滕祥云，王新夢，劉 維，樊 慧，李 琦

(長沙三濟生物科技有限公司,長沙 410205)

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在我國結(jié)直腸癌的死亡率位于全部惡性腫瘤死亡率的前6位，對人類健康產(chǎn)生嚴重影響[1]。伊立替康是一種治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的特效藥，與氟尿嘧啶聯(lián)合使用，可以延長結(jié)直腸癌患者的生存期[2]。但是，伊立替康因其毒副作用的影響(尤其是嚴重的延遲性腹瀉以及骨髓抑制)，使用受到一定的限制。而引起伊立替康產(chǎn)生毒副作用發(fā)生的機制可能與遺傳基因多態(tài)性有關。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(uridine diphosphate glucuronosyltransferase，UGT)是 體 內(nèi)重要第II相生物轉(zhuǎn)化代謝酶，分為UGT1和UGT2兩個家族。UGT1A1啟動子區(qū)存在大量的TA堿基重復序列(TA6或TA7)，隨著TA重復序列數(shù)目的增加，UGT1A1表達下降，將導致伊立替康代謝產(chǎn)物SN-38在體內(nèi)過度蓄積，從而引發(fā)嚴重的毒副反應[3]。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)在伊立替康和UGT1A1的標簽中表明，UGT1A1*28純合基因型(TA7/ TA7)使用伊立替康進行治療時，中性粒細胞減少增加。

有研究發(fā)現(xiàn)，UGT1A1 基因多態(tài)性的分布在不同種族間存在明顯差異[4]，為進一步明確中國漢族結(jié)直腸癌人群UGT1A1*28位點基因多態(tài)性的分布特點及差異，本研究采用焦磷酸測序技術對505例漢族結(jié)直腸癌患者UGT1A1*28的基因多態(tài)性進行檢測，比較不同性別、年齡段及地區(qū)漢族結(jié)直腸癌患者中UGT1A1*28基因型分布特點，為結(jié)直腸癌人群的UGT1A1*28基因篩查及個體化用藥提供理論依據(jù)，有效減少臨床延遲性腹瀉以及骨髓抑制等不良事件的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 研究對象 505例結(jié)直腸癌患者的臨床樣本來自全國49家醫(yī)療機構于2016～2017年送檢的血液標本，每份樣本均通過病理檢查確診。其中，男性311例，平均年齡58.10±11.19歲；女性194例，平均年齡56.19±11.73歲。

1.2 試劑與儀器 DNA提取試劑盒、測序反應通用試劑盒(長沙三濟生物科技有限公司)；焦磷酸測序試劑、 Qiagen PyroMark Q24 焦磷酸測序儀(德國凱杰公司)；PCR擴增引物和焦磷酸測序引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取：按照DNA提取試劑盒說明書進行。

1.3.2 引物設計：見表1。采用PyroMark Assay Design Software2.0(德國凱杰公司)軟件設計PCR引物和焦磷酸測序引物。

表1 UGT1A1*28 位點的引物序列

1.3.3 焦磷酸測序法檢測UGT1A1*28的基因多態(tài)性 ：按照儀器和試劑盒說明書進行PCR擴增、焦磷酸測序，并通過Qiagen PyroMark Q24(德國凱杰公司)軟件對測序結(jié)果進行分析，根據(jù)出峰的堿基和峰高判斷UGT1A1*28的基因型。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)表示，計數(shù)資料以頻數(shù)表述，組間比較采用 χ2檢驗或Fisher精確檢驗，Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗采用Person χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果 采用焦磷酸測序技術，檢測UGT1A1*28基因多態(tài)性，其代表性結(jié)果見圖1。

圖1 UGT1A1*28焦磷酸測序結(jié)果

2.2 UGT1A1*28基因型分布情況 UGT1A1*28的3種基因型分布頻率為TA6/TA6：74.26%，TA6/TA7：22.97%，TA7/TA7：2.77%，等位基因的分布頻率為TA6：85.74%，TA7：14.26%，檢測結(jié)果符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.84，P ＞ 0.05)。

2.3 中國漢族結(jié)直腸癌患者UGT1A1*28基因型和等位基因分布 505例結(jié)直腸癌患者中，UGT1A1*28野生型(TA6/TA6)、雜合型(TA6/TA7)、突變純合型(TA7/TA7)頻率分別為74.26%，22.97%和2.77%。通過對不同性別、年齡段以及地區(qū)UGT1A1*28基因型和等位基因數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，基因型分布和等位基因分布與患者性別、年齡以及地區(qū)之間差異無統(tǒng)計學意義(P ＞ 0.05)，見表2。

3 討論

UGT1A1基因位于染色體2q37，是尿苷酸二磷酸葡萄醛酸轉(zhuǎn)移酶中的一員，其基因產(chǎn)物的主要作用是醛酸化各種外源性藥物以及內(nèi)生底物葡萄糖，使其更好地被清除，包括伊立替康、膽紅素等。伊立替康(Irinotecan, CPT-11)，是一種DNA拓撲異構酶I抑制劑，是目前治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌最有效的化療藥物之一[5]，主要在肝臟內(nèi)進行代謝，形成活性代謝產(chǎn)物7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)，SN-38的細胞毒性大大增強，從而導致毒副作用的發(fā)生。UGT1A1是伊立替康的重要代謝酶，該基因位點存在50多種基因多態(tài)性，其中以UGT1A1*6和UGT1A1*28與伊立替康療效和安全性研究為主[6-7]，UGT1A1*28啟動子區(qū)存在大量的TA堿基重復序列，隨著TA重復序列數(shù)目的增加，UGT1A1酶活性下降，使得SN-38在體內(nèi)蓄積，從而引發(fā)嚴重的毒副反應[3]。2005年FDA批準UGT1A1*28用于預測伊立替康的不良反應。

結(jié)直腸癌是一種世界范圍的消化道常見惡性腫瘤，發(fā)病率位于第三位[8]。在我國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率約為37.6/10萬，死亡率約為19.1/10萬[9]，并且呈現(xiàn)上升趨勢，成為中國社會重要的健康負擔，尤其是在較為發(fā)達的省份[10]。以往研究表明UGT1A1*28基因多態(tài)性與伊立替康療效及不良反應密切相關，并且UGT1A1*28基因多態(tài)性有地域和種族差異。本次研究中中國漢族結(jié)直腸癌患者中UGT1A1*28 的3種基因型發(fā)生率與國內(nèi)漢族人群相關報道結(jié)果一致[11-12]。UGT1A1*28的基因型分布頻率為TA6/TA6：74.26%，TA6/TA7：22.97%，TA7/TA7：2.77%，等位基因的分布頻率為TA6：85.74%，TA7：14.26%。UGT1A1*28的3種基因型及兩種等位基因分布與中國漢族結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、地區(qū)差異無關。但在新疆維吾爾族人群[13]中， TA6與TA7兩種等位基因的頻率分別為30.93%和69.07%，兩者之間存在差異性。與國外研究相比，泰國[14]UGT1A1*28基因頻率分布與我國相似，沙特阿拉伯[15]、秘魯和墨西哥[16]TA7等位基因頻率高于我國。由此可知，UGT1A1*28基因頻率存在種族差異性，相比于白種人，TA7等位基因在中國人群中的頻率較低。

綜上所述，UGT1A1是伊立替康重要的代謝酶，UGT1A1*28基因多態(tài)性可以預測伊立替康不良反應，但是UGT1A1*28在白種人群中突變率較高，而在中國人群中突變率較低，在對中國人使用伊立替康治療時，是否需要檢測UGT1A1*28多態(tài)性，尚無一致的定論。本次研究還存在很多局限性，本次研究結(jié)果還需要更廣泛的地區(qū)，更大的樣本量進一步驗證。