiàn)出較早的發(fā)病和不可逆的衰老進程，其腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的病變與AD的臨床特征相似［12］。

2 膽堿能損傷模型

中樞膽堿能損傷學說認為，膽堿功能與記憶認知功能相關(guān)。有學者發(fā)現(xiàn)，AD患者大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransfer?ase，ChAT）和乙酰膽堿酯酶（acetyl-cholinester?ase enzyme，AChE）活性升高，導致乙酰膽堿（ace?tylcholine，ACh）合成減少［13］。同時，研究證明AD發(fā)病與膽堿能受體密切有關(guān)，如膽堿能終末的煙堿型受體和毒蕈堿型受體數(shù)量減少會降低認知功能［14-15］。另外，腦組織內(nèi)缺乏神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）均能引起膽堿能神經(jīng)元合成ACh的功能失常，進而導致記憶功能下降［16］。

采用不同方法損害大腦膽堿能系統(tǒng)來制備AD模型，可導致記憶減退和認知障礙，如東莨菪堿誘導模型。該模型通過向小鼠ip給予東莨菪堿阻斷M膽堿受體，從而阻斷中樞膽堿能神經(jīng)功能使ACh減少［13］，動物出現(xiàn)記憶力下降、認知功能減退等改變。此模型操作簡易，但缺乏典型病理改變，如Aβ沉積和tau蛋白磷酸化等［13］。另外，也常結(jié)合膽堿能損傷和OS損傷這2種致病機制復合造模，有利于較全面地模擬AD臨床癥狀，如東莨菪堿聯(lián)合D-gal［15］。具體建模方法見表 1。

3 鋁中毒模型

鋁是一種大量存在的神經(jīng)毒素，其易在AD大腦皮質(zhì)和海馬等區(qū)域積聚，長期接觸鋁會導致動物的氧化應激損傷和記憶障礙［17-18］。研究揭示，鋁也能誘導炎癥反應、引起軸突運輸和突觸結(jié)構(gòu)異常，導致記憶嚴重喪失［18］。此外，鋁參與β淀粉樣前體蛋白（amyloid-β protein precursor，APP）的代謝途徑，利于形成Aβ寡聚體及炎癥斑塊［17］。

該模型的建立是基于“鋁中毒假說”。因此，相關(guān)研究通常采用大鼠口服三氯化鋁（AlCl3）的方法造模，表現(xiàn)出鋁含量、AChE活性、APP蛋白表達和炎癥因子水平明顯提高［17-18］。但此模型的誘導周期較長，且給藥方法、劑量等不確定因素較多。另外，研究結(jié)合D-gal［19］和東莨菪堿［20］等多種物質(zhì)復合造模，誘導動物出現(xiàn)OS損傷、膽堿能功能受損等多種發(fā)病機制，具體方法見表1。

4 A β毒性模型

Aβ是由APP代謝產(chǎn)生，APP經(jīng)β-和γ-分泌酶連續(xù)剪切后形成長度在39～43個氨基酸的短肽。其長度在羧基端末端變化，主要產(chǎn)生Aβ40和Aβ422種分子，Aβ42的疏水性和聚集性強于Aβ40，因此毒性更大。1984年，首次在AD患者腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)Aβ氨基酸順序與SP中的淀粉樣物質(zhì)為同系物［21］。因此，學者認為AD腦內(nèi)SP的形成與Aβ有關(guān)。Aβ毒性假說認為，Aβ的積聚導致自由基損傷、tau蛋白磷酸化、遞質(zhì)丟失和炎癥反應等，最終引起神經(jīng)元功能失調(diào)和死亡、斑塊形成和NFT等病理變化。

目前，研究人員通過向動物單側(cè)或雙側(cè)腦室內(nèi)分別注射Aβ1-42，Aβ1-40或Aβ25-353種淀粉樣蛋白的寡聚體建立模型，注射部位有海馬［23，28］、側(cè)腦室［24］和基底前腦［25］等，其神經(jīng)毒性與Aβ積聚相關(guān)，導致炎癥因子IL-1β和TNF-α分泌增多［22，24，28］，氧化水平提高及神經(jīng)遞質(zhì)合成減少［23，26］。另外，利用Aβ聯(lián)合D-gal［24，27-28］和鵝膏蕈氨酸［29］復合造模，較全面模擬AD的臨床癥狀。具體建模方法見表2。經(jīng)腦室內(nèi)注射Aβ制備AD模型在一定程度上驗證了Aβ毒性假說。不同研究對注射Aβ后導致的行為學和神經(jīng)病理學檢測指標不一致，這些差別可能與注射部位、劑量、狀態(tài)、時間及留針時間等因素有關(guān)。側(cè)腦室注射Aβ是一種常見的模擬AD的動物模型，可誘發(fā)與AD類似的癥狀，如學習記憶下降和炎癥反應等。同時，也具有手術(shù)操作簡單、創(chuàng)傷性小、定位準確、造模周期較短、成功率高等特點，但注射Aβ快速造模的方法與AD腦內(nèi)Aβ緩慢沉積的病理變化不相符。

表2 β樣淀粉蛋白（Aβ ）毒性模型的建立和評價指標

5 轉(zhuǎn)基因動物模型

轉(zhuǎn)基因動物是研究AD發(fā)病機制和建立模型的一種較理想的工具，AD的相關(guān)基因包括APP基因、早老素（presenilin，PS）-1基因、PS-2基因、載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因及tau基因。其中APP、PS-1和PS-2基因與Aβ的生成有關(guān)，當APP基因發(fā)生突變時，APP不能被α-分泌酶正確識別并切割，使其更易被β-分泌酶和γ-分泌酶分解產(chǎn)生Aβ［31］。而PS基因被敲除后將影響神經(jīng)發(fā)育及功能維持，導致神經(jīng)祖細胞數(shù)量減少［32］；同時，PS是γ-分泌酶的核心成分，該基因突變也會影響γ-分泌酶活性，導致Aβ42/Aβ40比值增大［33］。ApoE基因最先因參與脂質(zhì)代謝而受到關(guān)注，隨后被發(fā)現(xiàn)也參與AD。ApoE含有ApoE2，ApoE3和ApoE43個等位基因，其中ApoE4是晚期AD的主要遺傳危險因素，可與Aβ結(jié)合形成不溶的高分子復合物，導致體外形成淀粉蛋白單纖維［34］。tau基因突變可導致tau蛋白表達水平異常和結(jié)構(gòu)紊亂，從而出現(xiàn)tau蛋白異常磷酸化及神經(jīng)纏結(jié)等AD病理特征。另有文獻報道，AD也與人朊蛋白基因有關(guān)，朊蛋白是Aβ寡聚體的高親和力受體［35］，因而該基因的突變將導致Aβ寡聚體增多。根據(jù)上述突變基因已成功建立許多轉(zhuǎn)基因模型，本文總結(jié)了部分模型的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體及相關(guān)病理特征，具體見表3。

至今，學者利用不斷完善的轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立多種AD轉(zhuǎn)基因模型，模型由單轉(zhuǎn)基因向雙轉(zhuǎn)基因甚至三轉(zhuǎn)基因發(fā)展，如表達APP基因的PDAPP單轉(zhuǎn)基因小鼠［36］出現(xiàn)淀粉樣沉積物；而APPSWE/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠［37］同時表達APP基因的瑞典型突變（K670N/M671L）和PS-1（PS1dE9）基因，出現(xiàn)斑塊沉積和神經(jīng)元丟失；三轉(zhuǎn)基因模型（3xTg-AD）是可同時在AD相關(guān)腦區(qū)出現(xiàn)斑塊和神經(jīng)纏結(jié)病理的轉(zhuǎn)基因模型［38］。因此，多轉(zhuǎn)基因動物模型的特點在于可把多個相關(guān)致病基因結(jié)合在一起，較全面模擬AD患者腦內(nèi)Aβ沉積、斑塊形成和神經(jīng)元丟失等病理特征。另外，多轉(zhuǎn)基因動物也可較早出現(xiàn)行為異常，如雙轉(zhuǎn)基因5XFAD小鼠在1.5月齡時Aβ42開始沉積，同時伴有神經(jīng)膠質(zhì)增生［39］；3xTg-AD小鼠6月齡時出現(xiàn)胞外Aβ沉積物，并在12個月時很明顯［38］；9月齡時出現(xiàn)tau病理性磷酸化，并在12個月逐漸增加［40］。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)日趨成熟，學者借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)將與AD相關(guān)的人類突變基因轉(zhuǎn)入動物中，通過改變動物遺傳學性狀達到建立AD動物模型的目的。它能部分模擬人類AD患者Aβ沉積、神經(jīng)炎癥反應、神經(jīng)纏結(jié)以及神經(jīng)元丟失等部分神經(jīng)病理特征，并表現(xiàn)出與AD臨床相似的行為學障礙。

6 結(jié)語與展望

盡管AD研究進程不斷深入，目前仍缺乏能準確表征及全面覆蓋的模擬AD主要病理、生化及行為學等全部特征的理想動物模型，與臨床AD患者的上述病癥特點之間還存在一定差距，具有局限性，因此亟需開發(fā)更切合臨床患者自身生物學特性的AD動物模型。當前應用于構(gòu)建AD動物模型的方法較為多樣（表1～表3），且各具特點，研究者可根據(jù)不同實驗目的及損傷機制選取代表性動物模型。其中轉(zhuǎn)基因動物模型是目前研究AD較為理想且應用廣泛的模型，能表征多個病理特點或較早出現(xiàn)的病理改變，表現(xiàn)與AD患者類似的臨床癥狀，因此轉(zhuǎn)基因動物模型具有非常廣闊的研究及應用前景。此外，AD動物模型的評價方法大多采用行為學指標，如逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)等；組織病理切片；生化檢測指標，如Aβ沉積和tau蛋白磷酸化（包括APP，Aβ和PP2A等指標）、膽堿能損傷（包括ChAT，AChE和ACh檢測）、OS損傷（ROS，GSH，GSH-Px，MDA和其他氧化指標檢測）、炎癥反應（包括炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-2，IL-4和IL-6等檢測）和神經(jīng)元丟失（神經(jīng)元數(shù)量檢測）。同時，查閱大量的相關(guān)文獻，筆者發(fā)現(xiàn)較少研究采用病理檢測指標，導致AD病變區(qū)域的關(guān)鍵病理特征檢測缺失。

綜上所述，選擇適合的動物模型對探知AD的發(fā)病機制及病理特征具有重要價值，但仍有部分問題亟待解決。如缺乏與臨床微觀病理特點完全契合的動物模型建立方法，且已有建模方法尚不能達到高度的可重復性；缺乏統(tǒng)一的模型標準評價體系，反映實驗動物學習記憶能力受損的神經(jīng)生理和

運動行為的評價指標單一，相關(guān)理化指標檢測尚不全面、不統(tǒng)一。因此，筆者認為在進一步的研究中應優(yōu)化AD動物模型的建模及評價方法，并參考AD臨床診斷標準對動物模型的相關(guān)指標進行評價，還可借助正電子發(fā)射型計算機斷層顯像、磁共振成像等先進影像學診斷技術(shù)綜合構(gòu)建AD動物模型多維度標準化評價方法，以期為AD動物模型的標準化評價提供思路與借鑒。