李海健， 周化嵐， Sarman Oktovianus Gultom, 張建國*

1.上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院 食品科學與工程研究所，上海 20093;2.Department of Agricultural and Biosystems Engineering, Papua University, Manokwari, Papua Barat, Indonesia

微藻具有能以光自養(yǎng)模式利用光和二氧化碳生長積累油脂，也能以異養(yǎng)模式利用其它碳源生長的優(yōu)點而被廣泛用于生物能源，生產(chǎn)高附加值物質(zhì)，以及廢水處理等多個領域[1]。微藻在生物能源方面的研究主要集中在以下幾個方面：(1)獲得富油藻種，例如富油藻種的篩選[2, 3]，以及基因工程改造微藻達到富油性能[4]；(2)微藻積累油脂的過程工程研究，例如培養(yǎng)基中營養(yǎng)元素的優(yōu)化[5]、溫度及光照強度等環(huán)境因素的優(yōu)化；(3)建立簡單、易行的油脂測定和提取方法，例如利用核磁共振的方法測定油脂含量[6]。近年來，利用微藻生產(chǎn)高附加值物質(zhì)的研究也日益增多[7]。微藻積累的多不飽和脂肪酸可以作為食用營養(yǎng)品，還可以作為細胞工廠生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體、抗生素、蛋白藥物、激素、腸道活性蛋白和工業(yè)用酶等[8]。小球藻自身能合成的氨基酸、多肽、維生素和核酸等已經(jīng)被制作為小球藻生長因子(chlorella growth factor),在增強免疫、抑制腫瘤、改善代謝綜合征、清除自由基、抵御紫外損傷、螯合重金屬以及保肝護腸等多個方面展現(xiàn)了良好功效[9, 10]。微藻用于廢水處理也是一種非常有前景的綠色技術(shù)。微藻吸收營養(yǎng)能力強，可以高效利用廢水中有機質(zhì)、氮和磷等污染物合成生物質(zhì)，并達到處理廢水的目的。微藻在處理農(nóng)業(yè)廢水、工業(yè)廢水、城市廢水和含農(nóng)藥以及抗生素等有害廢水方面都有報道。很多學者對藻類處理廢水的原理、技術(shù)路線、藻種篩選、環(huán)境條件等方面都有研究，為生態(tài)建設提供了新思路[11]。

為了獲得微藻中的油脂、高附加值物質(zhì)，微藻收獲是必不可少的步驟。但是由于微藻在培養(yǎng)體系中濃度較低(約0.3 g/L～5 g/L)和體型較小(Φ2 μm～40 μm)，導致微藻收獲步驟的成本占總成本高達20%～30%，因此，微藻的大規(guī)模應用相對較少[12]。微藻收獲成為其工業(yè)化的熱點問題。本文從文獻計量的角度闡明微藻收獲的研究趨勢，同時，也展示了我國在微藻收獲的研究方面所處的位置，最后分析了研究動向，為微藻收獲和相關研究提供參考。

1 文獻數(shù)據(jù)來源

本文以web of science數(shù)據(jù)庫為數(shù)據(jù)來源，以 microalgae harvest為主題詞搜索相關文獻，時間截止至2019年7月31日，檢索結(jié)果共2 471篇文獻，經(jīng)手工剔除，得到關于微藻收獲相關文獻共742篇。

國內(nèi)文獻研究以萬方中文數(shù)據(jù)庫為數(shù)據(jù)來源，以“微藻收獲”為關鍵詞搜索，加上手動獲取和篩選，共得到文獻334篇。

2 文獻檢索結(jié)果與分析

2.1 微藻收獲研究的趨勢

Web of science數(shù)據(jù)庫中最早收錄的有關微藻收獲的研究為2001年Oh報道的使用類芽孢菌屬的生物絮凝劑收獲小球藻。自2009年起，有關微藻收獲的文獻數(shù)量逐年增加，成為研究熱點(圖1)，尤其在2018年已達到139篇。截止2019年7月31日，2019年出版的文獻數(shù)量為103篇。這說明微藻收獲的研究逐漸增多，依然是研究熱點。

圖1 微藻收獲的文獻隨時間的變化趨勢

2.2 文獻種類分析

從文獻類型的組成來看(圖2)，數(shù)量最多的文獻為研究論文，占65.9%。然后依次是專利(19.7%)、評論(6.2%)、會議論文(5.3%)和摘要(1.8%)，其他文獻占1.1%。圖2表明專利為數(shù)量第二多的文獻，說明研究人員認為微藻收獲的研究具有很大應用潛力，需要進行專利保護。

圖2 微藻收獲文獻的類型

2.3 文獻量前10的國家及其文獻引用

微藻收獲的文獻共來自56個國家和地區(qū)。發(fā)表文獻總數(shù)前10的國家見圖3。

圖3 微藻收獲文獻數(shù)量的前10國家

前10國家的文獻數(shù)為528篇，占文獻總數(shù)的71.2%。排名前10的國家和地區(qū)依次為中國、美國、韓國、馬來西亞、印度、西班牙、比利時、英國、澳大利亞和加拿大。其中，我國發(fā)表文獻 184 篇，占總文獻量的24.8 %。圖4為前10國家的文獻平均引用次數(shù)。比利時的每篇文獻平均引用次數(shù)最多，為42.6次/篇，其次為英國(27.7次/篇)、美國(27.2次/篇)、澳大利亞(23.4次/篇)。我國每篇文獻的平均引用次數(shù)為19.4次/篇。這說明我國有關微藻收獲的文獻雖多，但其影響力還有待進一步提高。

圖4 文獻總數(shù)前10國家的每篇文獻引用次數(shù)

2.4 文獻數(shù)量前5國家在近10年內(nèi)的文獻數(shù)量變化

對文獻總數(shù)前5名國家的文獻數(shù)量進行分析，可以看出我國文獻的增長趨勢較為明顯(圖5)。我國的文獻數(shù)從 2010一直增長到 2016年，2017年文獻數(shù)稍有降低后，2018年又呈上升趨勢，達42篇，是美國發(fā)表文獻最多年份文獻數(shù)量(2018年13篇)的 3.2倍。來自美國的文獻數(shù)量出現(xiàn)小幅度波動，總體維持在10篇/年左右。印度的文獻數(shù)量在2010年—2015年之間較為平穩(wěn)，2016年后，呈持續(xù)上升趨勢。2014年以來，我國的文獻數(shù)量始終高于其他國家的文獻量，而且優(yōu)勢明顯，說明我國已經(jīng)成為研究微藻收獲的活躍地區(qū)。

圖5 發(fā)表文獻數(shù)量前 5 的國家的文獻數(shù)隨時間的變化

2.5 研究方向

對web of science數(shù)據(jù)庫收錄的微藻收獲文獻研究方向進行分析，可以發(fā)現(xiàn)在生物技術(shù)和應用微生物(Biotechnology and Applied Microbiology)方向的研究最多，占62.4%。這說明從微生物方向入手對微藻收獲進行研究最多，其次依次為能源燃料(30.5%)、化學(27.5%)和農(nóng)業(yè)(23.9%)等。

2.6 基于萬方數(shù)據(jù)庫的國內(nèi)文獻數(shù)量變化

在萬方知識數(shù)據(jù)服務平臺中以微藻收獲為關鍵詞搜索，共得文獻334篇，文獻數(shù)量逐年增加(圖7)，其中2014年—2016年達到了研究的頂峰期，期間內(nèi)每年約48篇，2017年至今國內(nèi)發(fā)表文獻數(shù)逐年減少，而且中文期刊論文比專利和學位論文數(shù)量少，而國際上我國對微藻收獲技術(shù)的研究呈逐年上升趨勢(圖5)。其中部分原因可能為我國學者注重將研究結(jié)果優(yōu)先發(fā)表在web of knowledge索引的國際期刊上。中文文獻中52%為專利(圖8)。這說明我國學者對微藻收獲技術(shù)優(yōu)先進行專利保護。其次是學位論文、期刊論文、會議論文、科技報告、成果。

圖6 微藻收獲文獻的主要研究方及其占比

圖7 近10年國內(nèi)發(fā)表文獻數(shù)隨時間的變化

圖8 國內(nèi)發(fā)表文獻類型占比

3 展望

文獻計量分析表明微藻收獲正在處于研究熱點，也說明微藻收獲對社會可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。下面對有關微藻收獲相關研究進行展望，以企為將來的相關研究提供參考。

3.1 微藻對可持續(xù)發(fā)展的重要作用

我國在過去20年里經(jīng)歷了高速發(fā)展時期，2010年成為世界第1大能源消費國。我國能源消費在全球的比重由1990年的4%，上升到2006年的10%，2019年將達到18%[13]。當前，我國大部分能源來自煤炭(66.2%)、石油(18.8%)、天然氣(5.4%)等非再生原料，共占總能源約90%[14]。自1990年我國變成原油凈進口國以來，2015年我國石油進口量達到54 300萬噸，占全國石油消費量的60.6%[15]。所以開發(fā)可持續(xù)能源是我國進一步發(fā)展的必由之路。我國規(guī)劃在2020年生產(chǎn)230萬噸生物柴油。但是，我國2015生產(chǎn)約114萬噸生物柴油[16]，所以，繼續(xù)提高生物柴油產(chǎn)量的需求很緊迫。石油能源對環(huán)境的影響也十分巨大。2015年全球石油能源的二氧化碳排放量占全部二氧化碳排放量的34%。根據(jù)國際能源機構(gòu)(International Energy Agency)的報告，我國2015年的二氧化碳排放量占全球二氧化碳總排放量的28%，約9×109噸。微藻的自養(yǎng)模式不僅可以提供可持續(xù)能源，還可以降低二氧化碳排放量。采用生物能源，每生成1 kg微藻能吸收2 kg二氧化碳[17]。預計在2050年我國能減少3.7×108噸二氧化碳[15]。XIN等在2016年計算微藻生物柴油的成本約為2.23美元/加侖[18]，2018年時重新評估后價格變?yōu)?.85美元/加侖[19]。開發(fā)進一步降低成本的新微藻收獲技術(shù)對我國經(jīng)濟建設，以及世界可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

3.2 微藻收獲技術(shù)的發(fā)展

目前微藻收獲方法包括離心、過濾、浮選、沉降和化學絮凝等。離心法雖然可以快速收集微藻細胞，但需要投入設備和大量的能量[20]。過濾法易出現(xiàn)膜堵塞，需要不斷清洗[21]。自然沉降法的速度緩慢。浮選法耗能較大[22]。化學絮凝法的絮凝劑和微藻細胞粘附成的無定型細胞團仍然需要過濾、離心、或者沉降等步驟進一步分離。而且大量使用氯化鐵、硫酸鐵、硫酸鋁、聚丙烯酰胺等化學絮凝劑會對環(huán)境產(chǎn)生污染[23]。美國能源部報道的脫水和干燥相結(jié)合的微藻收獲方式需要動力傳輸和電加熱，成本較高[24]。ZHANG和SARMAN 報道的利用絲狀真菌和微藻共培養(yǎng)形成菌絲球的方式可以收獲100%微藻，而且不需要添加任何化學物質(zhì)，不需要大型設備[25, 26]。絲狀真菌和微藻共培養(yǎng)迅速成為研究熱點[27]。而且，絲狀真菌和微藻共同培養(yǎng)形成菌絲球降低培養(yǎng)液的粘度，提高培養(yǎng)液的透明度，有利于光線的射入，對微藻生物量和代謝物產(chǎn)量有協(xié)同作用。許多絲狀真菌，例如黑曲霉、煙曲霉、紅綬曲霉、Aspergilluslentulus、Isariafumosorosea都可以與微藻(普通小球藻、布朗葡萄藻、Auxenochlorellaprotothecoides、Nannochloropsissp.)共培養(yǎng)形成菌絲球[23]。這種共成球技術(shù)不僅可以達到收獲微藻的目的，而且可以應用到廢水處理、高附加值代謝物生產(chǎn)等方面，例如去除廢水COD、總氮和總磷，吸附重金屬[28]，降解有害化合物[29]，及積累脂肪酸(C16-C18>83%)等[30]。絲狀真菌和微藻的共同培養(yǎng)形成菌絲球是一個含有固體、液體和氣體的異質(zhì)化培養(yǎng)體系。其影響因素包含菌種類型、種子形式、種子濃度、生長速率、培養(yǎng)基成分、顆粒、反應器類型及培養(yǎng)策略等。絲狀真菌和微藻在不同應用場景下形成菌絲球所需要的條件也不一樣。XIA前期利用調(diào)控pH的方式將卷枝毛霉形成菌絲球[31]。菌絲形態(tài)對絲狀真菌的代謝有很大影響[32]。例如聚半乳糖醛酸酶[33]、木質(zhì)素過氧化酶、葡萄糖糖化酶和呋喃果糖苷酶[34]等在菌絲球形態(tài)下產(chǎn)量較高。這些酶將微藻細胞壁水解產(chǎn)生的碳水化合物，用作絲狀真菌生長的碳源，生長為菌絲球，達到收獲微藻的效果。所以，絲狀真菌和微藻共同形成菌絲球技術(shù)是值得大力推廣的微藻收獲思路。

3.3 共成球方法收獲微藻的基礎研究

共成球方法收獲微藻主要綜合靜電相互作用、疏水相互作用和細胞壁組分的鹽橋作用三種作用力[25-26, 35]。由于絲狀真菌和微藻細胞均呈負電荷，具有靜電相互作用。絲狀真菌壁的羧基是負電荷的主要來源。孢子壁中黑色素富含羧基。分別敲除黑曲霉和煙曲霉合成黑色素的一個基因后，黑曲霉[36]和煙曲霉[37]孢子負電荷均明顯減少。而且，黑曲霉和白地霉孢子壁被聚丙烯酸羧化后表現(xiàn)出同樣的電荷量[38]。利用乙酸十二烷胍的氨基與菌孢子壁的羧基發(fā)生反應，可使孢子的負電荷變?yōu)榱?，甚至變?yōu)檎姾伞２煌N類細胞所帶的電荷不同，而且受到pH、離子強度、離子化合價和陽離子濃度等因素影響。高pH時孢子呈現(xiàn)負電荷多，細胞之間的靜電相互作用抑制聚集。例如，高pH時孢子不能與帶有負電荷的云母片粘附[39]。減少孢子負電荷量，降低了靜電相互作用，有利于孢子聚集。例如，孢子在等電點條件下利于孢子聚集。而且溶液中反離子(counter-ion)中和負電荷，也有利于孢子聚集[40]。絲狀真菌和微藻的靜電相互作用可以借助膠體化學的DLVO(Derjaguin, Landau, Verwey, Overbeek)理論表征[41]。

疏水相互作用是細胞之間相互粘附的一個重要因素[42]。細胞的疏水相互作用來自一種含有100～150個氨基酸，具有兩親性的疏水蛋白。孢子和氣生菌絲上都含有疏水蛋白。疏水蛋白在孢子表面形成厚度為5 nm～10 nm的涂層。氣生菌絲由于表面疏水蛋白涂層而可以延伸到空氣中[43]。細胞之間疏水相互作用較大時，吉布斯自由能低，有利于細胞聚集。敲除疏水蛋白基因?qū)е骆咦邮杷越档蚚44]。孢子的疏水相互作用也受到pH和離子強度的影響。pH由2.5升到5.0，導致疏水相互作用下降36.4%[45]。離子強度由0.5 mol/L NaCl降到0.05 mol/L NaCl，導致疏水相互作用下降25%。

鹽橋作用主要來自細胞壁的幾丁質(zhì)、葡聚糖、疏水蛋白、黑色素和脂肪類組分[46]。細胞壁成分的不同導致鹽橋作用的差異。絲狀真菌孢子壁和菌絲壁的碳水化合物含量分別為2.5%和64.5%，而孢子壁和菌絲壁的蛋白質(zhì)含量分別為63.4%和6.6%。胞外多糖在菌絲體和微藻細胞的聚集中起重要作用[47]。絲狀真菌孢子萌發(fā)時，疏水蛋白和黑色素褪去，露出多糖結(jié)構(gòu)[48]，細胞可以附著在α-1,3葡聚糖鏈上[49]。因此，α-1,3葡聚糖對細胞和菌絲體的聚集有重要影響[50]。

上述三種作用力都受到細胞壁組分的影響。目前培養(yǎng)條件、細胞的生理狀態(tài)、細胞壁組分、細胞之間的作用力之間的關系還沒有統(tǒng)一起來。所以，對絲狀真菌和微藻共同培養(yǎng)收獲微藻的機制還需要進一步明確，指導收獲微藻的研究。