蒲新露

梅毒（syphilis）是由梅毒螺旋體（Treponema pallidum）引起的一種慢性傳染性疾病，主要通過(guò)性接觸及血液傳播[1,2]。近年來(lái)，發(fā)病率有上升趨勢(shì)。梅毒早期以侵犯皮膚黏膜損害為主，晚期常伴有心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼及眼等器官的器質(zhì)性損害[3]。有學(xué)者認(rèn)為梅毒血清學(xué)固定的發(fā)生與患者免疫功能異常相關(guān)[4,5]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道Th1 型細(xì)胞因子在清除梅毒螺旋體的免疫應(yīng)答中起重要作用，而Th2 型細(xì)胞因子則在血清不轉(zhuǎn)陰的患者中占優(yōu)勢(shì)[6]，其中分別以白細(xì)胞介素(IL)-27 及IL-33 為主。本研究將探討IL-27、IL-33 分別作為Th1、Th2 細(xì)胞的活化因子在梅毒患者清除體內(nèi)梅毒螺旋體的免疫應(yīng)答中所發(fā)揮的作用。探究早期梅毒患者在治療前是否已存在IL-27、IFN-γ 及IL-33 水平的差異及此差異是否影響其預(yù)后，為評(píng)估病情發(fā)展及進(jìn)一步研究和有效治療梅毒患者提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取2015 年1 月―2015 年12 月至上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院就診的早期梅毒患者70 例，經(jīng)正規(guī)芐星青霉素G 驅(qū)梅治療6 個(gè)月后，根據(jù)治療效果將其分為梅毒血清轉(zhuǎn)陰組、梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組，最終每組入選25 例，同時(shí)收集25 例正常健康人血清及全血標(biāo)本作為對(duì)照組。分別抽取正常健康人、早期梅毒患者治療前后的血清及全血樣本用于本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組25 例（男13 例，女12 例），年齡 20 ～55 歲，平均年齡（35.6±5.7）歲；梅毒血清轉(zhuǎn)陰組25 例（男11例，女14 例），年齡18 ～57 歲，平均年齡（34.3±6.2）歲；梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組25 例（男12 例，女13 例），年齡21 ～60 歲，平均年齡（35.8 ±5.6）歲。本研究已通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，獲得患者的知情同意。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 所有入選的梅毒患者診斷均符合中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病控制中心頒布的《性傳播疾病臨床診療與防治指南》，①年齡18 ～60 歲；②一期與二期梅毒或早期潛伏期梅毒；③血清快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）滴度為1:4～1:32的患者。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①年齡＜8 歲或＞60 歲；②既往感染過(guò)梅毒；③并發(fā)嚴(yán)重的心、肺、肝、腎等器質(zhì)性疾病；④非自愿或拒絕參與此項(xiàng)臨床研究者。

1.1.4 試劑與儀器 IL-27，IL-33，IFN-γ 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（上海廣瑞生物科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司），熒光定量PCR 試劑盒（2*SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix）（美國(guó)Fermentas 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及ELISA 檢測(cè) 對(duì)入選的各組受試者在治療前、治療后分別采取外周血5 ml，放置于無(wú)菌離心管中以 3 000 r/min 離心5 min，吸取部分血清行RPR、梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）檢測(cè)。早期梅毒患者血清RPR 滴度為1:4 ～1:32，剩余血清樣本分裝（標(biāo)注姓名、性別、采集日期）后放置于-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。采用雙抗體夾心ELISA 法，嚴(yán)格按照所購(gòu)試劑盒說(shuō)明書對(duì)IL-27，IL-33，IFN-γ水平進(jìn)行檢測(cè)，在450 nm 波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)各孔吸光度（A值），所有A值減去空白對(duì)照值后進(jìn)行計(jì)算。以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品A值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查出相應(yīng)IL-27、IL-33、IFN-γ 含量。

1.2.2 熒光定量RT-PCR 檢測(cè)血清中IL-27、IL-33 及IFN-γ 水平 對(duì)入選的各組受試者在治療前、治療后分別抽取5 ml 外周血，PBS 稀釋后加入淋巴細(xì)胞分離液，Trizol 提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。引物序列：IL-27/P28 正向引物5'-GAGCAGCTCCCT GATGTTTC-3'，反向引物 5'-AGCTGCATCCTCTCCAT GTT-3'，IL-27/EBI3 正向引物 5'-TGTTCTCCATGGCT CCCTAC-3'，反向引物5'-GCTCCCTGACGCTTGTAAC-3'；IL-33 正向引物 5'-AAATGAATCAGGTGACGGTG TT-3'，反向引物 5'-CCACAGAGTGTTCCTTGTTGTTG-3'；IFN-γ 正 向 引 物5'-GAGTGTGGAGACCATCAAGGA AG-3'，反向引物 5'-TGAGTTCATGTATTGCTTTGCG T-3'；內(nèi)參照物β 肌動(dòng)蛋白，正向引物5'-AGCGAGC ATCCCCCAAAGTT-3'，反向引物 5'-GGGCACGAAG GCTCATCATT-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實(shí)驗(yàn)步驟參照SYBR green 熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明書，PCR 反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。重復(fù)3 次。

1.2.3 觀察指標(biāo) 觀察3 組患者治療前RPR 滴度水平，治療前與治療后IL-27、IL-33 與IFN-γ 水平，觀察實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)3 組患者治療前與治療后IL-27、IL-33 與IFN-γ 水平，并分別比較3 組之間IL-27、IL-33 與IFN-γ 水平的差異性，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3 組患者年齡、性別、RPR 滴度的分析

3 組患者分別為25 例，其中男女性別比例血清轉(zhuǎn)陰組為11:14；血清未轉(zhuǎn)陰組為12:13；正常組為13:12，3 組之間性別比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療前血清轉(zhuǎn)陰組與血清未轉(zhuǎn)陰組其RPR 滴度在(1:4)、(1:8)、(1:16)、(1:32)的患者相應(yīng)人數(shù)見表1，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 正常對(duì)照組、梅毒血清轉(zhuǎn)陰組、梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組臨床資料（n,±s）

表1 正常對(duì)照組、梅毒血清轉(zhuǎn)陰組、梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組臨床資料（n,±s）

組別 例數(shù) 性別 治療前RPR滴度 年齡(y)男 女 1:4 1:8 1:16 1:32血清轉(zhuǎn)陰組 25 11 14 2 7 10 6 34.3±6.2血清未轉(zhuǎn)陰組 25 12 13 1 9 11 4 35.8±5.6正常對(duì)照組 25 13 12 0 0 0 0 35.6±5.7 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

2.2 3 組患者治療前后ELISA 檢測(cè)IL-27、IL-33 及IFN-γ 水平

治療前，3 組患者血清中IL-27 水平具有明顯差異，梅毒血清轉(zhuǎn)陰組、梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組中IL-27 水平明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），梅毒血清轉(zhuǎn)陰組IL-27 水平高于梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組（P＜0.05）。治療后，梅毒血清轉(zhuǎn)陰組、梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組IL-27 水平仍顯著高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而二者之間在治療后IL-27 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），梅毒血清轉(zhuǎn)陰組在治療前后，IL-27 水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），梅毒血清未轉(zhuǎn)陰者治療后IL-27 水平高于治療前，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

治療前，梅毒血清轉(zhuǎn)陰組、梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組IL-33 水平明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），梅毒血清轉(zhuǎn)陰組IL-33 水平與梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，梅毒血清轉(zhuǎn)陰組、梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組IL-33 水平高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），梅毒血清轉(zhuǎn)陰組在治療后，IL-33 水平較治療前顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組、正常對(duì)照組在治療前后IL-33 水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

治療前，3 組患者血清中IFN-γ 水平變化明顯，梅毒血清轉(zhuǎn)陰組、梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組患者中IFN-γ 水平明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組IFN-γ 水平高于梅毒血清轉(zhuǎn)陰組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療后，梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組IFN-γ 水平高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），梅毒血清轉(zhuǎn)陰組較正常對(duì)照組無(wú)明顯變化。梅毒血清未轉(zhuǎn)陰組在治療前后，IFN-γ 水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 治療前后3組患者IL-27、IL-33、IFN-γ水平ELISA檢測(cè)結(jié)果 （ˉx ±s，pg/ml）

2.3 治療前后3 組患者實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)IL-27、IL-33 及IFN-γ 水平

治療前后3 組患者IL-27、IL-33 及IFN-γ 表達(dá)水平詳見表3。

表3 治療前后3組患者IL-27、IL-33、IFN-γ 水平PCR檢測(cè)比較 （ˉx ±s，pg/ml）

3 討論

梅毒是常見的性傳播疾病之一，晚期常伴有系統(tǒng)損害，發(fā)病率成上升趨勢(shì)。如若臨床上能夠做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可極大預(yù)防或阻止晚期梅毒并發(fā)癥的發(fā)生。有研究指出，在梅毒的發(fā)病機(jī)制中體液免疫和細(xì)胞免疫發(fā)揮相關(guān)作用，存在Th1/Th2 失衡現(xiàn)象[7]，宿主對(duì)梅毒螺旋體的免疫應(yīng)答以Th1 細(xì)胞應(yīng)答為主，Th1 細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)是機(jī)體清除梅毒螺旋體最主要的免疫應(yīng)答反應(yīng)[8,9]。

IL-27 主要由活化的單核細(xì)胞和單核細(xì)胞來(lái)源的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生，在T 淋巴細(xì)胞增殖分化的早期，可以活化T-bet 促進(jìn)CD4+T 淋巴細(xì)胞向Th1 方向分化，同時(shí)亦可協(xié)同IL-12 促進(jìn)初始T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，進(jìn)而促使Th0 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞分化[10]。IL-33 屬于IL-1 家族，是Th2 細(xì)胞活化因子，可促進(jìn)Th2 細(xì)胞分泌IL-5、IL-13、IL-4 等細(xì)胞因子，IL-33 的分泌增加又對(duì)IFN-γ 等Th1 細(xì)胞因子的分泌產(chǎn)生抑制，最終使Th2 細(xì)胞的功能得到加強(qiáng)[11,12]。Th1 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子主要參與自身免疫反應(yīng)性疾病及慢性感染性疾病當(dāng)中，IFN-γ 是由Th1 細(xì)胞分泌產(chǎn)生，具有調(diào)控免疫應(yīng)答，增強(qiáng)殺傷細(xì)胞活性的作用。而且IFN-γ 能夠激活自然殺傷（NK）細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性來(lái)發(fā)揮免疫防御功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗感染能力[13]。

從本實(shí)驗(yàn)研究ELISA 及PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，治療前血清轉(zhuǎn)陰組、血清未轉(zhuǎn)陰組以及正常對(duì)照組IL-27 水平之間存在顯著差異，其中以血清轉(zhuǎn)陰組治療前IL-27 水平最高，經(jīng)過(guò)規(guī)則治療后，血清轉(zhuǎn)陰組IL-27 水平輕度增加，而血清未轉(zhuǎn)陰組IL-27 水平顯著增加，此結(jié)果表明梅毒患者治療前體內(nèi)IL-27 基礎(chǔ)表達(dá)水平越高，患者血清梅毒特異抗體轉(zhuǎn)陰概率越大，且ELISA 結(jié)果與PCR 結(jié)果相一致。研究表明，IL-27 具有抗炎特性[14]。本研究表明，IL-27 在清除梅毒螺旋體中起著重要作用，這與IL-27 的抗炎特性明顯相關(guān)。

同時(shí)本研究結(jié)果顯示，治療前血清轉(zhuǎn)陰組與血清未轉(zhuǎn)陰組IL-33 水平之間無(wú)顯著差異，但二者明顯高于正常對(duì)照組，經(jīng)過(guò)規(guī)則治療后，血清轉(zhuǎn)陰組其IL-33 水平顯著下降，而血清未轉(zhuǎn)陰組水平輕度下降，且ELISA 結(jié)果與PCR 結(jié)果相一致。對(duì)于血清轉(zhuǎn)陰組，經(jīng)過(guò)治療后，其體內(nèi)IL-33 水平顯著降低，而對(duì)于血清非轉(zhuǎn)陰組而言，治療后IL-33 仍處于相對(duì)高水平狀態(tài)，表明IL-33 不利于機(jī)體清除梅毒螺旋體，這可能與IL-33 促進(jìn)了Th2 反應(yīng)有關(guān)。

之前研究已證實(shí)IFN-γ 是由Th1 細(xì)胞分泌，而在梅毒患者體內(nèi)，梅毒螺旋體能夠抑制Th1 的產(chǎn)生。目前研究表明IFN-γ 具有多種生物活性，可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞殺傷病原微生物[15]。本實(shí)驗(yàn)研究ELISA 及PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，治療前，血清轉(zhuǎn)陰組、血清未轉(zhuǎn)陰組以及正常對(duì)照組IFN-γ 之間存在顯著差異，其中以血清未轉(zhuǎn)陰組水平最高。通過(guò)正規(guī)驅(qū)梅毒治療后，血清轉(zhuǎn)陰組及血清未轉(zhuǎn)陰組患者IFN-γ 水平均顯著下降，ELISA 結(jié)果與PCR 結(jié)果相一致。這表明對(duì)于梅毒螺旋體患者，Th1 細(xì)胞分泌IFN-γ 來(lái)參與消除梅毒螺旋體，故通過(guò)監(jiān)測(cè)梅毒患者治療前后IFN-γ 水平，可以預(yù)測(cè)梅毒治療敏感性及效果。有研究表明，IFN-γ 在早期梅毒患者血清中表達(dá)較高，伴隨梅毒分期進(jìn)展，其表達(dá)下降，提示免疫應(yīng)答已由Th1 優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)為Th2 優(yōu)勢(shì)[16]，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。