周駿馳， 宋梟梟， 徐 盼， 曹張軍

東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620

石油及其產(chǎn)品在開采、煉制、貯運和使用過程中進入海洋環(huán)境會造成嚴重污染；其中溢油污染危害最大，石油泄漏被稱為海洋污染的超級殺手。全世界每年因油輪事故溢入海洋的石油約為39萬噸[1]，到2016年已有超過140次大的油泄漏事件將700萬噸油泄漏造成環(huán)境污染[2]。石油烴已成為世界海洋(尤其是淺海)的主要污染物。石油污染物與常規(guī)污染物有所不同，一旦污染水域或食物鏈，進入人體后不易遭到破壞，并且仍保持它的持久性、累積性、遷移性和高毒性時，必然危及機體，表現(xiàn)出致癌性、致變性和致畸性，嚴重威脅人類健康。對溢油污染進行治理，改善、恢復污染區(qū)域的生態(tài)環(huán)境，保護海洋環(huán)境和海洋資源，促進可持續(xù)發(fā)展是世界各國義不容辭的責任[3]。

目前處理溢油的方法有物理法(吸附、機械攔截)、化學法和生物法[4，5]?；瘜W法由于使用化學試劑毒性大，造成生態(tài)環(huán)境危害，難以大范圍廣泛利用。圍欄法、撇油器法、吸油材料法、活性炭吸附過濾法的物理法主要是應對大規(guī)模、大范圍的海面石油泄漏事故，將原油吸收、捕捉后再分離、回收。但對于密度小、黏度小，在海面擴散速度快的汽煤柴等輕質油及大規(guī)模處理后殘余量油，目前工藝方法難以奏效。以油作為生長底物的微生物處理作為主要的生物處理法，可以作為轉化油污污染的生物源，而細菌修復具有安全、經(jīng)濟性強、應用范圍廣、去除效率高和無明顯的二次污染等顯著優(yōu)點[6]。因此分離篩選到適應力強，降解輕油能力高的微生物是生物處理法的關鍵。

本論文鑒定了一株從從活性污泥中分離到降解輕油微生物，并確定了其生長適合條件及降解能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品

本實驗所用活性污泥由上海市松江污水處理廠提供，油污染土壤取自工廠油污染區(qū)。

1.1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5.0，蛋白胨5.0，葡萄糖10.0，pH 7.0，121℃，滅菌20 min。

固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5.0，蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、瓊脂18.0，pH 7.0，121 ℃，滅菌20 min。

LB種子液體培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10.0，酵母粉5.0，蛋白胨10.0，pH 7.0，121 ℃，滅菌20 min。

煤油液體培養(yǎng)基(g/L)：NH4Cl 5.0、KH2PO45.0，KCl 0.1，MgSO45.0，CaCl20.02，F(xiàn)eSO40.1，NaCl 15.0，K2HPO41.0，輕油30.0，pH 7.2～7.4，115 ℃，滅菌30 min。

1.2 菌種的富集與篩選

1.2.1菌種的富集馴化[7]

配制含有濃度梯度的油污染土壤的篩選培養(yǎng)基，分別將1 g、2 g和3 g油污染土壤加入裝有100 mL篩選培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中，121 ℃，滅菌20 min。加入取自上海市松江污水處理廠的活性污泥10 mL。馴化條件為28 ℃，160 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。進行梯度富集培養(yǎng)。

1.2.2菌種的篩選[8，9]

將富集馴化完的培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋為10-2～10-6，用涂布棒涂布于固體牛肉膏蛋白胨平板上。放入恒溫培養(yǎng)箱中在28 ℃培養(yǎng)3 d，挑取顏色及形態(tài)良好的單菌落，在新鮮的固體牛肉膏蛋白胨上反復劃線分離，直至菌落形態(tài)一致，鏡檢無雜菌，將其置于4 ℃冰箱中留存待用。

1.3 細菌鑒定

1.3.1菌株的形態(tài)學觀察[10]

將菌株在LB培養(yǎng)基平板劃線于35 ℃培養(yǎng)，肉眼觀察菌落形態(tài)。并進行革蘭氏染色檢驗。

1.3.216S rRNA基因序列的基因序列擴增、比對和系統(tǒng)發(fā)育分析[11]

PCR擴增體系為50 μL:上游引物(27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)2 μL，下游引物(1522R:AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)2 μL，PCR Buffer 5 μL，Mg2+3 μL，DNA模板5 μL(細菌沸水5 min，稀釋20倍)，dNTP 1 μL，Taq酶 0.5 μL，ddH20 31.5 μL。擴增程序為:95 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測無誤后，送于生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

所得序列通過BLAST親緣關系分析，并用MEGA構建分子進化樹。

1.4 細菌生長培養(yǎng)條件研究

1.4.1初始pH對菌株生長的影響

配制100mL pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0(±0.02)的LB培養(yǎng)基于250 mL錐形瓶中，按1%接種量接種活化12 h的菌液，35 ℃、160 r/min下振蕩培養(yǎng)，定期取適量菌液測定其OD600。

1.4.2溫度對菌株生長的影響

配制100 mL pH為7.0的LB培養(yǎng)基于250 mL錐形瓶中，按1%接種量接種活化12 h的菌液，分別在23 ℃、26 ℃、29 ℃、32 ℃、35 ℃和38 ℃，160r/min振蕩培養(yǎng)，定期取適量菌液測定其OD600。

1.5 細菌降油能力測試[12]

挑取生長形態(tài)良好的單菌落，接入5 mL LB液體種子培養(yǎng)基中，35 ℃，160 r/min，置于恒溫搖床中培養(yǎng)12 h。接種1 mL種子液于100 mL煤油培養(yǎng)基中，35℃，160 r/min，置于恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)5 d和7 d。培養(yǎng)完成后，利用30 mL二氯甲烷進行萃取，計算菌種降油能力。按照下列公式計算菌對煤油降解率:

降解率(%)=(原始煤油質量-培養(yǎng)后剩余煤油質量)/原始煤油質量×100%。

2 結果與討論

2.1 菌株篩選結果及形態(tài)學鑒定

將馴化的菌液稀釋涂布進行初篩獲得長勢良好的單菌落。再經(jīng)回接、純化和形態(tài)觀察進行復篩，得到生長狀態(tài)優(yōu)良的單菌落。挑選其中生長速度最快且長勢最佳的菌株作為試驗菌，命名為5092-2。5092-2菌種菌落呈白色，圓形，突起，濕潤，有光澤，全緣；菌體革蘭氏染色呈陰性，桿狀，長度5.0 μm～10.0 μm。

2.2 菌種的分子學鑒定

PCR擴增5092-2菌株16S rRNA基因，得到預期1.5 kb左右大小條帶。擴增樣品經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行blast比對，結果顯示5092-2菌株為Mangroveibactersp.。利用MEGA6.0構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

2.3 5092-2菌株生長條件測定

菌株5092-2在起始pH為5.0至9.0生長情況如圖2所示。從圖中可以看出，菌株5092-2在pH 5.0～9.0區(qū)間內，生長無明顯差異，具有較強pH適應性。

菌株5092-2在培養(yǎng)溫度23 ℃到38 ℃生長情況如圖3所示。從圖中可以看出，溫度對菌株5092-2生長影響不大，特別在26 ℃至35 ℃溫度區(qū)間內，生長無明顯差異。

2.4 細菌降油能力測試

將煤油和菌混和培養(yǎng)，培養(yǎng)規(guī)定時間后，萃取培養(yǎng)基中殘存煤油，計算煤油殘存率。結果顯示，5092-2降解時間為5 d時，煤油剩余質量為2.05 g，菌種煤油降解率為31.7%，降解時間為7 d時，煤油剩余質量為1.43 g，菌種煤油降解率為52.3%。

圖1 菌株5092-2 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 起始pH對5092-2生長影響

圖3 溫度對5092-2生長影響

3 結論

經(jīng)過初篩與復篩得到一株長勢最佳的菌株(命名為5092-2)進行形態(tài)觀察及分子鑒定，判定菌株5092-2為Mangroveibactersp.。在溫度為35 ℃，pH為7.2～7.4，恒溫搖床轉速為160 r/min，7 d降解煤油能力到達52.3%，李平等[12]以石化廠附近長期被石油污染的土壤微生物為菌源，煤油作為唯一碳源，在最佳培養(yǎng)條件下，煤油降解率達到42.6%。KHAN等[13]從受石油烴污染的土壤中分離出SDX7，3%煤油濃度，在最佳培養(yǎng)條件下，16 d培養(yǎng)后降解58%。AYDIN等[14]分理出taphylococcusaureusBa01，DelftiaacidovoransCd11等菌株，以1%煤油作為唯一碳源，在最佳培養(yǎng)條件下，21 d培養(yǎng)后降解70%～84%。本論文菌株降解煤油能力明顯，為進一步研究奠定了基礎。