■白天天 普宣宣 蔣辰宇 王 彥 郭雪峰，2* 席琳喬，2

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

養(yǎng)殖畜牧業(yè)為了促進(jìn)動物生長發(fā)育，提高胴體重，減少發(fā)病率，獲得收益，大量抗生素投入生產(chǎn)中。據(jù)悉每年用在動物預(yù)防與治療的藥品可達(dá)上萬元，用于促進(jìn)動物生長發(fā)育的藥品也不容小覷[1]。養(yǎng)殖畜牧業(yè)對抗生素使用，致使抗生素沉積，產(chǎn)生耐藥性和人畜共患病。長此以往，將會出現(xiàn)無法醫(yī)治的情況[2]。人們從動植物資源中分離出乳酸菌制劑等天然抗菌劑可代替抗生素添加至飼料中，不但具有較強(qiáng)的抑菌作用，促進(jìn)動物消化吸收[3]，而且無副作用。且乳酸菌為人畜體內(nèi)常見的益生菌，具有改善胃腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)動物消化吸收，提高免疫力等的功能[4]，由于其較為明顯的抑菌效果[5-9]，乳酸菌可添加進(jìn)食品中，用于食品發(fā)酵如酸奶，起到改善食品風(fēng)味延長保質(zhì)期和貨架期的作用[10-11]，乳酸菌在腸道內(nèi)屬優(yōu)勢菌群, 可以屏蔽一些有害菌種的侵襲，抑制致病菌和腐敗菌的生長繁殖，保障腸道內(nèi)微生態(tài)平衡[12]。乳酸菌產(chǎn)生乳酸從而起到抑菌的作用[13]。本試驗(yàn)旨在從青貯中分離出來的乳酸菌對飼料中常見致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉菌的抑制效果進(jìn)行比較，為篩選優(yōu)良的乳酸菌添加劑提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來源

本研究所用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉菌為塔里木大學(xué)新疆建設(shè)兵團(tuán)畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室冷凍保存的菌種，在4 ℃條件下，在斜面半固體肉湯培養(yǎng)基中接種保存的菌種進(jìn)行活化，將菌種在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h備用。

本研究所用乳酸菌W和B、L及SW分別從新疆本地梨子青貯、蘋果青貯、無花果葉青貯中分離得到。于4 ℃條件下，由塔里木大學(xué)畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

乳酸菌培養(yǎng)使用添加2 g/l碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基，指示菌的篩選及培養(yǎng)使用肉湯培養(yǎng)基。肉湯培養(yǎng)基測定pH 值為7.4～7.6 后需要過濾，使用0.3 mol/l氫氧化鈉滴定。

1.1.3 試劑與儀器

主要試劑：細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒（天根深化科技有限公司）、瓊脂糖、50%TBE溶液。

主要儀器：pH計(jì)（PHSJ-5，上海儀電科學(xué)儀器有限公司），霉菌培養(yǎng)箱（MJX-160，寧波江南儀器廠），超凈工作臺（SW-J-2FD，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），高壓滅菌鍋（SX-500，上海法潤科學(xué)儀器有限公司），電子天平（XP603S，瑞士梅特勒-托利多中國公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP9162，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），超低溫冰箱（DW-86L286，海爾集團(tuán)公司），全溫型恒溫培養(yǎng)搖床（TY-R70，天津市泰斯特儀器有限公司），優(yōu)普系列超純水器（UP-11-10T，四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌菌液的制備

何寶宏，畢業(yè)于中國科學(xué)院計(jì)算技術(shù)研究所，獲計(jì)算機(jī)博士學(xué)位，目前擔(dān)任中國信息通信研究院云計(jì)算與大數(shù)據(jù)研究所所長；從事互聯(lián)網(wǎng)研究20余年，現(xiàn)主要研究方向?yàn)榛ヂ?lián)網(wǎng)技術(shù)哲學(xué)；出版《互聯(lián)網(wǎng)的基因》等書。

將實(shí)驗(yàn)室篩選保存的乳酸菌菌種W、L、B、SW劃線于MRS斜面培養(yǎng)基中在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中無氧培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中后在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，渦旋振蕩1 200 r/min，備用。

1.2.2 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉菌菌液的制備

將實(shí)驗(yàn)室接種在半固體肉湯斜面培養(yǎng)基表面保存?zhèn)溆玫拇竽c桿菌、金黃色葡萄球菌取出，在超凈工作臺中用接種環(huán)刮取部分在20 ml液體肉湯培養(yǎng)基中30 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h 至大量菌株產(chǎn)生，備用。

將實(shí)驗(yàn)室接種在半固體肉湯斜面培養(yǎng)基表面保存?zhèn)溆玫狞S曲霉菌取出，在超凈工作臺中用接種環(huán)刮取部分在20 ml 液體肉湯培養(yǎng)基中28 ℃霉菌培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24～36 h至大量菌株產(chǎn)生，備用。

1.2.3 四種乳酸菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉菌的抑菌效果比較

采用雙層平板法比較W、L、B、SW對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉菌的抑制效果。首先將MRS固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中作為下層平板，均勻鋪平，凝固后沾取活化備用的乳酸菌菌液在MRS平板上劃2條2～3 m的平行直線，于37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中無氧培養(yǎng)24～36 h至長出菌苔。后將1 ml活化備用的致病菌菌液與半固體肉湯培養(yǎng)基混合均勻后取5 ml移入培養(yǎng)皿中，均勻覆蓋在含有乳酸菌菌苔的培養(yǎng)基上，在28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，檢測乳酸菌生長條帶周圍是否出現(xiàn)抑菌圈。同時(shí)，本試驗(yàn)依據(jù)單菌株抑菌效果將抑菌效果一般的W和L組合，效果較好與效果較差的B和SW組合，同時(shí)將SW作為對照進(jìn)行組合抑菌，檢測組合后的抑菌效果并與效果最好的單菌株進(jìn)行對比。將W和L，B和SW在MRS平板上分別劃一條2～3 m的平行直線后接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，從而比較W、L、B和SW對指示菌的抑菌效果。

1.2.4 提取細(xì)菌DNA及序列分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌液對指示菌的抑菌效果比較

表1 單菌液對指示菌的抑菌直徑比較(mm)

由表1 可知，抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黃曲霉菌效果最好的菌株為SW，抑菌直徑分別為（47.89±0.10）、（40.24±0.11）、（42.54±0.12）mm；其次L對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，抑菌直徑分別為（35.48±0.05）、(35.95±0.16) mm；W對黃曲霉菌的抑菌效果較好，抑菌直徑為(39.90±0.03) mm。說明本研究中乳酸菌均對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黃曲霉菌有抑菌作用，SW 抑菌效果最好。表1 可見SW 的抑菌效果最好，故以SW 對指示菌的抑菌大小為例，即圖1。

圖1 SW菌株對部分指示菌抑菌直徑的大小

2.2 組合菌液對指示菌的抑菌效果比較

表2 組合菌液對指示菌的抑菌直徑比較（mm）

由表2 可知，在組合菌株中，抑制大腸桿菌效果最好的菌株為W+L，抑菌直徑為(40.06±0.13) mm。對金黃色葡萄球菌和黃曲霉菌抑菌效果最顯著的是B+SW，抑菌直徑分別為(35.50±0.12) mm 和(34.00±0.15) mm；SW對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黃曲霉菌的抑菌直徑分別為(47.89±0.10)、(40.24±0.11)、(42.54±0.12) mm。說明本研究中乳酸菌組合均對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黃曲霉菌有抑菌作用。但SW 對致病菌的抑菌效果比W+L 和B+SW 的組合抑菌效果好。從表2 可見，組合菌株中，W+L 對大腸桿菌的抑菌效果最好，B+SW 對金黃色葡萄球菌和黃曲霉菌的抑菌效果最好，故以W+L 對大腸桿菌、B+SW 對金黃色葡萄球菌和黃曲霉菌的抑菌效果為例，見圖2。

圖2 乳酸菌組合菌液對部分指示菌抑菌直徑的大小

2.3 乳酸菌基因組DNA凝膠電泳

4 株菌的基因組DNA OD260nm/OD280nm基本位于1.8～2.0 的范圍內(nèi)，由圖3 可知，各菌株基因組DNA 凝膠電泳在目標(biāo)位置處均有亮帶，證明該DNA 提取方法具有可行性。

2.4 16S rDNA序列分析鑒定結(jié)果

通過抑菌實(shí)驗(yàn)篩選出W、L、B、SW 共4 株對指示菌具有抑菌作用的菌株；采用有抑菌活性的乳酸菌菌株的16S rDNA 的PCR 產(chǎn)物測序，通過同源性分析的方法，確定了菌株的分類(見圖4)；結(jié)果表明，菌株W與蒙氏腸球菌的相似性為99%，菌株L與鶉雞腸球菌的相似性為99%，菌株B與溶血性葡萄球菌的相似性為99%，菌株SW 與屎腸球菌的相似性均為99%。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹最后確定菌株W為蒙氏腸球菌（Enterococcusmundtii），L為鶉雞腸球菌(Enterococcusgallinarum)，B 為溶血性葡萄球菌(Staphylococcushominis)，SW為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)。

圖3 乳酸菌DNA提取產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

近年來，我國對乳酸菌抑菌作用的研究越來越多，帕提古麗·毛拉紅等[14]發(fā)現(xiàn)乳酸菌對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和黃曲霉菌具有抑制作用；有人從動物體內(nèi)分離出對大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、一些腐敗菌假單胞菌和希瓦氏菌都有很好的抑制效果的乳酸菌[15-16]；王志新等[17]從東北酸菜中篩選到發(fā)現(xiàn)一株對常見的食源性致病菌和腐敗菌具有較強(qiáng)抑菌作用的植物乳桿菌；Li等[18]從多種泡菜中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)苯乳酸的植物乳桿菌；韓立英等[19]發(fā)現(xiàn)在青貯中添加乳酸菌對腐敗菌具有抑制作用。國外對乳酸菌的研究也很多，美國、日本及歐洲等國已經(jīng)對青貯用乳酸菌進(jìn)行了大量的研究并取得了一定的成果[20]。日本人在很早的時(shí)候?qū)θ樗峋M(jìn)行應(yīng)用，日本農(nóng)林水產(chǎn)省草地實(shí)驗(yàn)場調(diào)制貯藏研究室的蔡義民等[21]研究認(rèn)為乳酸菌對玉米秸稈青貯飼料的發(fā)酵中產(chǎn)生的致病菌腐敗菌具有抑菌作用；2009年Valerio等[22]從小麥生態(tài)系統(tǒng)中分離得到一株乳酸菌并發(fā)現(xiàn)其具有抗真菌活性的作用。國內(nèi)外的科學(xué)家們密切關(guān)注著乳酸菌的生理優(yōu)勢，并進(jìn)行深入研究，為乳酸菌是否具有抑菌作用提供了理論支撐，為成功篩選具有抑菌活性的乳酸菌提供參考價(jià)值。

圖4 四株乳酸菌基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹

人們對屎腸球菌抑菌作用的研究較多[23-26]，屎腸球菌對金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等多種致病菌有較好的抑菌活性。王曉蕊[27]從健康仔豬體內(nèi)分離出1 株能抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的屎腸球菌，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在本試驗(yàn)中除無花果葉青貯中分離出的屎腸球菌對三種指示菌抑菌作用最好外，蘋果青貯中分離出的鶉雞腸球菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，梨子青貯中分離出的蒙氏腸球菌的對黃曲霉菌的抑菌效果較好，組合后發(fā)現(xiàn)大腸桿菌抑菌效果最好。李莉媛[28]發(fā)現(xiàn)鶉雞腸球菌和屎腸球菌均對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，但現(xiàn)在暫無鶉雞腸球菌對黃曲霉菌抑菌作用的研究。有研究發(fā)現(xiàn)蒙氏腸球菌對單核細(xì)胞增生李斯特菌具有抑菌作用[29]。劉晗璐[30]從披堿草和老芒麥鮮牧草中分離出蒙氏腸球菌，與植物乳桿菌組合添加至青貯中，能有效抑制霉菌生長。在本試驗(yàn)中蒙氏腸球菌和鶉雞腸球菌分別對黃曲霉菌和大腸桿菌抑制效果較好，組合后對大腸桿菌抑菌效果最好。而溶血性葡萄球菌的抑菌研究較少，多為耐藥、耐抗生素機(jī)理[31]，在本研究中發(fā)現(xiàn)溶血性葡萄球菌對指示菌的抑菌作用一般，無花果葉青貯中分離出來的屎腸球菌對三種指示菌抑菌效果都較好，組合后對指示菌抑菌作用比屎腸球菌單菌液的抑菌效果差。乳酸菌菌種組合后出現(xiàn)對某些致病菌的抑制效果加強(qiáng)或減弱，可能是因?yàn)榫N之間出現(xiàn)了協(xié)同和相互抑制作用，導(dǎo)致抑菌機(jī)制發(fā)生改變，出現(xiàn)這種結(jié)果的具體原因還有待研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，W、L、B 和SW 均對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉菌具有抑菌作用，通過16S rDNA序列分析鑒定，得到了四種乳酸菌，分別為蒙氏腸球菌（Enterococcusmundtii），鶉雞腸球菌(Enterococcusgallinarum)，溶血性葡萄球菌(Staphylococcus hominis)和屎腸球菌(Enterococcusfaecium)。在單菌株中，從無花果葉青貯中分離得到的屎腸球菌對三種指示菌的抑菌效果最好，將4種乳酸菌組合后發(fā)現(xiàn)對大腸桿菌抑菌效果最顯著的是為蒙氏腸球菌和鶉雞腸球菌，對金黃色葡萄球菌和黃曲霉菌抑菌效果較好的是溶血性葡萄球菌和屎腸球菌組合，屎腸球菌單菌株的抑菌效果優(yōu)于組合菌液的抑菌效果。