唐立偉, 李 想, 左晨旭, 陸文蔚, 韓 梅

上海商學(xué)院，上海 200235

乳酸桿菌是乳酸菌中最大的一個屬，是一類能夠發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌，常用于益生菌粉的生產(chǎn)和酸奶發(fā)酵。乳酸桿菌的形態(tài)多樣，有長桿狀、短桿狀、柵欄狀[1]。目前已被發(fā)現(xiàn)的乳酸桿菌超過60個種，按照發(fā)酵類型可分為同型發(fā)酵群(嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌等)、兼性異型發(fā)酵群(干酪乳桿菌)和專性異型發(fā)酵群(高加索酸奶乳桿菌)；按照菌種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系可分為植物乳桿菌群、唾液乳桿菌群、嗜酸乳桿菌群等8個群體[2]。

人體的腸道內(nèi)有上百類菌種，各菌種間相互作用，協(xié)調(diào)制約，維持腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡。乳酸桿菌可以定植在機體腸道內(nèi)，與宿主體內(nèi)不正常的細(xì)菌競爭，提高腸道菌群中乳酸菌的優(yōu)勢，乳酸菌產(chǎn)生的抗菌素可以阻止部分病毒侵入宿主細(xì)胞，維持微生態(tài)系統(tǒng)的平衡，能夠改善和治療腸道疾病[3-5]。乳酸桿菌具有提高機體免疫的能力，調(diào)節(jié)機體特異性和非特異性免疫的作用[6-8]。乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物還具有抗氧化能力，可以清除自由基O2-、DPPH、羥自由基等[9-11]。所以乳桿菌被廣泛的應(yīng)用于益生菌產(chǎn)品的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 菌種

副干酪乳酸桿菌(科漢森)；鼠李糖乳桿菌(科漢森)；瑞士乳酸桿菌(丹尼斯科)；嗜酸乳酸桿菌(科漢森)。

1.2 主要試劑

MRS培養(yǎng)基、氫氧化鈉、牛奶等。

1.3 乳飲料的制備

鮮奶→分裝→95 ℃滅菌2 h→冷卻到37 ℃→接種→發(fā)酵→乳飲料基料

稱取200 g純牛奶于250 mL的玻璃瓶中，在 105 ℃溫度條件下高壓蒸汽滅菌15 min。牛奶滅菌后將其放入超凈工作臺內(nèi)，待牛奶冷卻，使用移液槍接入2%培養(yǎng)好的乳酸桿菌種子液，放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵。分別于24 h、48 h和72 h監(jiān)測基料的各項指標(biāo)。

水→白砂糖(9%)、果膠(0.3%)→攪拌配料(60 ℃～65 ℃)→殺菌(90 ℃～95 ℃，10 min)→冷卻→基料(30%)混合攪拌(15 min ～20 min)→無菌均質(zhì)[室溫，一級壓力(16.5±0.5)MPa，二級壓力(3.5±0.5)MPa]→灌裝→冷藏

1.4 分析方法

酸度的測定：取10 g發(fā)酵乳，加入20 mL的水，用0.1 mol/L的氫氧化鈉滴定到酚酞呈紅色所用氫氧化鈉的量。

菌種計數(shù)：將牛奶梯度稀釋后，澆注平板，在MRS上生長的為乳桿菌，取菌數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)。

有機酸的測定：配制0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液，并用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸溶液調(diào)整該溶液至pH為2.8，加入1%的甲醇，經(jīng)水系膜過濾兩次。色譜柱為Agilent SB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長210 nm，進樣量20 μL，檢測時長為10 min。

樣品的處理：稱取一定量的樣品，6 000 r/min離心10 min，吸取上清液用水系膜過濾兩次到小樣品管中，待用。

乳酸菌耐胃酸實驗：配制0.1 mol/L 檸檬酸，用0.2 mol/L Na2HPO4將檸檬酸溶液的pH調(diào)整到2.5和3.0，將乳酸菌發(fā)酵液離心后用十倍體積的緩沖液懸浮，37 ℃保溫放置，測0 h和3 h時的活菌數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸桿菌發(fā)酵牛乳過程中pH、滴定酸度變化

原料乳在發(fā)酵過程中，在一定時間范圍內(nèi)，發(fā)酵乳的pH會隨著乳酸的積累而降低，如圖1所示，不同種類的乳桿菌，其發(fā)酵能力不盡相同。從pH來看，瑞士乳桿菌的pH明顯低于其他四類乳桿菌；鼠李糖乳桿菌在48 h后基本停止產(chǎn)酸，pH不再明顯變化?？偟膩碚f五種桿菌發(fā)酵的乳品在48 h后，pH的變化幅度減小。72 h內(nèi)五種乳酸桿菌的pH大小為瑞士乳桿菌<嗜酸乳桿菌<副干酪乳桿菌<鼠李糖乳桿菌。

鼠李糖乳桿菌

副干酪乳桿菌

嗜酸乳桿菌

瑞士乳桿菌

圖1 四種乳桿菌的酸度和pH

從酸度來看，24 h內(nèi)，五類乳酸桿菌的酸度都達(dá)到100 °T以上，由此可見，乳桿菌在發(fā)酵過程中具有較強的產(chǎn)酸特性。瑞士乳桿菌仍表現(xiàn)出顯著超過其他桿菌的產(chǎn)酸能力，24 h酸度已超過200 °T，72 h可達(dá)到323 °T。據(jù)研究，絕大部分乳酸球菌的最大產(chǎn)酸量一般只能達(dá)到64 °T ～ 90 °T的范圍[12]，而乳桿菌發(fā)酵乳酸度可達(dá)100 °T～200 °T，甚至超過300 °T，其產(chǎn)酸能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于乳酸球菌。據(jù)資料顯示，符合大眾口感與品質(zhì)需求的酸奶，pH一般在4.2～4.4范圍內(nèi)，滴定酸度在70 °T左右[13]。因此，乳酸桿菌不適用于制備傳統(tǒng)的發(fā)酵乳，反而更適用于乳飲料，比如養(yǎng)樂多、褐色乳酸菌飲料產(chǎn)品。

利用Cinac乳品發(fā)酵監(jiān)控儀監(jiān)測發(fā)酵乳24 h內(nèi)pH變化，由圖2可以明顯看出，四種乳桿菌pH都隨著發(fā)酵時間的增加而降低。其中瑞士乳桿菌發(fā)酵乳pH的下降速率最快，副干酪乳桿菌發(fā)酵乳pH變化速率最低，因此瑞士乳桿菌的產(chǎn)酸能力最強。瑞士乳桿菌發(fā)酵乳pH曲線在20 h后下降趨勢減緩，而鼠李糖乳桿菌和干酪乳酸桿菌仍在平穩(wěn)下降。

圖2 五種乳桿菌的發(fā)酵曲線

2.2 乳桿菌發(fā)酵不同原料乳過程中的活菌數(shù)

由表1的實驗數(shù)據(jù)顯示，四種乳桿菌在發(fā)酵4%蛋白含量的脫脂乳粉時，3 d內(nèi)其活菌數(shù)相比發(fā)酵牛乳和3%蛋白含量脫脂乳粉更適宜于活菌數(shù)的積累，因為牛奶蛋白有較好的緩沖能力。但是如果蛋白質(zhì)含量進一步升高，基料中固形物含量過高，而導(dǎo)致生產(chǎn)過程原料輸送困難。鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌在發(fā)酵過程中菌數(shù)不斷增加，但是瑞士乳桿菌，發(fā)酵一天后活菌數(shù)開始衰減，嗜酸乳桿菌從第二天也開始衰減。所以后續(xù)飲料的制備采用4%的蛋白含量制備發(fā)酵乳飲料基料。鼠李糖和副干酪乳桿菌采用72 h發(fā)酵，嗜酸乳桿菌發(fā)酵48 h，瑞士乳桿菌發(fā)酵24 h。

表1 五種乳桿菌發(fā)酵3 d內(nèi)活菌數(shù)

2.3 發(fā)酵乳飲料的制備

市面上出售的活菌型乳酸菌飲料，保質(zhì)期一般為21 d，在保質(zhì)期內(nèi)，發(fā)酵乳的活菌數(shù)越多，保質(zhì)期內(nèi)衰減量越低，乳品品質(zhì)評價也越高。因此通過追蹤21 d內(nèi)五種乳酸桿菌的活菌數(shù)，篩選出品質(zhì)最優(yōu)的菌株來投入到原料乳發(fā)酵中。

從表2和表3可以看出，7 d 內(nèi)五種乳桿菌的活菌數(shù)沒有較大的變動，基本都在一個數(shù)量級上波動；7 d后發(fā)酵乳內(nèi)的活菌數(shù)開始逐漸降低，7 d ～ 14 d內(nèi)乳酸桿菌死亡速率較快。在整個貨架期內(nèi)，副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的活力保持較好，瑞士乳桿菌和嗜酸乳桿菌在7 d以后菌數(shù)下降較快，降低2～3個數(shù)量級，存活率不足1%。

表2 發(fā)酵乳基料21 d內(nèi)活菌數(shù)變化

表3 乳飲料貨架期內(nèi)活菌數(shù)

2.4 乳飲料中有機酸的定性分析

發(fā)酵乳中決定風(fēng)味的重要物質(zhì)主要是一些揮發(fā)性和非揮發(fā)性有機酸。乳品中的有機酸具有抑制有害細(xì)菌繁殖的作用，還可以提高發(fā)酵乳的安全性。因此，乳品中保證適當(dāng)?shù)挠袡C酸種類及含量，對于乳品生產(chǎn)中的質(zhì)量監(jiān)測十分重要。發(fā)酵乳中的天然有機酸種類主要有乙酸、丁酸、檸檬酸、乳酸、丙酮酸、甲酸、丙酸[14]。

目前有機酸定量定性的方法主要有高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法和氣相質(zhì)譜連用法等。HPLC法操作簡單、靈敏度高、快速準(zhǔn)確和應(yīng)用廣泛。本文通過高效液相色譜法對4種乳桿菌代謝產(chǎn)生的有機酸進行了分析，如圖3所示。標(biāo)準(zhǔn)混合樣品中含有草酸、甲酸、D-蘋果酸、維生素C、乳酸、乙酸、檸檬酸和L-蘋果酸，并且按照相應(yīng)時間依次出峰。對應(yīng)四種乳桿菌制備的發(fā)酵乳的液相色譜圖可知，四種發(fā)酵乳的有機酸種類大致相同，都以乳酸為主，含有少量的乙酸，更少量的草酸、檸檬酸和L-蘋果酸，它們都是發(fā)酵乳酸味的主要來源物質(zhì)，賦予發(fā)酵乳獨特的風(fēng)味。所以用這四種乳桿菌制備的發(fā)酵乳，有機酸的種類差異較小。

圖3 四種乳桿菌發(fā)酵乳色譜圖

2.5 乳桿菌耐胃酸的性質(zhì)

乳桿菌只有能耐受人體胃酸才能順利到達(dá)大腸定植，發(fā)揮其益生菌的功效，所以乳酸菌對胃酸的耐受活力一直是優(yōu)良乳酸菌的篩選標(biāo)準(zhǔn)。由表4可知，四種乳桿菌在pH 3.0時都有很高的存活率。但當(dāng)pH降低到2.5時，存活率極具下降，尤其是瑞士乳桿菌和副干酪乳桿菌，鼠李唐乳桿菌的耐酸性最好，其次是副干酪乳桿菌。所以正常情況下人體胃液的pH在2.0左右，可以殺死大部分益生菌，益生菌產(chǎn)品不建議空腹食用。

表4 四種乳酸菌對胃酸的耐受性

3 結(jié)論

4株乳桿菌都可以代謝乳糖產(chǎn)生乳酸，并且有機酸組成類似。瑞士乳桿菌的產(chǎn)酸速率最快，但是貨架期內(nèi)活菌數(shù)衰減最快。副干酪乳桿菌發(fā)酵速度最慢，但是產(chǎn)品貨架期內(nèi)活菌數(shù)比較高，產(chǎn)品穩(wěn)定性好。鼠李糖乳桿菌耐胃酸能力最好，并且貨架期穩(wěn)定性優(yōu)良。本文為乳酸菌飲料的開發(fā)提供了參考依據(jù)，后續(xù)可以研究不同乳桿菌之間的復(fù)配，在提高產(chǎn)酸速率的同時，提高產(chǎn)品貨架期內(nèi)活菌數(shù)。