孫 大 禹， 周 海 龍， 杜 元 元， 李 憲 臻， 楊 帆

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.中國(guó)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)， 北京 100833 )

0 引 言

菊糖是由多個(gè)D-呋喃果糖分子通過(guò)β-2,1-糖苷鍵連接而成的果糖聚合物，呈直鏈結(jié)構(gòu)，其還原末端通過(guò)α-1,2糖苷鍵連有一個(gè)葡萄糖殘基[1]。菊糖的聚合度一般在2～60，平均聚合度為10，水解后可生成少量葡萄糖和果糖[2-3]。菊糖作為貯存性果聚糖類(lèi)碳水化合物，廣泛存在于菊芋等植物中[4]。菊芋在我國(guó)的畝產(chǎn)可達(dá)3～5 t，是生產(chǎn)燃料乙醇的優(yōu)質(zhì)能源生物質(zhì)[5]。

研究表明，僅有少數(shù)微生物能夠直接利用菊糖生產(chǎn)乙醇，且其乙醇生產(chǎn)能力十分有限[6]。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為生產(chǎn)乙醇的傳統(tǒng)菌株，其乙醇生產(chǎn)能力強(qiáng)、易于培養(yǎng)且遺傳操作平臺(tái)成熟，成為轉(zhuǎn)化菊糖產(chǎn)乙醇的首選微生物[7]。然而，絕大多數(shù)天然釀酒酵母菌株都不能有效將菊糖水解為可發(fā)酵糖[8]，嚴(yán)重阻礙了菊糖基乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母KCCM50549在5 L發(fā)酵罐中，利用180 g/L菊芋粉(菊糖聚合度小于15)生產(chǎn)乙醇時(shí)的乙醇產(chǎn)量為36.2 g/L[9]。中科院青島生物能源研究所微生物資源團(tuán)隊(duì)獲得了一株溫度耐受性菊糖代謝釀酒酵母菌株，該菌株在40 ℃下乙醇得率為79.7%，這是目前報(bào)道的非工程釀酒酵母中菊芋乙醇發(fā)酵的最高得率。

作為釀酒酵母水解菊糖的關(guān)鍵酶，蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2的表達(dá)水平直接影響釀酒酵母水解菊糖的能力[10]。本工作克隆獲得釀酒酵母蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2的編碼基因，并利用AGA1-AGA2錨定蛋白復(fù)合體將SUC2表面展示于商品化釀酒酵母菌株EBY100中，旨在為理性改造釀酒酵母使其高效轉(zhuǎn)化菊糖產(chǎn)乙醇提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

S.cerevisiaeEBY100及酵母表面展示載體pYD1，美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司；E. coli DH10B及pMD18-T Simple Vector獲贈(zèng)于大連化學(xué)物理研究所趙宗保研究員課題組。釀酒酵母BY-BS是含有質(zhì)粒pYC230-SUC2的釀酒酵母BY4741重組菌株，由本室前期構(gòu)建并保藏。

PrimeSTAR HS DNA 聚合酶，250 bp DNA Marker，大連寶生物有限公司；DpnⅠ，NEB公司。

酵母發(fā)酵液體培養(yǎng)基YPD：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，pH 6.0；固體YPD培養(yǎng)基：瓊脂粉15.0 g/L，其余同YPD液體培養(yǎng)基；YNB-CAA液體培養(yǎng)基：YNB 6.7 g/L，酪蛋白氨基酸5 g/L，葡萄糖或半乳糖20 g/L；LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基：瓊脂粉15.0 g/L，其余同LB液體培養(yǎng)基。

Eppendorf AG22331電擊融合儀，德國(guó)艾本德股份有限公司；MD spectramax paradigm酶標(biāo)儀，美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因SUC2的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定所用引物均合成于大連寶生物有限公司，引物序列及功能如表1所示。

1.2.2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因的克隆

取搖床培養(yǎng)24 h的釀酒酵母新鮮發(fā)酵菌液，于4 ℃、4 000 r/min離心收集菌體，采用基因組抽提試劑盒提取基因組DNA并以之為模板進(jìn)行蔗糖轉(zhuǎn)化酶全長(zhǎng)編碼基因的擴(kuò)增?；驍U(kuò)增上游引物為SUC2-F，下游引物為SUC2-R。PCR反應(yīng)體系：100 ng釀酒酵母基因組DNA，10 μL 5×PrimeSTAR buffer，20 μmol/L引物，2.5 mmol/L dNTPs，1.25 U PrimeSTAR HS DNA聚合酶，加水至總體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收擴(kuò)增產(chǎn)物。將回收的SUC2基因片段通過(guò)TA克隆連接至pMD18-T，構(gòu)建質(zhì)粒pT-SUC2并進(jìn)行測(cè)序。

表1 SUC2引物序列及功能

1.2.3 pYD1-SUC2表面展示載體的構(gòu)建

采用RF克隆策略(Restriction-free cloning)將SUC2基因連接到表面展示載體pYD1上。RF I反應(yīng)所用引物為pYD-SF和pYD-SR，以質(zhì)粒pT-SUC2為模板，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)?；厥赵噭┖袑?duì)RFI擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收。RF Ⅱ反應(yīng)體系：280 ng RF Ⅰ回收產(chǎn)物，100 ng pYD1，5 μL 5×PrimeSTAR buffer，2.5 mmol/L dNTPs，1.25 U PrimeSTAR HS DNA聚合酶，加水至總體積為25 μL。RF Ⅱ反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，65 ℃ 1 min，68 ℃ 10 min，15個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃)，隨后，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，68 ℃ 10 min，20個(gè)循環(huán)，68 ℃ 15 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

取8.5 μL RF Ⅱ反應(yīng)產(chǎn)物，加入1.5 μL 10 U/μLDpnⅠ，37 ℃消化6 h以上降解模板質(zhì)粒。取3 μL消化產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化至E.coliDH10B中，轉(zhuǎn)化菌液涂布于含終濃度100 μg /mL氨芐青霉素的LB平板，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切驗(yàn)證。酶切體系：0.5 μg質(zhì)粒DNA，0.5 μLXbaⅠ，1 μL 0.1%×BSA，1 μL 10×M buffer，加水至體積為10 μL，37 ℃溫育2 h，1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送至上海生工測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pYD1-SUC2。

1.2.4 表面展示蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2的重組釀酒酵母的構(gòu)建

將鑒定正確表達(dá)質(zhì)粒pYD1-SUC2電擊轉(zhuǎn)化至S.cerevisiaeEBY100感受態(tài)細(xì)胞中，電壓為1.5 kV。電擊結(jié)束后轉(zhuǎn)化菌液加入1 mL山梨醇(1 mol/L)，30 ℃溫育2 h后將轉(zhuǎn)化菌液涂布于色氨酸選擇性篩選平板上，30 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行PCR鑒定，正確的重組釀酒酵母命名為EBY-S。

1.2.5 表面展示有SUC2的釀酒酵母重組菌株酶活測(cè)定

重組菌EBY-S在YNB-CAA液體培養(yǎng)基中于20 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)96 h。不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定菌體表面展示SUC2的蔗糖酶活和菊糖酶活。酶活測(cè)定方法：1 mL發(fā)酵菌液5 000g、4 ℃ 離心10 min收集菌體，重懸于1 mL 0.1 mol/L PBS緩沖溶液(pH 6.8)。取50 μL重懸菌液與450 μL菊糖或蔗糖底物(20 g/L，pH 5.0)混勻，50 ℃水浴反應(yīng)15 min。采用DNS法測(cè)定反應(yīng)釋放的還原糖。菊糖酶及蔗糖酶酶活定義：在pH 5.0、50 ℃的反應(yīng)條件下，每分鐘水解菊糖或蔗糖釋放1 μmol葡萄糖或果糖所需的酶量為1 U。對(duì)照菌株分別為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的SUC2分泌表達(dá)菌株BY-BS和含有空pYD1載體的釀酒酵母EBY-C。

2 結(jié)果與討論

2.1 蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因SUC2的克隆

以釀酒酵母基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因SUC2，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。在1 500 bp附近擴(kuò)增出一條特異性條帶，大小與蔗糖轉(zhuǎn)化酶目的基因片段一致。將回收的PCR產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)證明為蔗糖轉(zhuǎn)化酶的編碼基因，大小為1 592 bp，該基因編碼的蔗糖轉(zhuǎn)化酶含有533個(gè)氨基酸殘基，理論分子質(zhì)量為60.6 ku。該蔗糖轉(zhuǎn)化酶的N端含有一段大小為20 aa的分泌信號(hào)肽，其催化結(jié)構(gòu)域隸屬于糖苷水解酶32c家族。

1， SUC2基因目的條帶；M， DNA marker

2.2 SUC2表面展示表達(dá)載體及菌株的構(gòu)建

利用RF克隆策略將SUC2基因連接到表面展示載體pYD1上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH10B感受態(tài)細(xì)胞中。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，XbaⅠ酶切驗(yàn)證。電泳結(jié)果如圖2所示，1號(hào)重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后顯示有大小為1 800和4 700 bp的兩條特異性條帶，與預(yù)測(cè)正確重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果基本一致。將酶切鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒送上海生工測(cè)序，結(jié)果表明本工作成功構(gòu)建了蔗糖轉(zhuǎn)化酶表達(dá)載體pYD1-SUC2。將表達(dá)載體pYD1-SUC2轉(zhuǎn)化至S.cerevisiaeEBY100感受態(tài)細(xì)胞中，30 ℃靜置培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定。電泳結(jié)果如圖3所示，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后顯示有大小為1 800 bp的特異性條帶，與理論P(yáng)CR結(jié)果基本一致。該結(jié)果表明，成功構(gòu)建了表面展示蔗糖轉(zhuǎn)化酶的重組釀酒酵母EBY-S。

1， 重組質(zhì)粒酶切條帶； 1′， 重組質(zhì)粒； M， DNA marker

圖2 重組質(zhì)粒pYD1-SUC2的XbaⅠ酶切驗(yàn)證結(jié)果

Fig.2 The electrophoresis results of the recombinant plasmid pYD1-SUC2 digested byXbaⅠ

1， PCR鑒定結(jié)果； M， DNA marker

圖3 轉(zhuǎn)化有pYD1-SUC2的釀酒酵母重組菌株EBY-S的鑒定結(jié)果

Fig.3 PCR identification of EBY-S transformed with pYD1-SUC2

2.3 表面展示蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2的釀酒酵母重組菌株最佳產(chǎn)酶時(shí)間的確定

將表面展示蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2的釀酒酵母重組菌EBY-S在含有2%半乳糖的YNB-CAA液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)96 h，每12 h取樣，結(jié)果如圖4所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞表面逐漸展示出蔗糖酶活力，72 h達(dá)到最高值241.6 U/mL，之后發(fā)酵菌液細(xì)胞表面SUC2酶活力逐漸下降。因此，EBY-S重組菌表面展示SUC2的最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h。

圖4 重組菌株EBY-S蔗糖酶的最佳發(fā)酵時(shí)間

2.4 表面展示SUC2的釀酒酵母重組菌株酶活力分析

如圖5所示，在最適發(fā)酵時(shí)間條件下，EBY-S重組菌菌體表面展示SUC2的蔗糖酶酶活力為241.6 U/mL，菊糖酶酶活力為9.4 U/mL，顯著高于陰性對(duì)照菌株EBY-C。說(shuō)明SUC2能夠借助錨定蛋白復(fù)合體AGA1-AGA2在EBY-100細(xì)胞表面成功展示表達(dá)。

圖5 SUC2釀酒酵母重組菌株酶活力分析

潘志友等[11]將脂肪酶B表面展示于釀酒酵母，產(chǎn)物乙酸乙酯的產(chǎn)率提高到98%。唐語(yǔ)謙等[12]將人源蛋白酶體α亞基6(α6)成功地展示于釀酒酵母中，結(jié)果顯示人源蛋白酶體α亞基6(α6)有很好的抗原性和特異性。本課題組前期工作中，將SUC2分泌表達(dá)在釀酒酵母BY4741中，獲得重組菌株發(fā)酵液上清的蔗糖酶及菊糖酶活力分別為100和5 U/mL[10]。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)SUC2成功的展示于釀酒酵母上后，EBY-S重組菌菌體表面蔗糖酶活力是BY-BS的2.4倍，菊糖酶活力是BY-BS的1.9倍。結(jié)果表明，較之分泌表達(dá)技術(shù)，表面展示技術(shù)能夠顯著的提高酶在釀酒酵母中的酶活力。

3 結(jié) 論

本工作以釀酒酵母為出發(fā)菌株，從中克隆出蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2編碼基因，并通過(guò)融合錨定蛋白AGA2實(shí)現(xiàn)其在釀酒酵母細(xì)胞表面的展示表達(dá)。重組菌在發(fā)酵72 h時(shí)，SUC2能夠通過(guò)錨定蛋白復(fù)合體AGA1-AGA2成功地表面展示于釀酒酵母細(xì)胞壁，且相對(duì)其他發(fā)酵時(shí)間表現(xiàn)出最高的表面展示水平，酶活力達(dá)241.6 U/mL。同時(shí)，相對(duì)于SUC2分泌表達(dá)型重組菌，SUC2表面展示菌株具有更高的蔗糖酶活力及菊糖酶活力。說(shuō)明釀酒酵母表面展示系統(tǒng)對(duì)于提高菌株SUC2表達(dá)水平及酶活力具有很好的效果。