袁林，趙紅玉，李華,2,3*，王華,2,3*

1(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌，712100) 2(陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌，712100) 3(國家林業(yè)和草原局葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研發(fā)中心，陜西 楊凌，712100)

近年來，我國葡萄和葡萄酒產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展。據(jù)國際葡萄與葡萄酒組織(the international organisation of uine and wine, OIV)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2018年世界葡萄總種植面積約為740萬公頃，葡萄酒產(chǎn)量為279億L，中國以9.3億L的葡萄酒產(chǎn)量位居世界第十位，同時也是世界第二大葡萄種植國和第五大葡萄酒消費國[1]。我國自主選育的葡萄品種公釀一號，以玫瑰香葡萄和山葡萄雜交培育而成，目前在我國東北、內(nèi)蒙古及山東有規(guī)?；N植，種植面積廣泛。該葡萄品種生產(chǎn)的紅葡萄酒呈寶石紅色，清澈透明、回味綿長、酒質(zhì)優(yōu)良，具備山葡萄酒的特點，頗受好評。同時公釀一號葡萄具有良好的農(nóng)業(yè)生物學(xué)特性，其植株生長勢強(qiáng)，芽眼萌發(fā)率高，結(jié)實力強(qiáng)，畝產(chǎn)量可達(dá)3 000 kg，極耐寒、耐旱、耐濕，抗黑痘病、炭疽病、白腐病，抗鹽堿能力強(qiáng)[2-5]。但當(dāng)前使用公釀一號葡萄釀造的單品種干紅葡萄酒存在的一個突出問題是酸度過高，影響葡萄酒的口感，因此現(xiàn)在大多被用來釀造桃紅葡萄酒[6]和冰葡萄酒[7]。

葡萄酒降酸方法包括化學(xué)降酸、物理降酸和生物降酸3種，其中化學(xué)降酸操作方便、易控制、降酸效果明顯，但其化學(xué)反應(yīng)往往會影響酒液的口感和色澤，同時由于金屬離子的大量溶入，可能會帶來酒液的不穩(wěn)定，如失光、混濁等[8]；物理降酸中的冷處理降酸和離子交換降酸動力消耗較大[9]；生物降酸中的裂殖酵母可將蘋果酸分解90%以上，但可能受釀酒酵母抑制而導(dǎo)致酒質(zhì)不佳，所以應(yīng)用較多的是蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation，MLF)[10-12]?；灬劮ㄗ鳛槲锢斫邓岱椒ǖ囊环N，不僅能有效降酸，還能為葡萄酒賦予更復(fù)雜的香氣，在國外已經(jīng)被廣泛采用[13-14]，但在國內(nèi)研究較少且僅限于桃紅葡萄酒、白葡萄酒和冰葡萄酒[15-17]，未見關(guān)于混釀紅葡萄酒的文獻(xiàn)報道。因此，本研究采用物理降酸中的混釀和生物降酸中的MLF相結(jié)合的方法解決公釀一號葡萄酒的高酸問題，從而研發(fā)出品質(zhì)優(yōu)良的公釀一號復(fù)合葡萄酒，不僅能進(jìn)一步開發(fā)公釀一號葡萄的釀酒潛力，拓寬該葡萄品種釀酒范圍，還可推廣到其他酸度高的葡萄酒，同時有利于中國本土特色葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

愛格麗和媚麗是陜西楊凌地區(qū)的主栽白色和紅色釀酒葡萄品種，具有優(yōu)良的綜合性狀，且所釀葡萄酒酸含量相對較低[18]。因此，本試驗選取山東地區(qū)的釀酒葡萄公釀一號和陜西地區(qū)的釀酒葡萄愛格麗、媚麗，分別釀造小容器干紅和干白葡萄酒并分別按一定比例調(diào)配，檢測公釀一號葡萄成熟過程中的有機(jī)酸變化情況和公釀一號復(fù)合葡萄的理化指標(biāo)和多酚類物質(zhì)，并進(jìn)行感官品評試驗，以期為公釀一號葡萄酒乃至其它高酸葡萄品種所釀造的葡萄酒提供降酸方式與思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為7款不同原料和配比的混釀紅葡萄酒，其中公釀一號葡萄原料采自山東高密；愛格麗、媚麗葡萄原料采自陜西合陽葡萄試驗示范站，原料采收后即進(jìn)行酒精發(fā)酵，原酒于-5 ℃低溫冷藏，待所需原酒釀造完成后進(jìn)行混釀和蘋果酸-乳酸發(fā)酵。7款復(fù)合紅葡萄酒配比如表1所示。試驗所用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)來自安琪酵母股份有限公司；酒酒球菌(Oenococcusoeni)SD-2a來自實驗室前期保存。

表1 復(fù)合葡萄酒配比Table 1 The formula of compound wines

NaOH、(NH4)2SO4、Na2CO3、NaNO2、AlCl3、CuSO4·5H2O、葡萄糖、四水合酒石酸鉀鈉、甲醇(均為分析純)，廣州金華化學(xué)試劑有限公司；H2SO4、HCl(均為分析純)，西隴科學(xué)股份有限公司；兒茶素、沒食子酸、蘆丁(純度均≥98%)，美國Sigma公司；福林酚(分析純)，北京索萊寶科技有限公司；對二甲基肉桂酸(p-dimethylcinnamic acid，p-DMACA)、2-辛醇(分析純)、單體酚標(biāo)準(zhǔn)品(原兒茶酸、綠原酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、對香豆酸、反式阿魏酸、槲皮素、山奈酚和鞣花酸)(色譜純)、有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(草酸、檸檬酸、L-酒石酸、L-蘋果酸、琥珀酸、L-乳酸、乙酸)(色譜純)，上海源葉生物技術(shù)有限公司；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、乙酸乙酯(色譜純)、乙酸(色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C雷磁pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；磁力加熱攪拌器，常州國華電器有限公司；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；LC-20A高效液相色譜儀(配備SPD-M20A檢測器、SIL-20A自動進(jìn)樣器及CLASS-VP工作站)，日本島津公司；HH-S6電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；Cary60UV-Vis紫外分光光度計，美國安捷倫公司；Waters UPLC Ⅰ-Class超高壓液相色譜儀，美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 公釀一號葡萄采樣方法

自轉(zhuǎn)色期開始至果實成熟為止，每隔7 d采樣1次，共5次。采樣根據(jù)章文才[19]的對角線法則進(jìn)行，選取并標(biāo)記10棵葡萄樹，分別在每棵葡萄樹陽面與陰面的上、中、下部隨機(jī)選取1穗葡萄，然后分別在每穗葡萄的上、中、下部各隨機(jī)選取2粒葡萄，共選取60穗葡萄，共計360粒葡萄。

1.3.2 葡萄酒釀造工藝流程

釀造工藝參考干紅葡萄酒小容器釀造法[20]和干白葡萄酒小容器釀造法[21]并稍作修改，具體步驟如下：

干紅葡萄酒：葡萄原料→果實分選→除梗破碎→壓榨(添加60 mg/L SO2)→酒精發(fā)酵(200 mg/L酵母菌，25～28 ℃)→酒精發(fā)酵結(jié)束(不添加SO2)→分離皮渣→低溫冷藏→按不同比例調(diào)配→接種乳酸菌→蘋果酸-乳酸發(fā)酵(滿罐密封，18～20 ℃)→蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束(添加60 mg/L SO2)→裝瓶。

干白葡萄酒：葡萄原料→果實分選→除梗破碎→壓榨取汁(添加60 mg/L SO2)→澄清→酒精發(fā)酵(200 mg/L酵母菌，18～20 ℃)→酒精發(fā)酵結(jié)束(不添加SO2)→低溫冷藏→按不同比例調(diào)配→接種乳酸菌→蘋果酸-乳酸發(fā)酵(滿罐密封，18～20 ℃)→蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束(添加60 mg/L SO2)→裝瓶。

1.3.3 基本理化指標(biāo)檢測

依據(jù)葡萄酒分析檢驗[22]，測定葡萄酒的基本理化指標(biāo)：pH使用電位法，用pH計測定；還原糖采用斐林試劑法測定，含量以葡萄糖計；滴定酸采用NaOH滴定法測定，含量以檸檬酸計；酒精度采用密度瓶法測定；揮發(fā)酸采用NaOH滴定法測定，含量以醋酸計；有機(jī)酸采用高效液相色譜HPLC法測定，葡萄樣品前處理方法為隨機(jī)選取葡萄粒去皮去籽取汁，稱取1.00 g于15 mL離心管中，加入10 mL流動相，超聲振蕩和離心(4 ℃，8 000 r/min)各20 min，取上清液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾到進(jìn)樣瓶中；酒樣前處理方法為取100 μL酒樣加入4.9 mL流動相(稀釋50倍)后振蕩混勻，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾到進(jìn)樣瓶中。色譜柱為菲羅門Mars MOA 10u色譜柱(300 mm×7.8 mm)；流動相為8 mmol/L H2SO4；流速為0.3 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫50 ℃。進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.4 多酚類物質(zhì)測定

總花色苷含量采用pH示差法(pH differential method)測定[23]，結(jié)果以二甲花翠素葡萄糖苷表示；單寧含量采用甲基纖維素沉淀(methyl cellulose precipitation，MCP)法測定[24]，結(jié)果以兒茶素表示；總類黃酮采用NaNO2-AlCl3分光光度法測定[25]，含量以蘆丁表示；總黃烷-3-醇采用p-DMACA-鹽酸法測定[26]，結(jié)果以(+)-兒茶素表示；總酚采用Folin-Ciocalteu法測定[27]，結(jié)果以沒食子酸表示；單體酚含量利用超高壓液相色譜儀(ultra performance liguid chromatography，UPLC)測定[28]，酒樣前處理為以1∶1的體積比將酒樣與乙酸乙酯混合，振蕩離心后移取上清液于50 mL圓底燒瓶中，重復(fù)3次后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液蒸干(35 ℃)，用甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾。色譜柱為Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相A為1%乙酸(體積分?jǐn)?shù))溶液，流動相B為乙腈；流速為0.2 mL/min；檢測波長210～400 nm；柱溫30 ℃。梯度洗脫程序為0～3 min，B相3%～6%；3～7 min，B相6%～15%；7～11 min，B相15%～30%；11～13 min，B相30%；13～15 min，B相30%～3%。進(jìn)樣量為0.5 μL。

1.3.5 感官品評

感官品嘗小組成員由11位接受過專業(yè)感官培訓(xùn)的學(xué)生組成(男性4名、女性7名)，年齡在20～25歲之間。評價小組分別從外觀(色度、色調(diào)、澄清度)、香氣(純正度、濃郁度、優(yōu)雅度、協(xié)調(diào)性)、口感(甜度、酸度、澀感、酒度、酒體、協(xié)調(diào)性、濃郁度、持久度、余味)以及整體平衡性4個方面對葡萄酒進(jìn)行感官品評，總分100分；兩樣品分析間充分休息，以使味覺恢復(fù)。最后依據(jù)葡萄酒品嘗評分表對結(jié)果進(jìn)行整理與統(tǒng)計分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 23.0進(jìn)行方差分析(analysis of variance，ANOVA)，選用Duncan多重比較確定數(shù)據(jù)間的差異顯著水平為P<0.05。除發(fā)酵試驗進(jìn)行2次重復(fù)外，其它試驗均進(jìn)行3次重復(fù)，并將結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。使用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 公釀一號葡萄果實理化指標(biāo)分析

表2為不同采收期公釀一號葡萄的理化指標(biāo)。由表2可知，在成熟過程中公釀一號葡萄的糖酸比呈遞增趨勢，但即使是在果實完全成熟時，其總酸含量仍高達(dá)(9.47±0.04) g/L，明顯高于其他紅色釀酒葡萄品種[29]。此外，從表2中還可以看出，公釀一號葡萄中的有機(jī)酸主要為酒石酸和蘋果酸，其他4種有機(jī)酸含量較少；在成熟過程中，草酸含量呈不斷增加的趨勢，蘋果酸和琥珀酸含量不斷減少，檸檬酸含量緩慢減少，乳酸含量緩慢增加，酒石酸含量呈波動變化且各時期無顯著性變化。

表2 不同采收期公釀一號葡萄理化指標(biāo)Table 2 The physicochemical indexes in different harvest time of Gongniang No.1 grapes

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，“-”表示未檢出，下同。

2.2 復(fù)合葡萄酒品質(zhì)分析

2.2.1 復(fù)合葡萄酒基本理化指標(biāo)分析

表3為復(fù)合葡萄酒的基本理化指標(biāo)，可看出各酒樣的還原糖、揮發(fā)酸、干浸出物、酒精度等指標(biāo)均符合GB 15037—2006《葡萄酒》的要求。表3還顯示，經(jīng)調(diào)配的酒樣與未經(jīng)調(diào)配的GN酒樣相比，無論是否經(jīng)過MLF，pH都有所升高，總酸含量有所降低，說明調(diào)配可有效解決公釀一號葡萄酒的酸高問題。同時，經(jīng)過MLF的酒樣與未經(jīng)MLF的酒樣相比，pH和總酸含量也相應(yīng)升高和降低，這說明MLF同樣有效降低了酸度。從表3還可以看出，隨著調(diào)配比例的變化，復(fù)合葡萄酒的還原糖、揮發(fā)酸、酒度和干浸出物差異不顯著，但pH和總酸有顯著性差異，且隨著復(fù)合葡萄酒中公釀一號原酒的占比下降，總酸含量也隨之降低，E3和M3的總酸含量分別是用愛格麗和媚麗調(diào)配中最低的，說明在3∶1(V∶V)的比例下降酸效果最好。與媚麗調(diào)配相比，愛格麗的降酸效果優(yōu)于媚麗。

表3 原酒和成品酒理化指標(biāo)Table 3 The physicochemical indexes of compound wines

2.2.2 復(fù)合葡萄酒有機(jī)酸分析

圖1為復(fù)合葡萄酒MLF前后有機(jī)酸組分變化情況，可以看出，各酒樣的有機(jī)酸組分存在顯著性差異。酒樣在經(jīng)過MLF后，乙酸含量沒有一致的變化趨勢，而草酸、酒石酸、乳酸含量基本呈增加趨勢，蘋果酸、琥珀酸含量基本呈減少趨勢，但也有例外，如E3的草酸含量在MLF后減少，GN的酒石酸含量在MLF后減少，E3和M3的琥珀酸含量在MLF后增加。

圖1 復(fù)合葡萄酒MLF前后有機(jī)酸組分變化Fig.1 Changes of organic acid before and after MLF in compound wines注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。下同。

未經(jīng)MLF時，GN的草酸、酒石酸、蘋果酸含量均顯著高于其他酒樣，但琥珀酸含量最低；M3的酒石酸含量最低，但琥珀酸含量最高；且乳酸均未檢測到。經(jīng)過MLF后，各酒樣的有機(jī)酸組分有所變化，但蘋果酸均未檢測到。未經(jīng)MLF的E1中乙酸含量最高；很多酒樣中未檢測到乙酸；所有酒樣中均未檢測到檸檬酸。同時，還檢測了愛格麗和媚麗單品種葡萄酒的有機(jī)酸組分，愛格麗干白葡萄酒和媚麗干紅葡萄酒的有機(jī)酸均為草酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸，但含量有所不同。以上結(jié)果可以說明，MLF將酒樣中的蘋果酸全部轉(zhuǎn)化為乳酸；MLF和調(diào)配2種方式都改變了復(fù)合葡萄酒中有機(jī)酸的含量和種類，從而有效解決了公釀一號葡萄酒的酸高問題。就降酸幅度來看，隨著復(fù)合葡萄酒中公釀一號占比的下降，草酸、蘋果酸含量逐漸降低，酒石酸、琥珀酸、乳酸、乙酸沒有一致的變化規(guī)律。用愛格麗調(diào)配的葡萄酒中草酸含量低于用媚麗調(diào)配的葡萄酒，但酒石酸、蘋果酸、乳酸含量更高。因此不同調(diào)配比例和品種對公釀一號葡萄酒降酸的影響不同。結(jié)果還表明，調(diào)配后的復(fù)合葡萄酒的有機(jī)酸含量和種類并不是單品種葡萄酒有機(jī)酸含量和種類的簡單疊加，而是經(jīng)過了復(fù)雜變化。

2.2.3 復(fù)合葡萄酒酚類物質(zhì)分析

圖2為復(fù)合葡萄酒成品酒中的多酚類物質(zhì)的含量。結(jié)果表明，除單寧外，其余4種酚類物質(zhì)的含量在7種復(fù)合葡萄酒中存在顯著性差異。

圖2 復(fù)合葡萄酒多酚類物質(zhì)含量Fig.2 Polyphenols contents in compound wines

GN的總酚、花色苷、類黃酮、黃烷-3-醇含量最高，M2的單寧含量最高，E3的總酚、花色苷、類黃酮、黃烷-3-醇含量最低，E1的單寧含量最低。隨著復(fù)合葡萄酒中公釀一號占比的下降，總酚、花色苷、類黃酮含量均呈下降趨勢，使用愛格麗調(diào)配的復(fù)合葡萄酒的黃烷-3-醇含量也呈下降趨勢，但使用媚麗調(diào)配的復(fù)合葡萄酒的黃烷-3-醇含量呈上升趨勢。同時，使用媚麗調(diào)配的復(fù)合葡萄酒的多酚類物質(zhì)含量基本都高于使用愛格麗調(diào)配的復(fù)合葡萄酒，這是由于紅葡萄品種中的酚類物質(zhì)含量高于白葡萄品種。

由表4可知，7個復(fù)合葡萄酒酒樣中共檢測到13種單體酚，其含量具有顯著性差異。E3中檢測出的單體酚種類最多(10種)，M3中檢測出的最少(5種)。7個酒樣中均可檢測到?jīng)]食子酸、安息香酸、蘆丁、槲皮素這4種單體酚，其中沒食子酸和安息香酸是最主要的酚酸類單體酚，蘆丁和槲皮素是主要的類黃酮類單體酚。在7個酒樣中，M1的酚酸類單體酚含量最高，M3的酚酸類單體酚含量最低，但類黃酮類單體酚含量最高，E3的類黃酮類單體酚含量最低。與GN相比，調(diào)配后的復(fù)合葡萄酒中增加了原本沒有的丁香酸、香草酸、對香豆酸、桑色素、桔皮素。隨著復(fù)合葡萄酒中公釀一號占比的下降，沒食子酸含量、對羥基安息香酸、芪類單體酚以及檢測到的單體酚總含量均呈下降趨勢。也有一些單體酚含量在用愛格麗和媚麗調(diào)配的復(fù)合葡萄酒中呈現(xiàn)不同的趨勢，如隨著公釀一號占比的下降，槲皮素的含量和類黃酮類單體酚的總量在用愛格麗調(diào)配的復(fù)合葡萄酒中呈下降趨勢，但在用媚麗調(diào)配的復(fù)合葡萄酒中呈上升趨勢。同時，用愛格麗調(diào)配的復(fù)合葡萄酒中的沒食子酸、安息香酸、槲皮素、蘆丁含量明顯低于用媚麗調(diào)配的復(fù)合葡萄酒，且僅在媚麗調(diào)配的復(fù)合葡萄酒中檢測到了香草酸、兒茶素和桔皮素，但用愛格麗調(diào)配的復(fù)合葡萄酒中的咖啡酸含量卻更高，且僅在愛格麗調(diào)配的復(fù)合葡萄酒中檢測到了水楊酸和對香豆酸。以上結(jié)果說明，調(diào)配改變了GN葡萄酒中的單體酚含量和種類，而且不同的調(diào)配比例和葡萄品種帶來的改變也不同，紅葡萄品種的單體酚總量高于白葡萄品種。

表4 復(fù)合葡萄酒單體酚含量Table 4 Individual phenols of compound wines

2.2.4 復(fù)合葡萄酒感官品評分析

圖3為復(fù)合葡萄酒的感官品評分析結(jié)果，為縮小不同指標(biāo)間的差異，將感官品評數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，使各指標(biāo)的分值在0～1之間。從圖3可以看出，E3在香氣質(zhì)量、口感濃郁度和口感質(zhì)量的得分均高于其他酒樣；M3在香氣濃郁度和整體平衡的得分最高，香氣質(zhì)量、口感濃郁度和口感質(zhì)量的得分也僅次于E3，但外觀的得分較低，可能是由于未澄清完全。隨著復(fù)合葡萄酒中公釀一號占比的下降，香氣濃郁度和質(zhì)量、口感濃郁度和質(zhì)量、整體平衡方面的得分均呈升高的趨勢，而在相同比例下，用愛格麗和媚麗調(diào)配的復(fù)合葡萄酒的各項指標(biāo)之間的差異不大。因此，調(diào)配為公釀一號葡萄酒增添了香氣和口感的復(fù)雜度和濃郁度。

圖3 復(fù)合葡萄酒感官品評的定量描述分析Fig.3 Quantitative descriptive analysis (QDA) of sensory evaluation of compound wines

3 結(jié)論

公釀一號葡萄中的有機(jī)酸主要為酒石酸和蘋果酸，草酸、檸檬酸、琥珀酸和乳酸含量較少。使用愛格麗和媚麗對公釀一號葡萄酒進(jìn)行調(diào)配和蘋果酸-乳酸發(fā)酵2種方式均有效解決了公釀一號葡萄酒的高酸問題，且當(dāng)調(diào)配比例為3∶1(愛格麗或媚麗：公釀一號，體積比)時，復(fù)合葡萄酒的總酸最低、pH最高，有機(jī)酸含量最低，感官品評得分也最高。但同時由于愛格麗和媚麗葡萄果皮顏色較淺，酚類物質(zhì)含量較低，所以調(diào)配降低了公釀一號葡萄酒的中的酚類物質(zhì)含量。試驗表明改變公釀一號復(fù)合葡萄酒的原料及配比可顯著影響復(fù)合葡萄酒的各理化及多酚類指標(biāo)含量，這為解決公釀一號葡萄酒的高酸問題及確定公釀一號復(fù)合葡萄酒的最佳原料及配比提供了一定的理論依據(jù)。