劉立兵，李睿文，陳志敏，王金鳳，孫曉霞，袁萬哲,*，王建昌,*

（1.石家莊海關(guān)，河北 石家莊 050051；2.河北省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，河北 石家莊 050051；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens），又稱為魏氏梭菌（Clostridiumwelchii），是一種革蘭氏陽性厭氧菌，也是一種人獸共患病病原體[1]。根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的α、β、ε、ι四種主要毒素，可以將之分為A、B、C、D和E型[2-3]。不同型的產(chǎn)氣莢膜梭菌可以導(dǎo)致不同的疾病，均具有發(fā)病急、死亡率高等特點[4]。產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛分布在土壤、污水等自然環(huán)境中，引起的食物中毒事件在我國非常嚴(yán)重，攝入被產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的食物后，能夠引起惡心、腹瀉等臨床癥狀，從而引發(fā)肌壞死性疾病[5]；羔羊、仔豬、牛犢、雛雞等動物感染產(chǎn)氣莢膜梭菌，會導(dǎo)致壞死性腸炎、腸毒血癥等疾病[6]。產(chǎn)氣莢膜梭菌污染給人類健康和畜牧業(yè)健康發(fā)展造成了巨大的危害，因此對產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測對于疫病防控和食品安全保障具有重要意義。

目前，針對產(chǎn)氣莢膜梭菌的傳統(tǒng)檢測方法主要有分離培養(yǎng)、細胞素方法、卵磷脂水解實驗和反向間接乳凝膠結(jié)實驗等[7-9]，存在檢測周期長、技術(shù)要求高、過程繁瑣等不足。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一系列針對產(chǎn)氣莢膜梭菌的新方法被建立并得到了廣泛應(yīng)用。孫佳芝等[10]建立了靈敏度為4.57 μg/L的雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測方法；鮑長磊[11]建立了產(chǎn)氣莢膜梭菌不同毒素型多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和α毒素抗體ELISA檢測方法；石玉玲等[12]根據(jù)16S rRNA基因建立了實時熒光PCR方法，靈敏度則為9h102CFU/mL；劉哲等[13]建立了特異性檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法，靈敏度為2.92h102CFU/mL。ELISA方法檢測靈敏度不高，試劑盒價格昂貴，且需要特異性設(shè)備；LAMP方法需要4～6 條引物，設(shè)計復(fù)雜，且極易造成假陽性結(jié)果[14]。因此，建立一種反應(yīng)快速、操作簡便、靈敏性高的檢測方法對于產(chǎn)氣莢膜梭菌的有效控制依然具有重要意義。

聚合酶重組酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一種等溫擴增技術(shù)，主要依賴于重組酶、具有聚合鏈置換功能的DNA聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白3 種核心蛋白實現(xiàn)對靶基因的等溫擴增[15]。在反應(yīng)過程中，重組酶結(jié)合引物形成蛋白-DNA混合物并啟動尋找模板DNA上的同源序列。同源序列定位后，則會引發(fā)鏈置換反應(yīng)，引物結(jié)合到對應(yīng)模板上，具有鏈置換功能的DNA聚合酶進而從引物3’末端開始啟動DNA合成，實現(xiàn)對靶基因的指數(shù)級擴增[9]。RPA能夠在37～42 ℃恒溫條件下20 min內(nèi)完成對靶基因的有效擴增，特別適用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種食源性致病菌的快速檢測[16-18]。

本研究根據(jù)編碼A～E型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的plc基因的高度保守區(qū)域，設(shè)計特異性引物和探針，建立實時熒光PCR和實時熒光RPA方法，并使用人工污染樣品對兩種方法進行驗證和比較，以期為食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測提供有效技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用菌種見表1。

表1 實驗菌株Table 1 Bacterial strains used in this study

胰胨亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、0.1%蛋白胨水 北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Premix ExTaq寶生物工程（大連）有限公司；TwistAmpTMexokit 英國TwistDx公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7 5 0 0實時熒光P C R儀 美國A B I公司；Genie III等溫擴增熒光檢測系統(tǒng) 英國OptiGene公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計

參考GenBank中登錄的產(chǎn)氣莢膜梭菌plc基因（登錄號：NC_008261.1），比對確定特異性保守序列，設(shè)計特異性引物和探針。所有引物探針均由生工生物工程（上海）有限公司合成，序列信息見表2。

表2 實驗所用引物及探針Table 2 Primers and probes used in real-time RPA and real-time PCR

1.3.2 基因組DNA的提取

將產(chǎn)氣莢膜梭菌（ATCC 13124）接種到液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)20 h。取純培養(yǎng)菌液1 mL，加入到1.5 mL離心管中，11 500 r/min離心1 min，收集沉淀。采用細菌基因組DNA提取試劑盒進行DNA的提取，使用NanoDrop 2000 C超微量分光光度計測定濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實時熒光RPA方法的建立

以1.3.2節(jié)制備的產(chǎn)氣莢膜梭菌DNA為模板，采用引物RPA-F/R和exo探針，使用TwistAmpTMexokit配制實時RPA反應(yīng)體系（50 μL）：RPA-F/R（10 μmol/L）各2.1 μL，exo探針（10 μmol/L）0.6 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 12.2 μL，將其混勻，加入到裝有凍干酶制劑的反應(yīng)管中，吹吸至完全溶解，再加入2.5 μL 280 mmol/L MgAc，蓋緊管蓋，瞬時離心并渦旋后，放入Genie III中，39 ℃反應(yīng)20 min。在擴增過程實時收集檢測熒光信號，目的基因擴增后熒光信號會明顯增加。

1.3.4 實時熒光 PCR方法的建立

以1.3.2節(jié)制備的產(chǎn)氣莢膜梭菌DNA為模板，采用引物PCR-F/R和探針TaqMan Probe建立實時熒光PCR體系為（25 μL）：Premix ExTaq12.5 μL，PCR-F/R（10 μmol/L）各1.0 μL，PCR-Probe（10 μmol/L）1 μL，DNA模板1 μL，補水至25 μL。將上述體系充分振蕩混勻后，瞬時離心，放入7500實時熒光PCR儀中，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸35 s，40 個循環(huán)，60 ℃收集熒光信號。

1.3.5 特異性和靈敏度實驗

以表1所示菌株DNA為模板，根據(jù)1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)建立的方法進行檢測，分析實時熒光RPA和實時熒光PCR方法的特異性。

提取1 mL純培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌的基因組DNA，并測定其濃度，進行10 倍倍比稀釋，以不同稀釋度的基因組DNA作為模板，根據(jù)1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)建立的方法進行檢測，分析比較實時熒光RPA和實時熒光PCR方法的靈敏度。

1.3.6 對人工污染樣品的檢測比較

使用經(jīng)GB 4789.13ü2012《食品微生物學(xué)檢驗 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗》檢測確定不含產(chǎn)氣莢膜梭菌的奶粉、雞肉、牛肉和羊肉樣品，分別取25 g加入到225 mL滅菌的0.1%蛋白胨水中，拍打均勻。取出9 mL樣品均液，加入一定濃度的產(chǎn)氣莢膜梭菌純培養(yǎng)液，使之濃度為1.0h106CFU/mL。拍打混勻，取1 mL人工污染產(chǎn)氣莢膜梭菌的樣品均液，用未污染產(chǎn)氣莢膜梭菌的樣品均液進行10 倍倍比稀釋，每個稀釋度分別取1 mL進行核酸提取，并以之作為模板分別通過實時熒光RPA和實時熒光PCR方法進行檢測。同時取各個稀釋的樣品菌液按照GB 4789.13ü2012方法進行平板計數(shù)，將3 種方法的檢測結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 實時熒光RPA和實時熒光PCR方法的特異性

通過建立的實時熒光RPA和實時熒光PCR方法，分別以產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA和表1中的其他細菌基因組DNA為模板，進行特異性實驗分析。表3表明，兩種方法僅產(chǎn)氣莢膜梭菌有特異性擴增曲線，而其他菌株均無擴增曲線。上述結(jié)果表明建立的實時熒光RPA和實時熒光PCR方法均具有良好的特異性。

表3 實時熒光RPA和實時熒光PCR方法特異性分析Table 3 Speci fi cities of real-time RPA and real-time PCR assays

2.2 實時熒光RPA和實時熒光PCR的靈敏度

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌實時熒光RPA（A）和實時熒光PCR（B）方法的敏感性Fig. 1 Sensitivities of real-time RPA (A) and real-time PCR (B) for C. perfringens detection

測定所提取的產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組D N A為1.3h105pg/μL，將其10 倍倍比稀釋至1.3h10-1pg/μL，分別進行實時熒光RPA和實時熒光PCR檢測。結(jié)果表明，實時熒光RPA和實時熒光PCR方法的檢出限一致，均為1.3 pg/μL（圖1）。

2.3 人工污染樣品檢測結(jié)果

對于人工污染產(chǎn)氣莢膜梭菌的奶粉、雞肉、牛肉和羊肉樣品，每個稀釋度取1 mL模擬污染液，提取核酸，分別進行實時熒光RPA和實時熒光PCR方法檢測，與按照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789.13ü2012）的檢測進行對比分析。結(jié)果表明，實時熒光RPA和實時熒光PCR方法的最低檢出限均為1.0h102CFU/mL，與標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.13ü2012檢測方法的靈敏度一致（表4）。實時熒光RPA能夠在20 min內(nèi)完成檢測，僅需要3～13 min即可實現(xiàn)對所有陽性樣品的檢測，而實時熒光PCR完成整個反應(yīng)則需要55 min左右，需要24～46 min（Ct值為17.45～33.65）實現(xiàn)對陽性樣品的檢測。實時熒光RPA方法在陽性樣品的確認時間上明顯優(yōu)于實時熒光PCR方法，而在標(biāo)準(zhǔn)檢測中，需要在36 ℃進行20～24 h的增菌，在檢測時間方面較前兩種方法更長。

表4 人工污染樣品檢測結(jié)果Table 4 Results of detection of artificially contaminated samples

3 討 論

食源性致病菌是影響食品安全的重要因素之一。由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒報道事件逐年上升，對人類的健康造成了嚴(yán)重影響。建立一種快速、特異、精準(zhǔn)的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測方法，對人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展有重要意義。本研究采用實時熒光RPA技術(shù)檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌。實時熒光RPA反應(yīng)是基于RPA反應(yīng)體系中加入exo探針，擴增過程中產(chǎn)生的熒光信號通過熒光檢測儀實現(xiàn)實時檢測，作為一種等溫擴增技術(shù)，它具有特異性強、靈敏性高、反應(yīng)快速等優(yōu)點，在細菌檢測方面、病毒檢測等方面應(yīng)用廣泛[19-23]。實時熒光PCR是PCR體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR過程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行分析的技術(shù)，該技術(shù)以其特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，在食源性致病菌檢測[12,24-25]、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測[26]，以及致病性鉤端螺旋體[27]和兔熱病桿菌檢測[28]中都得到廣泛的應(yīng)用。

plc基因編碼的α毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要外毒素，存在于A～E型產(chǎn)氣莢膜梭菌中，是導(dǎo)致畜禽壞死性腸炎、腸毒血癥、氣性壞疽等疾病的主要致死因素，其毒性最強，是國內(nèi)外研究產(chǎn)氣莢膜梭菌最多的毒素[29-30]。本研究根據(jù)plc基因設(shè)計特異性的引物和探針，建立的實時熒光RPA和實時熒光PCR方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌具有很好的特異性，不同類型的標(biāo)準(zhǔn)株和分離株均得到了特異性擴增。對于人工污染樣品，兩種方法的最低檢出限均為1.0h102CFU/g，但實時熒光RPA方法的檢測時間（20 min）明顯少于實時熒光PCR方法（55 min），極大地縮短了實際樣品的檢測周期，更適合于實際樣品的快速檢測。

本研究使用Genie III實時熒光RPA運行設(shè)備，大小為25 cmh16.5 cmh8.5 cm，質(zhì)量僅為1.75 kg左右，具有體積小、便攜式的特點，而且適用鋰電池充電工作，可以維持設(shè)備24 h的運行，非常適合實驗設(shè)備相對落后的基層檢測部門，以及食源性疫情的現(xiàn)場檢測，為產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速現(xiàn)場診斷提供了有效的技術(shù)手段。