張宏達(dá)，王立娜，張 宇，李曉東,*，冷友斌，鞏燕妮，蔣士龍

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150030；4.黑龍江完達(dá)山林海液奶有限公司，黑龍江 牡丹江 157100）

母乳中的脂質(zhì)是嬰兒最重要的營養(yǎng)物質(zhì)來源之一，其主要包括甘油三酯（triglyceride，TG）、甘油二酯（diglyceride，DG）、游離脂肪酸、膽固醇等中性脂質(zhì)和甘油磷脂、鞘脂、糖脂等極性脂質(zhì)[1]，它們不僅在嬰兒出生的前6 個月中為嬰兒提供其所需的40%～50%的能量[2]，還是參與嬰幼兒腦部、視力發(fā)育及器官快速生長和生物膜合成的重要營養(yǎng)成分[3-5]。母乳作為嬰兒出生前6 個月中全部營養(yǎng)物質(zhì)的來源，可以滿足嬰幼兒生長發(fā)育的全部脂類需求，但可能由于母親身體健康狀況等原因，母乳喂養(yǎng)并不能完全實(shí)現(xiàn)。為使作為母乳替代品的嬰幼兒配方奶粉達(dá)到與母乳盡可能相似的生理功能，對母乳及其替代品原料的脂質(zhì)組分進(jìn)行完整分析具有重要意義。

脂質(zhì)組學(xué)是一門對生物體系脂質(zhì)進(jìn)行全面系統(tǒng)分析的研究學(xué)科[6]，利用先進(jìn)儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)對給定基質(zhì)中存在的脂質(zhì)進(jìn)行快速、高通量的分析鑒定是其重要研究內(nèi)容之一。雖然脂質(zhì)組學(xué)在生物學(xué)研究中的應(yīng)用呈指數(shù)增長，但其在乳脂質(zhì)研究方面仍處于起步階段[7]。多年以來，薄層色譜、氣相色譜等基礎(chǔ)分析手段都已經(jīng)被用于研究乳脂質(zhì)組成[8-9]，而近期隨著色譜與質(zhì)譜、核磁共振譜聯(lián)用等分析技術(shù)的發(fā)展，為乳脂質(zhì)組學(xué)的研究提供了更加多樣且可靠的技術(shù)手段。迄今為止，具有高分辨率和高通量特性的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法已經(jīng)成為脂質(zhì)組學(xué)分析中最常用的技術(shù)手段[1]。Beccaria等[10]開發(fā)了一種利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)高效檢定乳中TG的方法，并對母乳、牛乳及羊乳的TG組成進(jìn)行了分析，分別鑒定出了136、165 種及141 種TG。Kallio等[11]利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對中國和芬蘭地區(qū)母乳中TG組分進(jìn)行了分析，共檢出了300余種TG結(jié)構(gòu)；何楊波等[12]利用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿飛行時間質(zhì)譜法對中國東北地區(qū)母乳磷脂的組成進(jìn)行了分析，從母乳中檢出磷脂共計60 種。雖然目前對于母乳及其他乳的脂質(zhì)成分測定的研究已經(jīng)有所進(jìn)展，但大多數(shù)研究都是針對單一脂質(zhì)種類進(jìn)行的，對母乳及其他乳類進(jìn)行的全脂質(zhì)研究十分稀少且方法陳舊[13-14]，更鮮有從組學(xué)層面進(jìn)行的全脂質(zhì)組分研究。這使得目前關(guān)于母乳及一些作為母乳替代品的脂質(zhì)組成研究非常分散，難以形成描述母乳及其替代品脂質(zhì)組成的完整體系。

本研究采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupoletime of flight-mass spectrum，UPLC-QTOF-MS）聯(lián)用技術(shù)，對母乳、牛乳及羊乳的脂質(zhì)組成進(jìn)行表征，并通過單變量統(tǒng)計分析手段分析3 種乳中脂質(zhì)組成差異，以期為豐富中國母乳數(shù)據(jù)庫提供數(shù)據(jù)支撐，為嬰幼兒配方奶粉脂質(zhì)母乳化及乳脂質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

母乳采集自吉林省松原市的成熟健康母乳（（30f1）d），年齡20～25 歲，分娩健康足月兒，母乳充足，哺乳期間不吸煙、不飲酒，孕期或哺乳期間無乳腺炎、感染性疾病、心血管疾病、代謝性疾病、精神系統(tǒng)疾病、癌癥及其他惡性消耗性疾病，最近2 周沒有使用過藥物及催乳用西藥，并填寫知情通知書；牛乳及羊乳采集自黑龍江省五常市。樣品采集后分裝在已編碼的10 mL凍存管中，于—20 ℃冰箱中保存，直至使用。

1-十五烷?；?2-油?；?D7)磷脂酰乙醇胺（1-pentadecanoyl-2-oleoyl(D7)-sn-glycero-3-phosphoethanolamin，D7-PE）、1-油?；?D7)-2-羥基磷脂酰膽堿（1-oleoyl(D7)-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine，D7-LPC）、1,3-二十五烷?；?2-油?；?D7)甘油三酯（1,3-dipentadecanoyl-2-oleyol(D7)-glycerol，D7-TG）標(biāo)準(zhǔn)品 美國Avanti 公司；甲醇、甲基叔丁基醚、乙腈（均為色譜純） 德國CNW Technologies公司；醋酸銨、氨水、二氯甲烷、異丙醇（均為色譜純） 德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290 UPLC儀 美國Agilent公司；Triple TOF 6600型高分辨質(zhì)譜（配備Analyst TF 1.7控制軟件） 美國AB Sciex公司；Heraeus Fresco17冷凍微量離心機(jī) 美國Thermo Fisher Scientific公司；超聲儀 深圳雷德邦電子有限公司；超純水系統(tǒng) 德國Merck Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

分別取母乳、牛乳及羊乳乳樣各6 份，進(jìn)行脂質(zhì)提?。煌ㄟ^UPLC-QTOF-MS方法對3 種乳中脂質(zhì)種類及含量進(jìn)行測定后，對3 種乳中脂質(zhì)組成進(jìn)行差異分析。

1.3.2 樣品處理

脂肪提?。喝?0 μL樣品，加入340 μL H2O，加960 μL 5∶1（V/V）的甲基叔丁基醚-甲醇（含10 μL 10 μg/mL D7-PE（15∶0/18∶1），5 μL 100 μg/mL D7-L P C（1 8∶1），1 1 μ L 1 0 0 μ g/m L D7-T G（15∶0/18∶1/15∶0））；渦旋振蕩60 s，超聲處理10 min；4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液500 μL；重新加入500 μL甲基叔丁基醚，重復(fù)提取2 次，合并3 次上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下吹干；吹干后樣品用100 μL 1∶1（V/V）的二氯甲烷/甲醇復(fù)溶；取60 μL上清液于2 mL進(jìn)樣瓶，上機(jī)檢測[15]。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Phenomen Kinetex 1.7u C18100A Column（100 mmh2.1 mm）；流動相A：10 mmol/L醋酸銨+40% H2O+60%乙腈；流動相B：10 mmol/L醋酸銨+10%乙腈+90%異丙醇；流速300 μL/min。洗脫條件：0～12 min，60% A；12～13.7 min，0% A；13.7～18 min，60% A；進(jìn)樣量2 μL[16]。

1.3.4 質(zhì)譜條件

在控制軟件控制下基于IDA功能進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，采集強(qiáng)度最強(qiáng)且大于100的分子離子對應(yīng)的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。轟擊能量：35 eV，每50 ms采集15 張二級譜圖。電噴霧離子源參數(shù)設(shè)置為：霧化氣壓（GS1）60 Pa；輔助氣壓60 Pa；氣簾氣壓30 Pa，溫度550 ℃；噴霧電壓5 500 V[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用ProteoWizard軟件將原始質(zhì)譜轉(zhuǎn)化為mzXML格式。再使用XCMS軟件進(jìn)行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作。使用基于XCMS軟件、R程序包及脂質(zhì)二級數(shù)據(jù)庫進(jìn)行脂質(zhì)鑒定及定量工作；使用SPSS 23.0和Simca 14.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析和單變量統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 母乳、牛乳及羊乳脂質(zhì)組成

圖1為母乳、牛乳及羊乳基于UHPLC-QTOF-MS法在正離子模式下掃描得到的總離子流圖譜，表1為在3 種乳中鑒定出的脂質(zhì)種類及含量。如表1所示，本研究從3 種乳中均檢出脂質(zhì)103 種，其中包括磷脂酰膽堿（phosphatidylcholines，PC）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）及己糖苷神經(jīng)酰胺（hexosylceramides，HexCer）4 類極性脂質(zhì)和TG、DG 2 類中性脂質(zhì)。但脂質(zhì)中常見的其他3 類極性脂質(zhì)磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸在本研究中未檢測到。這可能是由這些極性脂質(zhì)分子在離子化時所帶電荷導(dǎo)致的[17]。

圖1 母乳（a）、牛乳（b）及羊乳（c）總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of human (a), bovine (b)and caprine milk (c)

表1 母乳、牛乳及羊乳中脂質(zhì)種類及含量（n＝6）Table 1 Types and concentrations of lipids identi fi ed in human,bovine and caprine milk (n= 6)

續(xù)表1

2.2 母乳、牛乳及羊乳極性脂質(zhì)差異分析

如圖2所示，母乳含量最高極性脂質(zhì)種類是SM（468.82 μg/mL），其次是Cer（422.98 μg/mL），而后則是PC（62.587 μg/mL）與HexCer（22.57 μg/mL），母乳中高含量的SM已經(jīng)被一些研究證實(shí)，但關(guān)于母乳中Cer的高含量研究很少[18-19]，Cer既是合成SM的前體也是SM的分解產(chǎn)物[20]，二者在母乳中的高含量可能存在對應(yīng)關(guān)系。在母乳不同的脂質(zhì)類別中（表1），PC主要與飽和脂肪酸相連，其中PC（P-20∶0/18∶0）、PC（P-20∶0/20∶0）是含量最高的PC種類，共占母乳PC含量的58%，這與Yao Yunping等[19]的結(jié)論有所出入，可能是由于含不飽和脂肪酸的PC在離子化時主要以陰離子形式存在導(dǎo)致的；母乳中的主要Cer則是Cer（d18∶1/22∶0）、Cer（d18∶1/24∶1）和Cer（d18∶1/24∶0），母乳總Cer約61%；母乳中含量最高的SM種類為SM（d16∶0/26∶1），質(zhì)量濃度高達(dá)317.2 μg/mL，占母乳總SM含量的67%，其次為SM（d14∶1/26∶1），含量為44.98 μg/mL；此外，本研究鑒定出的母乳中3 種HexCer里，HexCer（d17∶0/24∶1）和HexCer（d18∶1/16∶0）是其中的主要HexCer種類。

圖2 母乳、牛乳及羊乳中各類極性脂質(zhì)總質(zhì)量濃度Fig. 2 Total contents of different classes of polar lipids in human,bovine and caprine

與母乳相似的是，牛乳極性脂質(zhì)質(zhì)量濃度同樣遵循SM（22.46 μg/mL）＞Cer（12.46 μg/mL）＞PC（5.42 μg/mL）＞HexCer（5.06 μg/mL）的趨勢。具體種類中，PC（P-20∶0/18∶0）、PC（P-20∶0/20∶0）及PC（P-20∶0/9∶0）是牛乳中主要的PC種類，占牛乳中PC的54%；Cer（d18∶1/16∶0）及Cer（d18∶1/22∶0）則是牛乳中主要的Cer種類；牛乳中主要SM種類為SM（d15∶0/24∶1）、SM（d14∶0/20∶0）及SM（d14∶0/18∶1），共占牛乳中SM的54%；牛乳中含量最高的HexCer種類則與母乳相同，為HexCer（d17∶0/24∶1）和HexCer（d18∶1/16∶0）。

與母乳及牛乳不同，在羊乳中Cer（625.91 μg/mL）是含量最高的極性脂質(zhì)種類，其次為SM（555.93 μg/mL）和H e x C e r（1 7 5.5 1 μ g/m L），而P C含量最低（105.65 μg/mL），這一結(jié)果與Castro等[21]的研究結(jié)果有所差異，可能與羊品種及飼喂方式有關(guān)。羊乳中PC（P-20∶0/18∶0）、PC（P-16∶0/2∶0）及PC（P-20∶0/9∶0）3 種PC的含量遠(yuǎn)高于其他種類PC，C20:0、C16:0及C18:0是其含量最高的3 種脂肪酸；Cer（d18∶1/16∶0）是羊乳中含量最高的Cer類型，占其總Cer的47%；羊乳中主要SM種類則為SM（d16∶0/26∶1）、SM（d15∶0/24∶1）和SM（d14∶0/18∶1），共占羊乳中SM的48%；羊乳中HexCer種類同樣以HexCer（d17∶0/24∶1）和HexCer（d18∶1/16∶0）為主，占羊乳中HexCer的98%以上。

對比3 種乳中極性脂質(zhì)含量可以發(fā)現(xiàn)，母乳中極性脂質(zhì)含量低于羊乳，而顯著高于牛乳（P＜0.05），與其他研究中結(jié)論有所出入，這與牛乳產(chǎn)地差異或飼料差異有關(guān)[17-18]。另外，母乳中SM連接的超長鏈脂肪酸比例遠(yuǎn)高于牛乳及羊乳。包含超長鏈脂肪酸的SM是構(gòu)成脂肪球膜上脂閥結(jié)構(gòu)的主要物質(zhì)，這種特殊結(jié)構(gòu)構(gòu)成了微生物、細(xì)菌、病毒的特定黏附位點(diǎn)，是乳脂肪球膜的殺菌功能的重要來源[22]，母乳中高含量的超長鏈脂肪酸SM可能意味著母乳脂肪球在抗菌功能上強(qiáng)于牛乳和羊乳。

對不同乳的極性脂質(zhì)進(jìn)行單變量統(tǒng)計分析，篩選變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP，表示每個物質(zhì)對差異所起的貢獻(xiàn)值）大于1、P值小于0.05的脂質(zhì)為2 種乳間差異脂質(zhì)，結(jié)果見表2。發(fā)現(xiàn)牛乳與母乳間具有顯著差異的極性脂質(zhì)共有11 種，主要為SM類，其中SM（d14∶0/20∶0）與SM（d15∶0/24∶1）2 種在母乳中含量較高且差異最為顯著。此外牛乳在3 種HexCer上與母乳間都存在顯著差異（VIP＞1，P＜0.05），而研究表明HexCer是生物體各種膜結(jié)構(gòu)的重要組分，在細(xì)胞表面發(fā)生的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[23]，這一作用與人體免疫應(yīng)答、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞識別及分化有著重要關(guān)聯(lián)[24]，因此，在以牛乳為基料制備嬰幼兒配方奶粉時，對HexCer成分的調(diào)整可能會具有重要意義。羊乳與母乳間存在顯著差異的極性脂質(zhì)只有PC（26∶0/0∶0）一種，而牛乳與羊乳在磷脂方面不存在顯著差異種類。整體來看，在極性脂質(zhì)組成方面，羊乳與母乳間差異較牛乳與母乳間更小，更適合用于生產(chǎn)母乳替代品。

表2 母乳、牛乳及羊乳中具有顯著差異的極性脂質(zhì)種類Table 2 Polar lipids that significantly differed among human,bovine and caprine milk

2.3 母乳、牛乳及羊乳中性脂質(zhì)差異分析

如圖3所示，母乳中DG含量與其他組分相比相對較高（38 405.11 μg/mL），甚至高于母乳中TG含量（9 344.29 μg/mL），該結(jié)果與早期研究存在一定差異，本研究中所用方法檢測到的DG種類遠(yuǎn)多于其他研究，而TG種類相對較少。這可能是導(dǎo)致結(jié)果存在差異的主要原因[25-26]。由表1可知3 種乳中中性脂質(zhì)的具體組成情況，DG（18∶2/18∶2）是母乳中含量最高的DG種類，質(zhì)量濃度高達(dá)18 552.24 μg/mL，占母乳中DG的48%；TG（16∶0/18∶1/18∶2）、TG（16∶0/18∶0/18∶1）、TG（18∶1/18∶2/18∶2）則是母乳中主要的TG種類，共占母乳TG的65%。牛乳中，TG質(zhì)量濃度（9 236.37 μg/mL）則遠(yuǎn)高于DG（386.54 μg/mL），主要DG種類為DG（16∶0/16∶0）、DG（18∶1/18∶1），二者共占牛乳中DG含量的46%，牛乳TG中則是TG（16∶0/18∶0/18∶1）質(zhì)量濃度最高（3 263.08 μg/mL）。羊乳DG質(zhì)量濃度（5 043.48 μg/mL）則與TG相對接近（6 284.82 μg/mL），其中DG（18∶1/18∶1）約占羊乳DG總量的40%，而TG（16∶0/18∶0/18∶1）則約占羊乳TG含量的34%。通過對比可以看出，母乳中DG含量顯著高于牛乳及羊乳（P＜0.05），這可能是致使母乳喂養(yǎng)嬰兒肥胖率相對較低的原因之一[27-28]。

圖3 母乳、牛乳及羊乳中中性脂質(zhì)總質(zhì)量濃度Fig. 3 Total contents of different classes of neutral lipids in human,bovine and caprine milk

通過單變量統(tǒng)計分析，篩選3 種乳中具有顯著差異（VIP＞1，P＜0.05）的中性脂質(zhì)種類，結(jié)果見表3。其中牛乳與母乳間具有顯著差異的脂質(zhì)種類最多，包括12 種DG和13 種TG，而羊乳中與母乳具有顯著差異的DG只有DG（20∶2/20∶2），TG則有12 種；牛乳與羊乳的中性脂質(zhì)組成相對接近，僅有3 種TG存在顯著差異（VIP＞1，P＜0.05）?？梢钥闯?，牛羊乳與母乳存在顯著性差異的中性脂質(zhì)主要為TG，且TG（17∶2/18∶0/20∶5）在3 種乳中都存在顯著性差異（VIP＞1，P＜0.05）。此外，牛乳和羊乳在TG（12∶0/12∶0/16∶1）、TG（12∶0/12∶0/16∶0）、TG（12∶0/18∶1/16∶1）3 種中鏈脂肪酸甘油三酯（medium chain triglycerides，MCT）上都與母乳存在顯著差異（VIP＞1，P＜0.05）。MCT較容易被人體吸收且對改善糖、脂、膽固醇代謝有一定積極作用[29-30]，牛乳及羊乳在MCT上與母乳的差異可能會對嬰幼兒生長發(fā)育具有潛在的影響。此外，母乳中含有亞油酸（C18:2）的DG和TG含量顯著高于牛乳和羊乳（P＜0.05），這一趨勢與母乳中亞油酸含量遠(yuǎn)高于牛乳及羊乳的趨勢相似[31]。而亞油酸在嬰兒視力、智力發(fā)育、預(yù)防過敏等方面具有重要作用[32]，牛乳與羊乳在亞油酸上與母乳的巨大差異是十分值得注意的。

表3 母乳、牛乳及羊乳中具有顯著差異的中性脂質(zhì)種類Table 3 Neutral lipids that significantly differed among human,bovine and caprine milk

3 結(jié) 論

通過母乳、牛乳及羊乳脂質(zhì)組成的全面定性定量分析發(fā)現(xiàn)，牛乳與母乳間具有顯著性差異的脂質(zhì)種類多達(dá)36 種，主要集中在TG、DG和SM；而羊乳與母乳間具有顯著差異的脂質(zhì)種類相對較少，為14 種，主要集中在TG。母乳中的主要極性脂質(zhì)為SM，且SM（d14∶0/20∶0）與SM（d15∶0/24∶1）含量顯著高于牛乳，而與羊乳無顯著差異；此外牛乳HexCer與母乳存在顯著差異，對嬰兒免疫應(yīng)答及發(fā)育具有潛在影響；中性脂質(zhì)方面，母乳中DG含量顯著高于牛羊乳（P＜0.05），這種差異對減少嬰兒肥胖的發(fā)生有一定作用。從脂質(zhì)組成角度來看，羊乳與母乳間的差異比牛乳與母乳更小。本研究揭示了母乳、牛乳和羊乳脂質(zhì)組成和差異情況，豐富了我國母乳研究數(shù)據(jù)，并為嬰幼兒配方奶粉中脂質(zhì)的優(yōu)化和調(diào)整提供了更多參考依據(jù)。