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        常壓中溫下水稻秸稈預(yù)處理及酶解研究

        2020-01-13 11:34:54白光劍馬一凡鄒偉
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年23期
        關(guān)鍵詞:產(chǎn)糖量纖維素預(yù)處理

        白光劍,馬一凡,鄒偉*

        1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院,四川 宜賓,644005) 2(濃香型白酒資源微生物與大數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)室,四川 宜賓,644005)

        木質(zhì)纖維素是地球上最為豐富的有機(jī)資源,每年生物圈中可產(chǎn)生大約850億t,人類僅利用了4.8%[1]。木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)獨(dú)特,是植物經(jīng)億萬年自然選擇的結(jié)果,微生物很難快速、直接的將其降解轉(zhuǎn)化,對(duì)于生物質(zhì)資源開發(fā)利用是一大難題。大部分的木質(zhì)纖維素都需要先經(jīng)過一定的預(yù)處理才能被微生物快速利用,預(yù)處理是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素高值轉(zhuǎn)化的重要過程。美國國家研究委員會(huì)認(rèn)為好的預(yù)處理是不需要減小生物質(zhì)的粒度,保留半纖維素組分,降低抑制發(fā)酵產(chǎn)物的形成,使能耗和成本最低等[2]。中國科學(xué)院過程工程研究院陳洪章等指出:理想的預(yù)處理應(yīng)該集中在木質(zhì)素的去除,以保持細(xì)胞壁中結(jié)構(gòu)多糖的完整性,以實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)的全利用;同時(shí),希望預(yù)處理過程在“常壓”下進(jìn)行,并且使用最小的預(yù)處理能耗、價(jià)格低廉的預(yù)處理化學(xué)品和盡可能少的用量[3-4]。

        水稻秸稈作為世界三大農(nóng)作物秸稈之一,全世界2016年水稻秸稈產(chǎn)量約在12.67億t,其中中國約2.28億[5]t。水稻秸稈結(jié)構(gòu)獨(dú)特,生物質(zhì)頑抗性[6]很強(qiáng),結(jié)晶度高,難以直接利用[7],導(dǎo)致大量的秸稈資源被白白浪費(fèi),其資源化的高效利用具有重要意義,水稻秸稈生物煉制是一個(gè)重要的方向。但未經(jīng)過預(yù)處理的水稻秸稈難以被微生物利用,因此需要高效的水稻秸稈預(yù)處理技術(shù)。

        根據(jù)木質(zhì)纖維素預(yù)處理的相關(guān)研究報(bào)道,化學(xué)處理是生產(chǎn)中最常用的、適于大規(guī)模推廣的預(yù)處理方式。但許多研究為高溫高壓高濃度的預(yù)處理技術(shù),對(duì)于水稻秸稈的常壓中溫低濃度的預(yù)處理技術(shù)研究較少。本研究探究常壓中溫低濃度下的、不減小生物質(zhì)粒度的堿預(yù)處理方法,旨在為溫和的水稻秸稈預(yù)處理技術(shù)提供相應(yīng)的研究探索,為水稻秸稈的相關(guān)生物煉制奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        秸稈來自江蘇宿遷某農(nóng)田,用鍘刀鍘成1~2 cm的小段,烘干用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.2 主要試劑與儀器

        QYC-2102搖床,上海滬奧明科學(xué)儀器有限公司;MJ-250恒溫培養(yǎng)箱,四川蜀科儀器有限公司;TG-16醫(yī)用離心機(jī),四川蜀科儀器有限公司;V-1000可見分光光度,翱藝儀器有限公司;HH-6D數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州普天儀器制造;VEGA 3SBU掃描電子顯微鏡,捷克TESCAN公司;Nicolet 6700 FTIR傅立葉變換紅外光譜儀,美國Thermo Scientific公司。

        里氏木霉CICC 41027,中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;纖維素酶C8270,北京Solarbio。

        纖維素酶液:稱取 0.200 0 g纖維素酶,溶于pH 4.8 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中,并用此緩沖液定容至100 mL,濃度為2 mg/mL。測(cè)得此酶液CMC酶活[8]為0.82 IU/mL,濾紙酶活(filter paper activing, FPA)為0.38 IU/mL,β-葡萄糖苷酶活為0.38 IU/mL。酶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

        里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)基:預(yù)處理秸稈(未處理秸稈)20 g,蛋白胨1 g,(NH4)2SO42 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO22 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g,吐溫-80 1 mL,H2O 1 000 ml,調(diào)節(jié)pH 5.5~6.0。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 預(yù)處理

        實(shí)驗(yàn)流程:水稻秸稈→切段(1~2 cm)→烘干→不同條件下處理→水洗→烘干→酶解→計(jì)算產(chǎn)糖量

        預(yù)處理:準(zhǔn)確稱取20 g烘干秸稈,裝于抗腐蝕的濾袋(M0)中,記錄秸稈和濾袋總重M1,裝于500 mL廣口瓶中,浸沒于不同的處理液中,固液比1∶10(g∶mL),用保鮮膜套在瓶塞前防止腐蝕,置于對(duì)應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱中(加溫度計(jì)校正),每12 h翻動(dòng)一次。浸泡處理結(jié)束后,水洗至中性,70 ℃烘干36 h,待用,記錄總重量M2。

        2.1.1 不同試劑處理秸稈

        根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)參考,選擇NaOH、Ca(OH)2、亞硫酸鈉、尿素、稀硫酸配制成相應(yīng)濃度稀溶液,固液比為1∶10(g∶mL),將秸稈浸沒其中,于50 ℃下處理36 h,水洗、烘干、酶解。

        2.1.2 預(yù)處理溫度

        選擇2.1.1中效果最好試劑NaOH進(jìn)行溫度單因素實(shí)驗(yàn),將處理溫度設(shè)置為20、30、40、50、60 ℃,固液比1∶10,質(zhì)量濃度1 g/dL,處理36 h,水洗、烘干、酶解。

        2.1.3 不同時(shí)間

        在NaOH質(zhì)量濃度1 g/dL,溫度50 ℃,固液比1∶10的條件下,選擇不同浸泡時(shí)間,6、16、24、36、48、72 h,水洗、烘干、酶解。

        2.1.4 不同濃度

        在溫度50 ℃,處理時(shí)間48 h,固液比1∶10的條件下,選擇不同質(zhì)量濃度的NaOH溶液,0、0.4、0.8、1、1.2、1.4、1.6、2 g/dL,水洗、烘干、酶解。

        2.1.5 響應(yīng)面

        以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)原理,以初始秸稈比產(chǎn)糖量為響應(yīng)值,分析NaOH預(yù)處理秸稈過程中溫度、時(shí)間、NaOH濃度3個(gè)因素對(duì)秸稈酶解產(chǎn)糖的影響。

        表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

        2.3 酶解

        準(zhǔn)確稱取0.500 0 g預(yù)處理烘干至恒重的秸稈,置于150 mL錐形瓶中,加45 mL檸檬酸緩沖液(0.05 mol/L, pH 4.8),加5 mL配制好的標(biāo)準(zhǔn)酶液,將錐形瓶封口后置于恒溫?fù)u床,50 ℃,80 r/min,酶解72 h,取樣測(cè)還原糖[9]。

        取酶解液5 mL于離心管中,8 000 r/min,離心5 min,取上清液用DNS法測(cè)還原糖含量[10],計(jì)算產(chǎn)糖量。

        預(yù)處理后秸稈保留量(g/g):預(yù)處理過程中會(huì)有木質(zhì)素、纖維素、半纖維素、脂肪等物質(zhì)的流失,處理強(qiáng)度越大秸稈質(zhì)量流失越嚴(yán)重,通過對(duì)預(yù)處理前后質(zhì)量的檢測(cè),計(jì)算出單位初始秸稈經(jīng)過預(yù)處理后剩余質(zhì)量,作為對(duì)預(yù)處理的評(píng)估指標(biāo)之一。

        (1)

        預(yù)處理秸稈酶解產(chǎn)糖量(g/g):對(duì)預(yù)處理后的秸稈用標(biāo)準(zhǔn)酶液在適宜的酶解條件下酶解,使纖維素、半纖維素變成還原糖,測(cè)單位預(yù)處理秸稈在相同酶解條件下還原糖的產(chǎn)量,產(chǎn)糖量越多說明其預(yù)處理效果越好,更利于秸稈纖維素的分解轉(zhuǎn)化。

        預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量(g/g)=

        (2)

        初始秸稈比產(chǎn)糖量(g/g):在一定的預(yù)處理強(qiáng)度范圍內(nèi),預(yù)處理后的單位秸稈酶解產(chǎn)糖量隨著預(yù)處理強(qiáng)度增加,對(duì)秸稈結(jié)構(gòu)的破壞程度越強(qiáng),其酶解產(chǎn)糖量也越高,但同時(shí)預(yù)處理造成的秸稈質(zhì)量損失也越多,因此引入單位初始秸稈經(jīng)過預(yù)處理和酶解后的產(chǎn)糖量作為預(yù)處理的綜合評(píng)估指標(biāo)。

        初始秸稈比產(chǎn)糖量(g/g)=預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量(g/g)×預(yù)處理秸稈保留率

        (3)

        2.4 電鏡掃描

        取未處理和預(yù)處理的水稻秸稈,制片、噴金,用電子掃描顯微鏡觀察樣品微觀結(jié)構(gòu),比較結(jié)構(gòu)變化。

        2.5 紅外光譜分析

        取未預(yù)處理和預(yù)處理的水稻秸稈,粉碎為40目粉末,進(jìn)行紅外光譜分析,掃描波數(shù)范圍為4 000~500 cm-1,比較預(yù)處理前后秸稈結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)的變化。

        2.6 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶初試

        以秸稈為唯一碳源,分別取預(yù)處理和未處理秸稈2 g,配制液態(tài)培養(yǎng)基,于250 mL錐形瓶裝液100 mL接種5 mL里氏木霉種子液,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d,測(cè)發(fā)酵液中的還原糖和FPA酶活[10]。

        2.7 統(tǒng)計(jì)分析

        采用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)初步處理,再用Design Expert 8.0處理數(shù)據(jù),Origin8.5作圖,試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

        3 結(jié)果

        3.1 預(yù)處理結(jié)果

        3.1.1 不同試劑

        根據(jù)秸稈類原料預(yù)處理的相關(guān)文獻(xiàn)[11-12],選擇NaOH、Ca(OH)2、Na2SO3,尿素,H2SO4等幾種對(duì)秸稈預(yù)處理效果較好的化學(xué)試劑作為預(yù)處理試劑[13],在預(yù)設(shè)的較溫和預(yù)處理?xiàng)l件下比較預(yù)處理效果。由于Na2SO3、尿素、H2SO4在同類預(yù)處理研究中所用濃度較高,故本試驗(yàn)中其濃度為NaOH、Ca(OH)2的2倍。由圖1可知,從秸稈保留量來看,在實(shí)驗(yàn)條件下,NaOH、Ca(OH)2、H2SO4三種試劑處理明顯對(duì)秸稈的結(jié)構(gòu)造成了影響,而Na2SO3、尿素對(duì)秸稈質(zhì)量的影響小,同時(shí)對(duì)其預(yù)處理后的秸稈質(zhì)地觀察,發(fā)現(xiàn)秸稈結(jié)構(gòu)完整,處理前后變化小。從產(chǎn)糖量來看,經(jīng)Na2SO3,尿素溶液處理后的秸稈,纖維素酶基本不能酶解,結(jié)合相關(guān)研究,說明在本試驗(yàn)所選擇的溫和條件下,Na2SO3、尿素,不適合作為處理試劑。

        圖1 不同化學(xué)試劑對(duì)預(yù)處理的影響Fig.1 Effect of different chemical reagents on pretreatment

        由圖1可知NaOH、Ca(OH)2、H2SO4三種試劑溶液對(duì)水稻秸稈有處理效果,預(yù)處理秸稈酶解產(chǎn)糖量(g/g)分別為0.329、0.228、0.092 g/g,初始秸稈比產(chǎn)糖量(g/g)分別為0.193、0.167、0.062 g/g,結(jié)合同類研究[14],Ca(OH)2對(duì)秸稈有不錯(cuò)的效果,但一般處理時(shí)間較長,而H2SO4對(duì)秸稈的處理機(jī)制是溶解半纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖[12],許多還原糖直接溶于處理液中[15],對(duì)打破秸稈結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素的去除是不如堿處理的[16]。與同類研究結(jié)果能相互印證[17],結(jié)合試驗(yàn)?zāi)康?,最終選擇NaOH作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)試劑。

        3.1.2 不同溫度的預(yù)處理

        由圖2可知在固液比1∶10,NaOH濃度1 g/dL,36 h條件下預(yù)處理,秸稈保留量隨溫度升高而減少,而同時(shí)預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量隨溫度升高而增加,說明隨著溫度升高,在處理液的作用下秸稈的結(jié)構(gòu)被破壞程度越高,秸稈更容易被纖維素酶酶解為還原糖,這符合秸稈預(yù)處理過程的理論。初始秸稈比產(chǎn)糖量隨溫度先升高后緩慢下降,在50 ℃時(shí)達(dá)到最高,而預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量仍在增加,說明隨著溫度的升高,秸稈保留量的減少與預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量增加的效能平衡開始向不利于比產(chǎn)糖量發(fā)生偏移。

        圖2 溫度對(duì)預(yù)處理的影響Fig.2 Effect of temperature on pretreatment

        3.1.3 不同時(shí)間的預(yù)處理

        由圖3可知,在NaOH 1 g/dL,溫度50 ℃,固液比1∶10(g∶mL)的條件下,預(yù)處理時(shí)間越長,秸稈保留量越少,預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量和初始秸稈比產(chǎn)糖量均隨時(shí)間先增加后減少,48 h達(dá)到最高。由圖3可知,3種評(píng)估指標(biāo)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)緩慢,說明時(shí)間因素對(duì)預(yù)處理影響較小。

        圖3 處理時(shí)間對(duì)預(yù)處理的影響Fig.3 Effect of process time on pretreatment

        3.1.4 不同濃度的預(yù)處理

        由圖4可知,在溫度50 ℃,處理時(shí)間48 h,固液比1∶10的條件下,秸稈保留量隨濃度增加而減少,預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量隨濃度先增加后趨于平穩(wěn)最后開始減少,初始秸稈比產(chǎn)糖量先增加后平穩(wěn)后減少。在蒸餾水中浸泡秸稈質(zhì)量損失約為12%,但酶解產(chǎn)還原糖量幾乎沒有,僅為0.004 g/g,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蒸餾水預(yù)處理后的秸稈,物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu)基本無變化,酶解后變化也很小,與未處理秸稈酶解效果非常接近。相較于蒸餾水,經(jīng)0.4 g/dL NaOH溶液處理后,酶解后預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量和初始秸稈比產(chǎn)糖量有明顯提升,分別為0.136 g/g和0.109 g/g。水稻秸稈結(jié)構(gòu)致密,結(jié)晶度高,頑抗性高,蒸餾水無法打破其結(jié)構(gòu),而NaOH可以切斷木質(zhì)素和碳水化合物之間的連接鍵并破壞木質(zhì)素的結(jié)構(gòu),使碳水化合物更容易受到酶的攻擊[18]。由圖4可以看出在本試驗(yàn)條件下,NaOH濃度在0~1 g/dL內(nèi)產(chǎn)糖量隨濃度增加趨勢(shì)大,在高于1 g/dL以后增長慢,并逐漸趨于平穩(wěn),至16 g/dL后開始下降。初始秸稈比產(chǎn)糖量在1 g/dL時(shí)達(dá)到最大。

        圖4 NaOH濃度對(duì)預(yù)處理的影響Fig.4 Effect of NaOH concentration on pretreatment

        3.1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)及分析

        按表2進(jìn)行回歸分析,初始秸稈比產(chǎn)糖量(R)的回歸方程:

        R=0.22+0.021A+0.004 125B+0.069C-0.012AB-0.021AC-0.006BC+0.009 3A2+0.003 825B2-0.054C2

        根據(jù)方差結(jié)果分析(表4),模型項(xiàng)極顯著(P<0.01);失擬項(xiàng)(P>0.05)不顯著。表明在試驗(yàn)參數(shù)范圍內(nèi),模型合理,可以用來推測(cè)和分析預(yù)處理試驗(yàn)結(jié)果。由表3可知,3個(gè)因素對(duì)初始秸稈比產(chǎn)糖量的影響順序?yàn)镃(濃度)>A(溫度)>B(時(shí)間),其中一次項(xiàng)A、C,交互項(xiàng)AC、二次項(xiàng)C2對(duì)響應(yīng)值極顯著(P<0.01),B(時(shí)間)在試驗(yàn)參數(shù)范圍內(nèi)對(duì)響應(yīng)值初始秸稈比產(chǎn)糖量無顯著影響(P>0.05)。

        表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and result of response surface design

        表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

        注:P<0.05(顯著,*);P<0.01(極顯著,**)。

        由圖5-A溫度和時(shí)間對(duì)預(yù)處理產(chǎn)糖交互作用圖可知,濃度一定時(shí),處理時(shí)間越短,溫度對(duì)預(yù)處理的貢獻(xiàn)越大。在同類預(yù)處理研究中也證明溫度越高所需預(yù)處理時(shí)間越短,也有研究表明高溫長時(shí)間的預(yù)處理會(huì)使秸稈中可酶解的成分流失更多,反而預(yù)處理效果不好[18]。結(jié)合圖5-B和圖5-C可知在試驗(yàn)條件下,預(yù)處理效果的對(duì)時(shí)間的響應(yīng)小于溫度和濃度的。

        A-溫度和時(shí)間;B-濃度和溫度;C-濃度和時(shí)間圖5 響應(yīng)面交互作用圖Fig.5 Contour and interaction diagrams of response surface analysis

        3.1.6 結(jié)果驗(yàn)證

        經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化,得到最適酶解的預(yù)處理?xiàng)l件參數(shù)為A(溫度) 56.7 ℃、B(時(shí)間) 29.52 h、C(濃度) 1.35%。在此條件下初始秸稈比產(chǎn)糖量最大預(yù)測(cè)值為0.256 g/g。為了便于操作,將優(yōu)化參數(shù)修正為溫度55 ℃、時(shí)間30 h、濃度1.3%。在此條件下,進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證,下初始秸稈比產(chǎn)糖量為 0.271 g/g,與預(yù)測(cè)值相比,誤差為1.06%。因此該模型能夠預(yù)測(cè)該條件下水稻秸稈預(yù)處理和初始秸稈比產(chǎn)糖量的關(guān)系。

        3.2 預(yù)處理前后結(jié)構(gòu)變化

        由圖6可知,未處理秸稈表面光滑,結(jié)構(gòu)完整,呈規(guī)則的網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu),剛性強(qiáng),不易被破壞;預(yù)處理后秸稈表面粗糙,蓬松柔軟,結(jié)構(gòu)坍塌,失去完整結(jié)構(gòu)。

        A-未處理秸稈;B-預(yù)處理后的秸稈;C-未處理秸稈掃描電鏡圖;D-預(yù)處理秸稈掃描電鏡圖圖6 未處理(左)與堿處理秸稈(右)掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrographs of untreated (left) and NaOH treated (right) straw

        結(jié)合堿處理機(jī)理,OH離子能削弱半纖維素同纖維素之間的氫鍵和木質(zhì)素分子與半纖維素之間的酯鍵,使秸稈結(jié)構(gòu)被打破,使半纖維素和木質(zhì)素溶出,使得碳水化合物更容易受到酶的攻擊,同時(shí)由于NaOH的作用,纖維素發(fā)生水化膨脹,導(dǎo)致纖維素的聚合度和結(jié)晶度有所下降,木質(zhì)素和堿抽出物等組分降解和溶出以及原料空隙發(fā)生潤脹,使原料的多孔性增加和內(nèi)比表面積的增大,改善了酶的可滲透性,從而提高了酶與纖維素的接觸面積和酶的水解速率[18]。故經(jīng)過預(yù)處理的秸稈更易于纖維素酶的吸附、酶解。

        3.3 紅外光譜分析

        由圖7可知經(jīng)過預(yù)處理后,秸稈的部分特征峰發(fā)生了明顯變化。根據(jù)木質(zhì)纖維素官能團(tuán)的特征峰所知[19-20],3 426 cm-1處代表的是O—H伸展振動(dòng),而2 922 cm-1處的峰代表的是脂肪族中CH2和CH3伸縮振動(dòng),這些與纖維素及木質(zhì)素、半纖維素中的脂肪族基團(tuán)相應(yīng);1 734 cm-1代表半纖維中的乙?;蛱侨┧狨ユI或者木質(zhì)素和半纖維素間通過阿魏酸或?qū)ο愣顾徇B接的酯鍵;1 604 cm-1代表芳香族骨架振動(dòng);1 246 cm-1代表愈創(chuàng)木基C—O;1 032 cm-1代表芳香碳?xì)滏I在平面變形。

        圖7 預(yù)處理秸稈與未預(yù)處理秸稈紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of untreated and NaOH treated straw

        這說明堿處理后,水稻秸稈外表面由長鏈脂肪酸形成的致密保護(hù)層被破壞,水稻秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素間通過化學(xué)鍵連接的晶格結(jié)構(gòu)被打破,秸稈的頑抗性降低,結(jié)晶度減弱,微生物和酶更易進(jìn)入到水稻秸稈的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中,增強(qiáng)了微生物對(duì)水稻秸稈的生物降解性能。

        3.4 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶初試

        由圖8可以看出,以未處理的水稻秸稈唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種里氏木霉后,發(fā)酵液中未見微生物生長,秸稈形態(tài)完整。與之相比,經(jīng)預(yù)處理的秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵液變成里氏木霉發(fā)酵的典型黃色,觀察發(fā)酵過程,在第2 d即可明顯看到大量里氏木霉菌體,同時(shí)觀察到秸稈段斷裂、變??;在發(fā)酵第5 d時(shí),發(fā)酵液中已看不到成形的秸稈,而未處理秸稈幾乎無變化。對(duì)圖8中兩種發(fā)酵液,取發(fā)酵液測(cè)酶活,測(cè)得預(yù)處理秸稈發(fā)酵液中FPA酶活為0.522 IU/mL,未處理秸稈發(fā)酵液中未檢測(cè)到FPA酶活。

        圖8 未處理(左)和預(yù)處理秸稈(右)接種里氏木霉發(fā)酵5 dFig.8 Untreated (left) and pretreated straw (right) were inoculated with Trichoderma reesei for 5 days

        4 討論

        水稻秸稈全球產(chǎn)量大,又需要合理利用,是重要的生物質(zhì)資源,但由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu),難以直接利用,對(duì)于水稻秸稈的生物煉制來說,預(yù)處理是必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)。通過有效的預(yù)處理改變木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu),使纖維素易被酶解轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖,進(jìn)而轉(zhuǎn)化為更多的高值產(chǎn)品。預(yù)處理是木質(zhì)纖維素生物煉制中成本最高的一步操作,通過研發(fā)、技術(shù)的改進(jìn),預(yù)處理成本的降低還有很大的空間[21]。

        通過試驗(yàn)和結(jié)合文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi),溫度、時(shí)間和濃度對(duì)水稻秸稈預(yù)處理的影響都是正向貢獻(xiàn)的,是從三個(gè)維度上的強(qiáng)度積累,且都積累于打破秸稈結(jié)構(gòu)上。在這三個(gè)因素中,時(shí)間是對(duì)另外兩個(gè)因素的完全積累作用,溫度和濃度對(duì)預(yù)處理的積累作用是既有交互又有獨(dú)立的。因此,預(yù)處理對(duì)秸稈的影響的強(qiáng)度積累必然存在“閾值”,這個(gè)閾值很難直接找到,通常間接表現(xiàn)為一些觀測(cè)值,例如秸稈的物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)、試驗(yàn)響應(yīng)值等。閾值源于整個(gè)預(yù)處理過程中所有影響因素的共同積累,因此可以表現(xiàn)成多個(gè)點(diǎn)。在試驗(yàn)過程中可以根據(jù)單因素、正交、響應(yīng)面等試驗(yàn)方法尋找這些閥值的簡(jiǎn)化表現(xiàn)點(diǎn),然后根據(jù)具體情況選擇我們需要的點(diǎn),并做出適當(dāng)優(yōu)化,得到好的預(yù)處理方案。

        本試驗(yàn)以常溫常壓低濃度,不需要減小秸稈的粒度的預(yù)處理思路出發(fā),采用單因素和響應(yīng)面法探究水稻秸稈的堿處理?xiàng)l件,以秸稈保留量(g/g),預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量(g/g)、初始秸稈比產(chǎn)糖量(g/g)為評(píng)估指標(biāo)。不同試劑的單因素實(shí)驗(yàn)顯示,NaOH對(duì)水稻秸稈的預(yù)處理效果最好,處理?xiàng)l件各因素對(duì)其影響主次為:濃度>溫度>時(shí)間,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。通過響應(yīng)面確定了最佳預(yù)處理?xiàng)l件為溫度55 ℃、時(shí)間30 h、濃度1.3%。對(duì)預(yù)處理后的水稻秸稈進(jìn)行掃描電鏡微觀結(jié)構(gòu)觀察和紅外光譜分析都表明預(yù)處理打破了水稻秸稈的一些關(guān)鍵結(jié)構(gòu),使其更容易被纖維素酶吸附、酶解。對(duì)預(yù)處理后的水稻秸稈用里氏木霉進(jìn)行發(fā)酵,里氏木霉生長良好,在發(fā)酵5 d測(cè)得FPA酶活為0.522 IU/mL,而未處理的秸稈完全不能被微生物利用。經(jīng)過預(yù)處理的水稻秸稈具有一定的生物煉制潛力,可以通過微生物發(fā)酵制備燃料乙醇、丁醇、秸稈飼料等。

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