孫加鳳，張 麗，裴 翔，張?chǎng)?，符善姜，?興

（三亞中心醫(yī)院1.內(nèi)分泌科，3.心血管內(nèi)科，海南 三亞 572000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，新疆 烏魯木齊 830001）

心肌缺血再灌注（myocardial ischemia reper?fusion，MI/R）損傷是一種常見(jiàn)的臨床問(wèn)題，盡管目前醫(yī)療手段已飛速發(fā)展和迅速推廣，MI/R損傷引發(fā)的心肌損傷仍導(dǎo)致急性心肌梗死患者1年的臨床死亡率接近10%［1］。研究表明，糖尿病患者通常死于與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥，2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，DM）患者容易并發(fā)心血管疾病，約有超過(guò)60%的糖尿病患者死于心血管疾?。?］。糖尿病是心肌缺血的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。許多流行病學(xué)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)室研究表明，糖尿病顯著加重了MI/R損傷［3］。因此探尋改善DM患者M(jìn)I/R損傷的方法具有重要意義。

和厚樸酚（honokiol）是中藥厚樸的新木脂素類(lèi)成分。厚樸是一種傳統(tǒng)中藥，用于治療各組血管疾病，包括缺血、心臟病和卒中［4］。已有研究表明，和厚樸酚通過(guò)減少氧化應(yīng)激和炎癥因子的釋放對(duì)MI/R損傷具有保護(hù)作用［5］，對(duì)DM KK/Upj-AY小鼠具有降血糖作用，及改善血脂紊亂導(dǎo)致的胰島素抵抗的作用，且不誘導(dǎo)小鼠體質(zhì)量增加［6］。然而目前還沒(méi)有關(guān)于和厚樸酚對(duì)DM MI/R研究的報(bào)道，其作用機(jī)制尚不清楚。本文旨在探究和厚樸酚對(duì)大鼠DM MI/R后心功能紊亂、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

50只SD大鼠，雄性，6周齡，體質(zhì)量170～190 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。置溫控21～23℃和光控（200 lux，12 h光暗循環(huán)）的動(dòng)物設(shè)施中常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.2 藥物、試劑和主要儀器

和厚樸酚（H4914，純度≥98%）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；蘇木素-伊紅染液（D006-1-1）、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase MB，CK-MB）檢測(cè)試劑盒（E006-1-1）、肌紅蛋白（myohemoglobin，Mb）檢測(cè)試劑盒（H150）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（A001-3-2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（A003-1-2）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測(cè)試劑盒（A005-1-2）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；肌鈣蛋白（cardiac troponin I，cTnI）檢測(cè)試劑盒（ml001932）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（C1091）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗大鼠胱天蛋白酶3（ab13847）、兔抗大鼠活化的胱天蛋白酶3（ab2302）、兔抗大鼠Bax（ab53154）、兔抗大鼠Bcl-2（ab196495）、兔抗大c-Myc（ab39688）和兔抗大鼠β肌動(dòng)蛋白（ab8227）單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。彩色多普勒超聲儀KR-S80購(gòu)自德國(guó)西門(mén)子股份公司；DM2500熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；Nano-Drop分光光度計(jì)和Multiskan?FC酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；FluorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Proteinsimple公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和處理

將大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、DM MI/R模型組、DM MI/R+和厚樸酚（2.5，5.0和10.0 mg·kg-1）組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組參照祁秀茹等［7］方法建立DM MI/R模型。飼喂高糖高脂飼料聯(lián)合ip給予鏈脲佐菌素30 mg·kg-1誘導(dǎo)建立DM大鼠模型。以血糖超過(guò)并穩(wěn)定在＞14 mmol·L-1為DM大鼠模型建立成功。在DM大鼠模型基礎(chǔ)上，將大鼠用3.5%水合氯醛（0.35 mg·kg-1，ip）麻醉，仰臥位固定，四肢連接心電圖電極，氣管插管后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。于大鼠左側(cè)胸前第三、四肋間打開(kāi)胸腔，暴露心臟，除正常對(duì)照組外，其余4組均結(jié)扎左心耳下緣2 mm處，觀察大鼠心尖部顏色及心電圖變化，當(dāng)大鼠心臟呈青紫色、心尖部明顯蒼白、心電圖顯示ST段明顯抬高且T波高聳說(shuō)明結(jié)扎準(zhǔn)確，心肌缺血模型制備成功。解除結(jié)扎，恢復(fù)心臟血供再灌注120 min，心臟表面顏色由青紫色逐漸恢復(fù)紅色，心電圖顯示ST段逐漸壓低且T波逐漸恢復(fù)則表明大鼠心肌缺血后成功恢復(fù)，并再灌注。造模中死亡大鼠通過(guò)隨機(jī)原則補(bǔ)齊動(dòng)物數(shù)并重新造模。DM MI/R+和厚樸酚組造模成功后ip給予和厚樸酚2.5，5.0和10.0 mg·kg-1，正常對(duì)照組和模型組ip給予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。

1.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心功能

末次給藥12 h后，ip給予10%水合氯醛（350 mg·kg-1）麻醉大鼠，左側(cè)臥位，采用彩色多普勒超聲儀檢測(cè)大鼠心率（heart rate，HR）、左室短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S）、平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）和左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5 ELISA檢測(cè)大鼠血清中cTnl，Mb和CK-MB水平

末次給藥12 h后，眼眶靜脈叢采血，1 800×g離心10 min收集血清，-80℃保存。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠血清中cTnl，Mb和CK-MB水平。

1.6 試劑盒法檢測(cè)大鼠血清中SOD，GSH和MDA含量

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定SOD含量，采用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定MDA和GSH含量。

1.7 HE染色檢測(cè)大鼠心肌組織病理?yè)p傷

處死大鼠后取心肌組織，PBS清洗后用4%多聚甲醛固定24 h，30%，50%和70%乙醇脫水，石蠟包埋切片，切片厚度2 μm。經(jīng)HE染色后在熒光顯微鏡下觀測(cè)組織病理變化。

1.8 TUNEL染色檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡率

大鼠心肌組織切片用二甲苯浸洗2次脫蠟，每次5 min，梯度乙醇脫水。用蛋白酶K工作液在37℃封閉20 min，PBS清洗2次。在每個(gè)切片樣本上滴加50 μL TUNEL反應(yīng)液，37℃閉光反應(yīng)60 min。用4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenyl?indole，DAPI）復(fù)染10 min后熒光顯微鏡下觀察。正常細(xì)胞顏色為藍(lán)色，而心肌TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞為棕褐色。每只大鼠隨機(jī)選取5張心肌組織切片進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.9 Western印跡法檢測(cè)大鼠心肌組織胱天蛋白酶3、Bax、Bcl-2和c-Myc蛋白表達(dá)水平

處死各組大鼠后，取出心臟，用生理鹽水洗凈，剪取結(jié)扎處下方左冠狀動(dòng)脈前降支血流供應(yīng)區(qū)心肌組織，勻漿提取蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。提取等量的蛋白質(zhì)樣品，在100℃條件下變性5 min。然后使用SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉1 h，在4℃條件下分別加入抗胱天蛋白酶 3、Bax、Bcl-2、c-Myc抗體（1∶1000）并孵育過(guò)夜，清洗，然后在4℃下加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5000），孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。采用Image J軟件分析，以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，用目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 和厚樸酚對(duì)DM MI/R模型大鼠HR，F(xiàn)S，MAP和LVEF的影響

全數(shù)字彩色多普勒超聲診斷儀檢測(cè)結(jié)果顯示（圖1），與正常對(duì)照組相比較，DM MI/R組HR，F(xiàn)S，MAP和LVEF顯著降低（P＜0.05）；與DM MI/R組相比較，DM MI/R+和厚樸酚5.0和10.0 mg·kg-1組HR，F(xiàn)S，MAP和LVEF均顯著升高（P＜0.05）。

Fig.1 Effect of honokiol on heart rate（HR，A），fraction shortening（FS，B），mean arterial pressure（MAP，C）and left ventricular ejection fraction（LVEF，D）in myocar?dial ischemia reperfusion with type 2 diabetes mellitus（DM MI/R）model rats.The rat model of type 2 diabetes mellitus（DM）was induced by high sugar and high fat feed combined with ip streptozotocin 30 mg·kg-1and was considered estab?lished when blood glucose exceeded and became stabilized above 14 mmol·L-1.MI/R model was established by intermittently ligating the lower margin of left atrial appendage.Rats were randomly divided into control group，DM MI/R group，DM MI/R+honokiol（2.5，5.0 and 10.0 mg·kg-1）groups.Rats were ip honokiol 2.5，5.0 and 10.0 mg·kg-1（in drug group）or saline（in control and DM MI/R group）once a day for 14 d.±s，n=10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DM MI/R group.1 mmHg=0.133 kPa.

2.2 和厚樸酚對(duì)DM MI/R模型大鼠血清cTnl，Mb和CK-MB水平的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，與正常對(duì)照組比較，DM MI/R組cTnl，Mb和CK-MB水平顯著升高（P＜0.05）；與DM MI/R組比較，DM MI/R+和厚樸酚5.0和10.0 mg·kg-1組cTnl，Mb和CK-MB水平顯著降低（P＜0.05）。

Fig.2 Effect of honokiol on cardiac troponin I（cTnI，A），myohemoglobin （Mb，B） and creatine kinase MB（CK-MB，C）level in DM MI/R model rats.See Fig.1 for the rat treatment.±s，n=10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DM MI/R group.

2.3 和厚樸酚對(duì)DMMI/R模型大鼠血清中SOD活性，GSH和MDA水平的影響

如圖3所示，與正常對(duì)照組比較，DM MI/R組SOD活性和GSH水平顯著降低（P＜0.05），MDA水平顯著升高（P＜0.05）；與DM MI/R組相比較，DM MI/R+和厚樸酚5.0和10.0 mg·kg-1組SOD活性和GSH水平顯著升高（P＜0.05），MDA水平顯著降低（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of honokiol on superoxide dismutase（SOD，A），glutathione（GSH，B）and malondialdehyde（MDA，C）in DM MI/R model rats.See Fig.1 for the rat treatment.±s，n=10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DM MI/R group.

2.4 和厚樸酚對(duì)DM MI/R模型大鼠心肌病理?yè)p傷和細(xì)胞凋亡的影響

HE染色結(jié)（圖4）所示，正常對(duì)照組心肌纖維排列規(guī)整，未見(jiàn)變性，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。DM MI/R組心肌纖維排列紊亂、壞死、斷裂，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。DM MI/R+和厚樸酚5.0和10.0 mg·kg-1組較DM MI/R組病理?yè)p傷程度明顯改善，心肌纖維排列較規(guī)整，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。通過(guò)TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果如圖3B和3C所示，與對(duì)照組相比較，DM MI/R組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與DM MI/R組相比較，DM MI/R+和厚樸酚5.0和10.0 mg·kg-1組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of honokiol on pathological injury and apoptosis inhibition of myocardial cells in DM MI/R model rats by HE staining（A）and TUNEL staining（B）.See Fig.1 for the rat treatment.C was the semi-quantitative result of B.The arrows show the locations of serious myocardial injury.±s，n=10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DM MI/R group.

2.5 和厚樸酚對(duì)DM MI/R模型大鼠心肌組織中胱天蛋白酶3、Bax、Bcl-2和c-Myc蛋白水平的影響

如圖5所示，與正常對(duì)照組相比較，DM MI/R組活化的胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3和Bax/Bcl-2的比值均顯著升高（P＜0.05），c-Myc蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與DM MI/R組相比較，DM MI/R+和厚樸酚5.0和10.0 mg·kg-1組活化的胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3和Bax/Bcl-2的比值顯著降低（P＜0.05），c-Myc蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。

Fig.5 Effect of honokiol on protein expressions of caspase 3，cleaved-caspase 3，Bax，Bcl-2 and c-Myc in DM MI/R model rats by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DM MI/R group.

3 討論

隨著中國(guó)社會(huì)老齡化的逐步加快，糖尿病患者逐年增多，嚴(yán)重威脅人們的健康。缺血心臟病等心血管并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要因素［18］。而糖尿病患者治療一般長(zhǎng)期服用藥物，容易產(chǎn)生耐藥性，因此找到能減輕并改善DM MI/R的藥物尤為重要。相關(guān)研究表明，和厚樸酚對(duì)DM模型大鼠有抗氧化、降糖降脂、抑制肝CYP2E1酶活性等作用，具有較明顯的抗糖尿病療效［19］，通過(guò)抗心肌梗死作用降低急性心肌梗死大鼠的心肌梗死面積［10］。

心肌缺血時(shí)心肌細(xì)胞發(fā)生變性、壞死溶解，再灌注損傷增加心肌細(xì)胞膜通透性，血液中心肌損傷標(biāo)志物水平升高，心肌細(xì)胞損傷程度與CK-MB，Mb和cTnI水平相關(guān)［11］。CK-MB是診斷急性心肌損傷最常用和最有價(jià)值的生化指標(biāo)之一，心肌中CK-MB反映心肌缺血范圍的大小，血清CK-MB含量越高，心肌損傷程度越重［12-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚具有降低DM MI/R模型大鼠cTnl，Mb和CK-MB水平及改善心肌組織病理?yè)p傷的作用。提示和厚樸酚具有改善DM MI/R大鼠心肌損傷的作用。

心肌細(xì)胞凋亡在DM MI/R中起著重要作用，抑制心肌細(xì)胞凋亡可減輕DM MI/R心肌損傷［15］?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax能形成Bcl-2/Bax異二聚體［16］。胱天蛋白酶家族是細(xì)胞凋亡的介導(dǎo)者以及執(zhí)行者，胱天蛋白酶3處于凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)［17］。當(dāng)胱天蛋白酶凋亡級(jí)聯(lián)切割激活胱天蛋白酶3酶原后，活化的胱天蛋白酶3發(fā)揮調(diào)控作用，引起細(xì)胞凋亡。WANG等［5］研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax和胱天蛋白酶3的表達(dá)及抑制細(xì)胞凋亡緩解DM大鼠MI/R損傷。c-Myc是一種具有轉(zhuǎn)錄因子功能的原癌基因，參與細(xì)胞中多種癌癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，可促進(jìn)細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，和厚樸酚通過(guò)降低活化的胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3和Bax/Bcl-2的比值，升高c-Myc蛋白表達(dá)水平，改善DM MI/R模型大鼠心肌損傷。

氧化應(yīng)激是由于機(jī)體內(nèi)的氧化系統(tǒng)與抗氧化水平失衡，氧自由基生成過(guò)多無(wú)法被清除，導(dǎo)致機(jī)體過(guò)度氧化，從而造成組織功能損害［18］。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其水平高低可反映氧化應(yīng)激程度，GSH和SOD是體內(nèi)最重要的抗氧化酶，可清除細(xì)胞中ROS，具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用［19］。朱為勇等［20］研究發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚通過(guò)增加SOD，CAT和GSH水平，降低MDA水平，抑制氧化應(yīng)激，減輕氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。翟蒙恩等［21］研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)降低MDA含量及增強(qiáng)SOD和GSH-Px活性抑制膿毒癥誘發(fā)的心肌氧化應(yīng)激，最終減輕膿毒癥心肌損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚具有升高DM MI/R模型大鼠SOD活性和GSH水平、降低MDA水平的作用，提示和厚樸酚通過(guò)抑制氧化應(yīng)激減輕DM MI/R模型大鼠心肌損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚通過(guò)降低cTnl，Mb和CK-MB水平改善心肌病理?yè)p傷，降低活化的胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3和Bax/Bcl-2的比值，升高c-Myc蛋白水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡，升高SOD活性和GSH水平，降低MDA水平，以改善氧化應(yīng)激。本研究為臨床應(yīng)用和厚樸酚治療DM MI/R提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。