嚴 鋒， 張 方， 袁林江

1.廣州資源環(huán)?？萍脊煞萦邢薰?，廣州 510699；2.中信環(huán)境技術(shù)(廣州)有限公司，廣州 510660；3.西安建筑科技大學，西安 710055

Anammox菌增殖速度慢，使得反應(yīng)器啟動時間長而且難以富集功能菌，因此該工藝的大規(guī)模應(yīng)用受到很大限制[1]。UASB(upflow anaerobic sludge blanket)反應(yīng)器具有構(gòu)造簡單、污泥截留能力強，培養(yǎng)的污泥沉降性能好，耐負荷波動強等優(yōu)點，常作為Anammox快速啟動反應(yīng)器[2-4]。但UASB反應(yīng)器中污泥床在上升流速較低產(chǎn)氣量不足時，污泥床致密易導(dǎo)致基質(zhì)傳遞效果不良等問題[5]，從而影響反應(yīng)器運行效果。

生物反應(yīng)器的運行及對底物的降解都依賴于系統(tǒng)微生物的組成及其功能。高通量測序技術(shù)能對污泥中微生物進行全面細致的分析，數(shù)據(jù)量龐大。該技術(shù)在環(huán)境微生物研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6-7]。在Anammox研究中也取的很好的效果[8]。本文研究了Anammox-UASB的啟動和上升流速對反應(yīng)器脫氮的影響，以期為Anammox-UASB的快速啟動與高效運行提供理論指導(dǎo)和依據(jù)；采用高通量測序技術(shù)對微生物群落結(jié)構(gòu)進行了解析，旨在為Anammox反應(yīng)器啟動過程微生物群落變化規(guī)律提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置及廢水組成

實驗裝置采用圖1所示的有效容積為6.3 L的UASB反應(yīng)器，利用溫控裝置和水泵控制反應(yīng)器溫度為33 ℃，外壁包裹黑布以防止光照對Anammox菌產(chǎn)生不利影響。

實驗用水組成：KHCO31 000 mg/L;KH2PO427mg/L;CaCl25.6 mg/L;MgSO4·7H2O 200 mg/L;(NH4)2SO4和NaNO2按需添加；微量元素Ⅰ和Ⅱ[9]各1 mL。

圖1 Anammox-UASB裝置原理圖

1.2 接種污泥與高通量測序污泥采集和保存

反應(yīng)器接種市政污水廠回流污泥，起始污泥MLSS=7 787 mg/L，MLVSS=5 244 mg/L。經(jīng)短期反硝化預(yù)培養(yǎng)后開始Anammox馴化。高通量測序污泥樣品為接種污泥(Y1)與Anammox培養(yǎng)180 d的污泥(Y2)。

1.3 分析方法

基于Illumina MiSeq測序平臺的細菌16S rDNA高通量測序分析交由生工生物工程公司進行測序。

2 結(jié)果與討論

2.1 Anammox反應(yīng)器啟動及負荷的提高

圖2 Anammox-UASB啟動過程脫氮性能

2.2 N沖擊負荷對Anammox-UASB的影響

圖3 Anammox脫氮影響研究

2.3 上升流速對Anammox脫氮的影響

圖4 上升流速對系統(tǒng)脫氮性能影響

2.4 Anammox反應(yīng)器啟動前后微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性

利用Illumina Miseq平臺對實驗接種污泥(Y1)和Anammox污泥(Y2)進行高通量測序，分析微生物種群結(jié)構(gòu)變化。

2.4.1菌群Alpha多樣性分析

表1為菌群分布的Alpha多樣性相關(guān)指標。可以看出，Anammox污泥菌群OTU數(shù)量、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)及ACE指數(shù)均表明Y1群落的Alpha多樣性Y2群落多樣性減少。作為小型生態(tài)系的活性污泥系統(tǒng)中某一功能的提高通常伴隨著系統(tǒng)整體微生物多樣性下降和某些功能菌豐度值提高[13]。反應(yīng)器接種污泥來源于城市污水廠，其處理廢水成分復(fù)雜并經(jīng)過厭氧、缺氧、好氧交替運行環(huán)境，微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜。而在長時間的厭氧自養(yǎng)培養(yǎng)過程中，好氧菌以及異養(yǎng)菌等因DO和有機物缺乏而不適應(yīng)該環(huán)境，此類微生物易衰亡或從反應(yīng)器流失，適應(yīng)Anammox培養(yǎng)環(huán)境的微生物繼續(xù)生長繁殖。

表1 污泥樣品的Alpha多樣性

2.4.2菌群結(jié)構(gòu)分析

(1)門分類水平上的分析

將Y1和Y2測序所得全部有效序列進行聚類分析得到的OUT進行分類學分析，統(tǒng)計得到污泥菌群在門水平上的群落組成。在Y1中共檢測到23個菌門，相對豐度大于1%的門占10個；Y2中共檢測到21個菌門，相對豐度大于1%的只有5個門。表2顯示了污泥樣品主要菌門及其相對豐度情況。在Y1和Y2中，變形菌門(Proteobacteria)微生物相對豐度都是最大的，分別高達50.54%和74.39%，這與大多數(shù)的anammox反應(yīng)器系統(tǒng)菌群分布相一致[8,14]。高晨晨[15]研究了9座污水廠活性污泥群落結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)Proteobacteria均主導(dǎo)菌門。其主要原因是，參與脫氮及諸多污染物質(zhì)的降解過程的微生物大都歸屬于Proteobacteria[6]。在Y2中，浮霉菌門(Planctomycetes)的相對豐度為3.92%，而Y1中該門的相對豐度為4.36%。目前發(fā)現(xiàn)的Anammox菌均為Planctomycetes微生物，但Y2中的Planctomycetes相對豐度較Y1卻有所下降，其因為為浮霉菌普遍存在于城市污水處理廠污泥系統(tǒng)中，但是該菌門中具有Anammox脫氮功能的只有6個屬[16]，在Y1中檢測到的具有Anammox功能的菌屬幾乎沒有，但Y2中檢測到大量的Candidatus_Jettenia和Candidatus_Brocadia屬(圖5)，并且隨著自養(yǎng)厭氧培養(yǎng)一些不適應(yīng)環(huán)境的腐霉菌在大量的流失消亡。厚壁菌門(Firmicutes)細菌多能產(chǎn)生芽孢，對不良環(huán)境有較好的抵抗力，對環(huán)境有較好的適應(yīng)力[16]，在Anammox啟動過程豐度大量增加。

表2 反應(yīng)器接種污泥(Y1)與Anammox污泥(Y2)菌群門水平分析

(2)屬分類水平上的分析

為了更深入的了解污泥群落結(jié)構(gòu)特征，對測序結(jié)果在屬水平做了如下分析。圖5是污泥樣品中相對豐度較高(>1%)的屬的分布情況。Y1中共檢測到446個屬，相對豐度大于1%的屬有25個；Y2中共檢測到259個屬，相對豐度大于1%的有11個屬。Y1中菌群結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜并且各種菌屬的相對豐度較為相對均衡，而Y2菌群結(jié)構(gòu)相對簡單。Y1中有關(guān)脫氮的菌屬主要有Acinetobacter(3.61%)、Denitratisoma(3.36%)、unclassifiedNitrosomonadaceae(2.03%)、Nitrosomonas(0.12%)、Nitrosococcus(1.26%)、Nitrobacter(0.11%)、Nitrospira(1.77%)、Azoarcus(0.91%)、Sulfuritalea(0.85%)，未檢測到具有Anammox功能的菌屬。Y2中相關(guān)脫氮菌屬主要有Acinetobacter(54.63%)、Nitrosomonas(4.67%)、CandidatusJettenia(2.48%)、Denitratisoma(2.43%)、unclassifiedNitrosomonadaceae(0.32%)、CandidatusBrocadia(0.84%)、Azospira(0.67%)、Nitrobacter(0.15%)、Hyphomicrobium(0.58%)，其中CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia兩個屬為典型的Anammox菌屬。Anammox污泥中不動桿菌屬呈現(xiàn)絕對優(yōu)勢，占整個菌群的54.63%，增長極為明顯；在Anammox培養(yǎng)中，系統(tǒng)中的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)也大量增長，相對豐度有接種時的0.12%增加到4.47%，接種污泥中含有未分類的亞硝化單胞菌科(unclassifiedNitrosomonadaceae)中的細菌在培養(yǎng)過程中有所減少；紅環(huán)菌科中的Denitratisoma屬是典型的反硝化菌，在接種污泥和Anammox污泥中相對豐度均較高，分別為3.36%和2.43%，反硝化菌的存在有利于維持反應(yīng)器內(nèi)部厭氧水平[17]，有利于系統(tǒng)的穩(wěn)定運行。對于Planctomycetes中的細菌，Y1中Planctomycetes的相對豐度為4.36%，但具有Anammox功能的屬只占該門的0.015%，豐度極小。而Y2中Planctomycetes的相對豐度為3.92%，其中檢測到大量的Anammox功能菌，主要以CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia兩種屬為主導(dǎo)功能菌屬，分別占總細菌的2.48%和0.84%，anammox功能菌的豐度大量增高與反應(yīng)器呈現(xiàn)很好的Anammox性狀相符合。

圖5 相對豐度較高(>1%)的屬分布情況

3 結(jié)論

以A2/O回流污泥為接種污泥經(jīng)短時間反硝化培養(yǎng)后，歷時35 d成功啟動了Anammox-UASB反應(yīng)器，氮去除速率達到122 mgN/(L·d)。

高通量測序結(jié)果表明，隨著Anammox培養(yǎng)，污泥微生物群落多樣性下降，說明系統(tǒng)厭氧氨氧化功能的增強伴隨著功能菌豐度的提高和多種不適應(yīng)環(huán)境的微生物的淘汰。

Anammox污泥中以Proteobacteria、Firmicutes、Planctomycetes為主要菌門。本系統(tǒng)Anammox功能菌為Candidatus_Jettenia(2.48%)和Candidatus_Brocadia(0.84%)兩個屬。