吳林生，施洪亮，尚興榮

合肥師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（合肥 230601）

樹莓又稱山莓、覆盆子、托盤等，是一種多年生落葉灌木果樹，其產(chǎn)量高，抗高寒，適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)土壤及環(huán)境條件要求低，易于栽培。果實(shí)為漿果，柔嫩多汁，風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，被賦予“水果之王”“黃金漿果”的美稱[1]。樹莓果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)豐富，其中含有大量的維生素及十幾種氨基酸，其中的主要有機(jī)酸為檸檬酸和蘋果酸[2]。此外樹莓含有豐富的Fe、Zn等礦物質(zhì)元素，還富含花青素、揮發(fā)油、花青素、酚酸、萜類等營(yíng)養(yǎng)成分[3]，還具有預(yù)防和緩解心腦血管疾病的功效。樹莓可被直接應(yīng)用于各種食品加工業(yè)，如加工成果汁、果醬、果酒及凍干果等，還可被開發(fā)應(yīng)用于醫(yī)藥、美容、染料等多個(gè)領(lǐng)域。中國(guó)在全球范圍內(nèi)成為樹莓產(chǎn)品生產(chǎn)和消費(fèi)的大國(guó)，并且對(duì)全球樹莓消費(fèi)市場(chǎng)產(chǎn)生巨大影響[4]。隨著樹莓的產(chǎn)量不斷增加，樹莓加工品越來越受消費(fèi)者青睞，但因?yàn)闃漭陨淼乃岫冗^高，所以擁有一種能夠?qū)漭七M(jìn)行降酸且能夠加工出優(yōu)質(zhì)樹莓酒的方法勢(shì)在必行。因此，試驗(yàn)充分利用樹莓的高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，研究樹莓酒的降酸工藝及對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，得到制備高品質(zhì)樹莓酒的降酸工藝。果酒降酸的方法大多是物理降酸法和化學(xué)降酸法，但這2種方法對(duì)蘋果酸不起作用，而蘋果酸在果酒有機(jī)酸中含量又較高，除此之外這2種方法對(duì)果酒品質(zhì)的影響也較大。為避免上述問題，采取生物降酸方法——蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）法[5]，通過在樹莓酒發(fā)酵過程中接種乳酸菌凍干粉，將其中的蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸。

國(guó)內(nèi)對(duì)果酒的生物降酸研究起步較晚，但已取得諸多進(jìn)展，如張春暉等[6]對(duì)葡萄酒進(jìn)行MLF降酸；王治同[7]利用裂殖酵母進(jìn)行生物降酸，釀造全汁越桔干型酒，降酸效果可觀。國(guó)內(nèi)外在果酒的釀造工業(yè)上，果酒降酸的方法逐漸從原本的物理、化學(xué)降酸法向生物降酸法轉(zhuǎn)變，如可以進(jìn)行MLF的乳酸菌[8]。關(guān)于對(duì)果酒進(jìn)行生物降酸這一方面的研究在國(guó)外開展較早，早在18世紀(jì)國(guó)外就大量生產(chǎn)樹莓加工品。在釀造生產(chǎn)紅葡萄酒的過程中利用MLF進(jìn)行生物降酸[9]。該降酸方法是在乳酸菌作用下，以誘導(dǎo)酶也就是蘋果酸-乳酸酶的催化作用將樹莓酒酒中的L-蘋果酸分解為L(zhǎng)-乳酸，并釋放出CO2過程[10-11]。進(jìn)行MLF的方法有2種，分別是自然誘導(dǎo)與人工接種[12-13]。自然誘導(dǎo)即提供啟動(dòng)MLF所需要的適宜條件，讓反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行，這其中合適的pH、低濃度SO2、適宜的溫度為主要因素。但即便提供這些反應(yīng)條件，MLF的啟動(dòng)也非常困難。所以人工接種乳酸菌的方法成為工業(yè)降酸中的常用途徑，相比較自然誘導(dǎo)MLF，人工接種誘導(dǎo)MLF克服發(fā)酵周期長(zhǎng)、發(fā)酵不易控制、對(duì)環(huán)境條件要求高及對(duì)酒質(zhì)可能有負(fù)面影響等方面的不足[14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓（安徽省藍(lán)莓工程中心）；果酒酵母、果膠酶、乳酸菌凍干粉（上海鼎唐貿(mào)易有限公司）；偏重亞硫酸鉀（國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司）；白砂糖（市售，食品級(jí)）。

1.2 儀器與設(shè)備

發(fā)酵罐（武漢精享達(dá)機(jī)械設(shè)備有限公司）；溫度傳感器（PT100，杭州晨奕儀器儀表有限公司）；pH傳感器（JY-PH2.0，廣州佳儀精密儀器有限公司）；糖度傳感器（HEEYII，杭州恒儀儀表科技有限公司）；酒精濃度計(jì)（AR-120ET，深圳市拓宏達(dá)科技有限公司）；聲光報(bào)警器（HAX-B02485，杭興智能科技有限公司）；攝像頭（1201D-I3，杭州海康威視數(shù)字技術(shù)股份有限公司）；網(wǎng)絡(luò)IO控制器（USRIO808，山東有人信息技術(shù)有限公司）；云端服務(wù)器（ECS-G5，阿里云云計(jì)算有限公司）；計(jì)算機(jī)（天逸510Pro，聯(lián)想集團(tuán)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樹莓酒發(fā)酵工藝流程

1.3.1.1 工藝流程

冷凍樹莓→解凍→破碎→加入果膠酶→接種酵母菌→調(diào)糖→主發(fā)酵→皮渣分離→理化指標(biāo)檢測(cè)→降酸處理（生物、化學(xué)以及物理降酸）→理化指標(biāo)測(cè)定

1.3.1.2 流程要點(diǎn)

原料預(yù)處理。常溫下將冷凍的樹莓解凍，破碎。

果膠酶的添加。添加果膠酶能夠提高樹莓酒的出汁率，試驗(yàn)果膠酶添加量50 mg/L，并且在30 ℃條件下酶解2 h。

調(diào)糖。樹莓打漿后，通過蒽酮比色法對(duì)其糖濃度進(jìn)行檢測(cè)，殘?zhí)橇繎?yīng)低于4 g/L。

主發(fā)酵。26 ℃下發(fā)酵5 d。

皮渣分離與澄清。取洗凈并且滅菌的紗布（3層），將發(fā)酵后的樹莓酒連同殘?jiān)黄鸬谷爰啿贾羞^濾到新的發(fā)酵罐中。

蘋果酸-乳酸發(fā)酵。樹莓酒酸度18.65 g/L、總殘?zhí)橇?.3 g/L、花青素質(zhì)量濃度267.29 mg/L、酒精度15.8%vol，添加乳酸菌凍干粉，對(duì)樹莓酒進(jìn)行生物降酸。

化學(xué)降酸。取300 mL樹莓酒樣分裝至6個(gè)三角瓶中備用，分別向其中加入CaCO3、KHCO3、CaCO3·KHCO3聯(lián)合降酸，K2C4H4O6、KHCO3與K2C4H4O6聯(lián)合降酸，以及復(fù)鹽法降酸。重復(fù)3次上述步驟，測(cè)得的樹莓酒酸度前后變化取平均值，以減少誤差。

物理降酸。1）低溫冷凍法，主要是利用冷凍設(shè)備對(duì)樹莓酒進(jìn)行降溫，使酒體中的酒石酸鹽類結(jié)晶沉淀，從而達(dá)到降酸的目的，通?？梢越档退岫?.5～2.0 g/L不等（以酒石酸計(jì)）。2）稀釋法降酸，采用稀釋法降酸對(duì)樹莓酒進(jìn)行處理，在每100 mL樹莓果汁中分別按不同比例添加白砂糖，用玻璃棒攪拌均勻后監(jiān)測(cè)pH和酸度的變化。

生物降酸。利用微生物分解酸，從而達(dá)到降酸目的。降酸微生物根據(jù)產(chǎn)物的不同大體可分2種，一是將原有的酸分解成乙醇和二氧化碳，二是將原有的酸分解成更弱的酸和二氧化碳，而被降低的酸主要是蘋果酸。

1.3.2 單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)

選擇乳酸菌接種量、降酸溫度、降酸時(shí)間為樹莓酒降酸工藝優(yōu)化試驗(yàn)的單因素，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，每種因素水平的設(shè)計(jì)見表2，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

表1 單因素試驗(yàn)

表2 正交試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)

1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定方法

樹莓酒理化指標(biāo)檢測(cè)[15-20]：總酸濃度測(cè)定采用酸堿滴定法；殘?zhí)橇繙y(cè)定采用斐林試劑滴定法；花青素質(zhì)量濃度測(cè)定采用pH示差法；酒精度測(cè)定采用酒精計(jì)法。

感官評(píng)價(jià)：隨機(jī)選取20名學(xué)生（男女各10名）通過眼、口、鼻等感覺器官對(duì)試驗(yàn)中釀造的樹莓酒中進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，主要針對(duì)樹莓酒的色澤、香氣、滋味及其典型風(fēng)味等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，設(shè)定評(píng)定滿分100分，具體標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 樹莓酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 MLF（蘋果酸-乳酸發(fā)酵）降酸單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 不同乳酸菌接種量的試驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌接種量6%，降酸溫度22 ℃時(shí)，根據(jù)不同的降酸時(shí)間，各理化指標(biāo)的變化如表4和圖1所示。分析可得，乳酸菌接種量在4%～8%內(nèi)逐漸增大時(shí)，樹莓酒酸度會(huì)隨之逐漸降低，乳酸菌接種量8%時(shí)，樹莓果酒的酸度達(dá)最小值11.6 g/L；但乳酸菌接種量大于8%時(shí)，樹莓酒酸度會(huì)隨之增加而升高，可能是因?yàn)槿樗峋臃N量過高，對(duì)蘋果酸-乳酸的轉(zhuǎn)換起到負(fù)反饋?zhàn)饔?，揮發(fā)酸含量減小，降酸效果反而較差；故乳酸菌接種量8%時(shí)，其對(duì)樹莓酒的降酸效果最好；乳酸菌接種量10%時(shí)，樹莓果酒的色澤紅艷，口感香醇，酒香味濃且酒體穩(wěn)定；乳酸菌接種量對(duì)殘?zhí)橇?、酒精度及花青素含量的影響較小。

表4 不同乳酸菌接種量對(duì)殘?zhí)橇?、酒精度、感官評(píng)價(jià)及花青素的影響

圖1 乳酸菌接種量對(duì)酸度的影響

2.1.2 不同降酸時(shí)間的試驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌接種量6%、降酸溫度22 ℃時(shí)，根據(jù)不同的降酸時(shí)間，各理化指標(biāo)的變化如表5和圖2所示。分析可得，降酸時(shí)間2～5 d時(shí)，隨著降酸時(shí)間增加，酸度會(huì)隨之降低，降酸時(shí)間5 d時(shí)，酸度達(dá)最小值12.7 g/L；但降酸時(shí)間大于5 d時(shí)，酸度會(huì)隨之增加而升高，可能是因?yàn)榻邓釙r(shí)間增大后，一部分乳酸又轉(zhuǎn)化成蘋果酸；故降酸時(shí)間5 d時(shí)，降酸效果最好；降酸時(shí)間5 d時(shí)，果酒的色澤紅艷，口感香醇，酒香味濃且酒體穩(wěn)定，可能因?yàn)樗岫茸畹颓疑珴上銡舛驾^佳；殘?zhí)橇繒?huì)隨著降酸時(shí)間增加逐漸降低最終趨于4 g/L，相應(yīng)的酒精度隨之增加，最終趨于12.5%vol；花青素質(zhì)量濃度也會(huì)隨著降酸時(shí)間增長(zhǎng)而逐漸降低。

表5 不同降酸時(shí)間對(duì)殘?zhí)橇?、酒精度、感官評(píng)價(jià)及花青素的影響

圖2 降酸時(shí)間對(duì)酸度的影響

2.1.3 不同溫度的試驗(yàn)結(jié)果

降酸時(shí)間4 d、乳酸菌接種量6%時(shí)，隨著溫度的不同，各理化指標(biāo)的變化如表6和圖3所示。分析可得，降酸溫度18～24 ℃時(shí)，酸度會(huì)隨著降酸溫度增加而逐漸降低，降酸溫度24 ℃時(shí)，果酒的酸度達(dá)最小值12.8 g/L，降酸溫度大于24 ℃時(shí)，酸度會(huì)隨之增加而升高，可能是溫度過高時(shí)，其對(duì)蘋果酸-乳酸的轉(zhuǎn)換存在影響，使得降酸效果變差。故降酸溫度24 ℃時(shí)，降酸效果最佳，果酒的色澤紅艷，口感香醇，酒香味濃且酒體穩(wěn)定；殘?zhí)橇繒?huì)隨著降酸溫度的上升而逐漸降低并最終趨于4 g/L，酒精度則大約穩(wěn)定在12%vol；花青素質(zhì)量濃度則會(huì)隨著降酸溫度增加而逐漸降低，降低趨勢(shì)較為緩慢。

表6 降酸溫度對(duì)殘?zhí)橇俊⒕凭?、感官評(píng)價(jià)及花青素的影響

圖3 降酸溫度對(duì)酸度的影響

2.2 MLF（蘋果酸-乳酸發(fā)酵法）正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表9 方差分析表

由表7和表8可得，RB＞RC＞RA；FB＞F0.05，則p＜0.05，說明降酸時(shí)間對(duì)樹莓酒的色澤、口感以及品質(zhì)的影響達(dá)到顯著水平；FC＞F0.1，則p＞0.1，說明乳酸菌接種量對(duì)樹莓酒的色澤、口感及品質(zhì)有一定影響。因此，在各個(gè)影響因素中對(duì)樹莓酒色澤、口感及品質(zhì)的影響程度依次是降酸時(shí)間、乳酸菌接種量、降酸溫度，這與正交試驗(yàn)分析的結(jié)果一致。

表7 正交試驗(yàn)水平

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

通過化學(xué)降酸法、物理降酸法和生物降酸法3種降酸方法，考察這3種方法對(duì)干紅樹莓酒理化指標(biāo)（糖度、酸度、酒精度、干浸出物）、色度、香氣、口感及穩(wěn)定性的影響，篩選出適合干紅樹莓酒最佳降酸方法及最優(yōu)降酸工藝。在對(duì)其進(jìn)行生物降酸，采取生物降酸法——蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）法，降酸菌種為乳酸菌，通過在樹莓酒發(fā)酵過程中接種乳酸菌凍干粉，將其中的蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸，分別研究乳酸菌接種量、降酸時(shí)間及降酸溫度3個(gè)因素對(duì)樹莓干酒進(jìn)行生物降酸的影響，以所得樹莓干酒對(duì)比原始樹莓干酒的酸度、殘?zhí)橇?、酒精度、花青素含量及?duì)二者的色澤、氣味及滋味進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。通過試驗(yàn)研究?jī)?yōu)化樹莓酒降酸工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最佳的降酸條件為乳酸菌接種量8%、降酸溫度24 ℃、降酸時(shí)間5 d。所得樹莓酒酸度11.6 g/L，殘?zhí)橇?.4 g/L，酒精度11.2%vol，花青素質(zhì)量濃度165.22 mg/L，呈玫瑰紅色，口感香醇，酒香味濃且酒體穩(wěn)定。

在生物降酸的過程中，仍存在有待解決的問題，如采用先發(fā)酵后降酸的方法，雖然能夠得到更好的降酸效果和精準(zhǔn)數(shù)據(jù)，但對(duì)樹莓酒的品質(zhì)有一些影響；如果采用先降酸后發(fā)酵的方法，在一定程度上可以提高樹莓酒質(zhì)量，但因?yàn)槠湓诳諝庵虚L(zhǎng)時(shí)間暴露，可能會(huì)造成酒體被污染，對(duì)樹莓酒各項(xiàng)理化指標(biāo)的分析存在一定影響。上述問題有待后續(xù)深入研究加以解決。