白光劍，馬一凡，鄒偉*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓，644005) 2(濃香型白酒資源微生物與大數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓，644005)

木質(zhì)纖維素是地球上最為豐富的有機(jī)資源，每年生物圈中可產(chǎn)生大約850億t，人類僅利用了4.8%[1]。木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)獨(dú)特，是植物經(jīng)億萬年自然選擇的結(jié)果，微生物很難快速、直接的將其降解轉(zhuǎn)化，對(duì)于生物質(zhì)資源開發(fā)利用是一大難題。大部分的木質(zhì)纖維素都需要先經(jīng)過一定的預(yù)處理才能被微生物快速利用，預(yù)處理是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素高值轉(zhuǎn)化的重要過程。美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)認(rèn)為好的預(yù)處理是不需要減小生物質(zhì)的粒度，保留半纖維素組分，降低抑制發(fā)酵產(chǎn)物的形成，使能耗和成本最低等[2]。中國(guó)科學(xué)院過程工程研究院陳洪章等指出：理想的預(yù)處理應(yīng)該集中在木質(zhì)素的去除，以保持細(xì)胞壁中結(jié)構(gòu)多糖的完整性，以實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)的全利用；同時(shí)，希望預(yù)處理過程在“常壓”下進(jìn)行，并且使用最小的預(yù)處理能耗、價(jià)格低廉的預(yù)處理化學(xué)品和盡可能少的用量[3-4]。

水稻秸稈作為世界三大農(nóng)作物秸稈之一，全世界2016年水稻秸稈產(chǎn)量約在12.67億t，其中中國(guó)約2.28億[5]t。水稻秸稈結(jié)構(gòu)獨(dú)特，生物質(zhì)頑抗性[6]很強(qiáng)，結(jié)晶度高，難以直接利用[7]，導(dǎo)致大量的秸稈資源被白白浪費(fèi)，其資源化的高效利用具有重要意義，水稻秸稈生物煉制是一個(gè)重要的方向。但未經(jīng)過預(yù)處理的水稻秸稈難以被微生物利用，因此需要高效的水稻秸稈預(yù)處理技術(shù)。

根據(jù)木質(zhì)纖維素預(yù)處理的相關(guān)研究報(bào)道，化學(xué)處理是生產(chǎn)中最常用的、適于大規(guī)模推廣的預(yù)處理方式。但許多研究為高溫高壓高濃度的預(yù)處理技術(shù)，對(duì)于水稻秸稈的常壓中溫低濃度的預(yù)處理技術(shù)研究較少。本研究探究常壓中溫低濃度下的、不減小生物質(zhì)粒度的堿預(yù)處理方法，旨在為溫和的水稻秸稈預(yù)處理技術(shù)提供相應(yīng)的研究探索，為水稻秸稈的相關(guān)生物煉制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

秸稈來自江蘇宿遷某農(nóng)田，用鍘刀鍘成1～2 cm的小段，烘干用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器

QYC-2102搖床，上海滬奧明科學(xué)儀器有限公司；MJ-250恒溫培養(yǎng)箱，四川蜀科儀器有限公司；TG-16醫(yī)用離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；V-1000可見分光光度，翱藝儀器有限公司；HH-6D數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造；VEGA 3SBU掃描電子顯微鏡，捷克TESCAN公司；Nicolet 6700 FTIR傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Scientific公司。

里氏木霉CICC 41027，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；纖維素酶C8270，北京Solarbio。

纖維素酶液:稱取 0.200 0 g纖維素酶，溶于pH 4.8 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，并用此緩沖液定容至100 mL，濃度為2 mg/mL。測(cè)得此酶液CMC酶活[8]為0.82 IU/mL，濾紙酶活(filter paper activing, FPA)為0.38 IU/mL，β-葡萄糖苷酶活為0.38 IU/mL。酶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)基：預(yù)處理秸稈(未處理秸稈)20 g，蛋白胨1 g，(NH4)2SO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO22 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，吐溫-80 1 mL，H2O 1 000 ml，調(diào)節(jié)pH 5.5～6.0。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)流程：水稻秸稈→切段(1～2 cm)→烘干→不同條件下處理→水洗→烘干→酶解→計(jì)算產(chǎn)糖量

預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取20 g烘干秸稈，裝于抗腐蝕的濾袋(M0)中，記錄秸稈和濾袋總重M1，裝于500 mL廣口瓶中，浸沒于不同的處理液中，固液比1∶10(g∶mL)，用保鮮膜套在瓶塞前防止腐蝕，置于對(duì)應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱中(加溫度計(jì)校正)，每12 h翻動(dòng)一次。浸泡處理結(jié)束后，水洗至中性，70 ℃烘干36 h，待用，記錄總重量M2。

2.1.1 不同試劑處理秸稈

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)參考，選擇NaOH、Ca(OH)2、亞硫酸鈉、尿素、稀硫酸配制成相應(yīng)濃度稀溶液，固液比為1∶10(g∶mL)，將秸稈浸沒其中，于50 ℃下處理36 h，水洗、烘干、酶解。

2.1.2 預(yù)處理溫度

選擇2.1.1中效果最好試劑NaOH進(jìn)行溫度單因素實(shí)驗(yàn)，將處理溫度設(shè)置為20、30、40、50、60 ℃，固液比1∶10，質(zhì)量濃度1 g/dL，處理36 h，水洗、烘干、酶解。

2.1.3 不同時(shí)間

在NaOH質(zhì)量濃度1 g/dL，溫度50 ℃，固液比1∶10的條件下，選擇不同浸泡時(shí)間，6、16、24、36、48、72 h，水洗、烘干、酶解。

2.1.4 不同濃度

在溫度50 ℃，處理時(shí)間48 h，固液比1∶10的條件下，選擇不同質(zhì)量濃度的NaOH溶液，0、0.4、0.8、1、1.2、1.4、1.6、2 g/dL，水洗、烘干、酶解。

2.1.5 響應(yīng)面

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)原理，以初始秸稈比產(chǎn)糖量為響應(yīng)值，分析NaOH預(yù)處理秸稈過程中溫度、時(shí)間、NaOH濃度3個(gè)因素對(duì)秸稈酶解產(chǎn)糖的影響。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

2.3 酶解

準(zhǔn)確稱取0.500 0 g預(yù)處理烘干至恒重的秸稈，置于150 mL錐形瓶中，加45 mL檸檬酸緩沖液(0.05 mol/L， pH 4.8)，加5 mL配制好的標(biāo)準(zhǔn)酶液，將錐形瓶封口后置于恒溫?fù)u床，50 ℃，80 r/min，酶解72 h，取樣測(cè)還原糖[9]。

取酶解液5 mL于離心管中，8 000 r/min，離心5 min，取上清液用DNS法測(cè)還原糖含量[10]，計(jì)算產(chǎn)糖量。

預(yù)處理后秸稈保留量(g/g):預(yù)處理過程中會(huì)有木質(zhì)素、纖維素、半纖維素、脂肪等物質(zhì)的流失，處理強(qiáng)度越大秸稈質(zhì)量流失越嚴(yán)重，通過對(duì)預(yù)處理前后質(zhì)量的檢測(cè)，計(jì)算出單位初始秸稈經(jīng)過預(yù)處理后剩余質(zhì)量，作為對(duì)預(yù)處理的評(píng)估指標(biāo)之一。

(1)

預(yù)處理秸稈酶解產(chǎn)糖量(g/g):對(duì)預(yù)處理后的秸稈用標(biāo)準(zhǔn)酶液在適宜的酶解條件下酶解，使纖維素、半纖維素變成還原糖，測(cè)單位預(yù)處理秸稈在相同酶解條件下還原糖的產(chǎn)量，產(chǎn)糖量越多說明其預(yù)處理效果越好，更利于秸稈纖維素的分解轉(zhuǎn)化。

預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量(g/g)=

(2)

初始秸稈比產(chǎn)糖量(g/g):在一定的預(yù)處理強(qiáng)度范圍內(nèi)，預(yù)處理后的單位秸稈酶解產(chǎn)糖量隨著預(yù)處理強(qiáng)度增加，對(duì)秸稈結(jié)構(gòu)的破壞程度越強(qiáng)，其酶解產(chǎn)糖量也越高，但同時(shí)預(yù)處理造成的秸稈質(zhì)量損失也越多，因此引入單位初始秸稈經(jīng)過預(yù)處理和酶解后的產(chǎn)糖量作為預(yù)處理的綜合評(píng)估指標(biāo)。

初始秸稈比產(chǎn)糖量(g/g)=預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量(g/g)×預(yù)處理秸稈保留率

(3)

2.4 電鏡掃描

取未處理和預(yù)處理的水稻秸稈，制片、噴金，用電子掃描顯微鏡觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)，比較結(jié)構(gòu)變化。

2.5 紅外光譜分析

取未預(yù)處理和預(yù)處理的水稻秸稈，粉碎為40目粉末，進(jìn)行紅外光譜分析，掃描波數(shù)范圍為4 000～500 cm-1,比較預(yù)處理前后秸稈結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)的變化。

2.6 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶初試

以秸稈為唯一碳源，分別取預(yù)處理和未處理秸稈2 g，配制液態(tài)培養(yǎng)基，于250 mL錐形瓶裝液100 mL接種5 mL里氏木霉種子液，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d，測(cè)發(fā)酵液中的還原糖和FPA酶活[10]。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)初步處理，再用Design Expert 8.0處理數(shù)據(jù)，Origin8.5作圖，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

3 結(jié)果

3.1 預(yù)處理結(jié)果

3.1.1 不同試劑

根據(jù)秸稈類原料預(yù)處理的相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]，選擇NaOH、Ca(OH)2、Na2SO3，尿素，H2SO4等幾種對(duì)秸稈預(yù)處理效果較好的化學(xué)試劑作為預(yù)處理試劑[13]，在預(yù)設(shè)的較溫和預(yù)處理?xiàng)l件下比較預(yù)處理效果。由于Na2SO3、尿素、H2SO4在同類預(yù)處理研究中所用濃度較高，故本試驗(yàn)中其濃度為NaOH、Ca(OH)2的2倍。由圖1可知，從秸稈保留量來看，在實(shí)驗(yàn)條件下，NaOH、Ca(OH)2、H2SO4三種試劑處理明顯對(duì)秸稈的結(jié)構(gòu)造成了影響，而Na2SO3、尿素對(duì)秸稈質(zhì)量的影響小，同時(shí)對(duì)其預(yù)處理后的秸稈質(zhì)地觀察，發(fā)現(xiàn)秸稈結(jié)構(gòu)完整，處理前后變化小。從產(chǎn)糖量來看，經(jīng)Na2SO3，尿素溶液處理后的秸稈，纖維素酶基本不能酶解，結(jié)合相關(guān)研究，說明在本試驗(yàn)所選擇的溫和條件下，Na2SO3、尿素，不適合作為處理試劑。

圖1 不同化學(xué)試劑對(duì)預(yù)處理的影響Fig.1 Effect of different chemical reagents on pretreatment

由圖1可知NaOH、Ca(OH)2、H2SO4三種試劑溶液對(duì)水稻秸稈有處理效果，預(yù)處理秸稈酶解產(chǎn)糖量(g/g)分別為0.329、0.228、0.092 g/g，初始秸稈比產(chǎn)糖量(g/g)分別為0.193、0.167、0.062 g/g，結(jié)合同類研究[14]，Ca(OH)2對(duì)秸稈有不錯(cuò)的效果，但一般處理時(shí)間較長(zhǎng)，而H2SO4對(duì)秸稈的處理機(jī)制是溶解半纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖[12]，許多還原糖直接溶于處理液中[15]，對(duì)打破秸稈結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素的去除是不如堿處理的[16]。與同類研究結(jié)果能相互印證[17]，結(jié)合試驗(yàn)?zāi)康?，最終選擇NaOH作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)試劑。

3.1.2 不同溫度的預(yù)處理

由圖2可知在固液比1∶10，NaOH濃度1 g/dL，36 h條件下預(yù)處理，秸稈保留量隨溫度升高而減少，而同時(shí)預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量隨溫度升高而增加，說明隨著溫度升高，在處理液的作用下秸稈的結(jié)構(gòu)被破壞程度越高，秸稈更容易被纖維素酶酶解為還原糖，這符合秸稈預(yù)處理過程的理論。初始秸稈比產(chǎn)糖量隨溫度先升高后緩慢下降，在50 ℃時(shí)達(dá)到最高，而預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量仍在增加，說明隨著溫度的升高，秸稈保留量的減少與預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量增加的效能平衡開始向不利于比產(chǎn)糖量發(fā)生偏移。

圖2 溫度對(duì)預(yù)處理的影響Fig.2 Effect of temperature on pretreatment

3.1.3 不同時(shí)間的預(yù)處理

由圖3可知，在NaOH 1 g/dL，溫度50 ℃，固液比1∶10(g∶mL)的條件下，預(yù)處理時(shí)間越長(zhǎng)，秸稈保留量越少，預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量和初始秸稈比產(chǎn)糖量均隨時(shí)間先增加后減少，48 h達(dá)到最高。由圖3可知，3種評(píng)估指標(biāo)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)緩慢，說明時(shí)間因素對(duì)預(yù)處理影響較小。

圖3 處理時(shí)間對(duì)預(yù)處理的影響Fig.3 Effect of process time on pretreatment

3.1.4 不同濃度的預(yù)處理

由圖4可知，在溫度50 ℃，處理時(shí)間48 h，固液比1∶10的條件下，秸稈保留量隨濃度增加而減少，預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量隨濃度先增加后趨于平穩(wěn)最后開始減少，初始秸稈比產(chǎn)糖量先增加后平穩(wěn)后減少。在蒸餾水中浸泡秸稈質(zhì)量損失約為12%，但酶解產(chǎn)還原糖量幾乎沒有，僅為0.004 g/g，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蒸餾水預(yù)處理后的秸稈，物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu)基本無變化，酶解后變化也很小，與未處理秸稈酶解效果非常接近。相較于蒸餾水，經(jīng)0.4 g/dL NaOH溶液處理后，酶解后預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量和初始秸稈比產(chǎn)糖量有明顯提升，分別為0.136 g/g和0.109 g/g。水稻秸稈結(jié)構(gòu)致密，結(jié)晶度高，頑抗性高，蒸餾水無法打破其結(jié)構(gòu)，而NaOH可以切斷木質(zhì)素和碳水化合物之間的連接鍵并破壞木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，使碳水化合物更容易受到酶的攻擊[18]。由圖4可以看出在本試驗(yàn)條件下，NaOH濃度在0～1 g/dL內(nèi)產(chǎn)糖量隨濃度增加趨勢(shì)大，在高于1 g/dL以后增長(zhǎng)慢，并逐漸趨于平穩(wěn)，至16 g/dL后開始下降。初始秸稈比產(chǎn)糖量在1 g/dL時(shí)達(dá)到最大。

圖4 NaOH濃度對(duì)預(yù)處理的影響Fig.4 Effect of NaOH concentration on pretreatment

3.1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)及分析

按表2進(jìn)行回歸分析，初始秸稈比產(chǎn)糖量(R)的回歸方程:

R=0.22+0.021A+0.004 125B+0.069C-0.012AB-0.021AC-0.006BC+0.009 3A2+0.003 825B2-0.054C2

根據(jù)方差結(jié)果分析(表4)，模型項(xiàng)極顯著(P<0.01)；失擬項(xiàng)(P>0.05)不顯著。表明在試驗(yàn)參數(shù)范圍內(nèi)，模型合理，可以用來推測(cè)和分析預(yù)處理試驗(yàn)結(jié)果。由表3可知，3個(gè)因素對(duì)初始秸稈比產(chǎn)糖量的影響順序?yàn)镃(濃度)>A(溫度)>B(時(shí)間)，其中一次項(xiàng)A、C，交互項(xiàng)AC、二次項(xiàng)C2對(duì)響應(yīng)值極顯著(P<0.01)，B(時(shí)間)在試驗(yàn)參數(shù)范圍內(nèi)對(duì)響應(yīng)值初始秸稈比產(chǎn)糖量無顯著影響(P>0.05)。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and result of response surface design

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

注:P<0.05(顯著，*)；P<0.01(極顯著，**)。

由圖5-A溫度和時(shí)間對(duì)預(yù)處理產(chǎn)糖交互作用圖可知，濃度一定時(shí)，處理時(shí)間越短，溫度對(duì)預(yù)處理的貢獻(xiàn)越大。在同類預(yù)處理研究中也證明溫度越高所需預(yù)處理時(shí)間越短,也有研究表明高溫長(zhǎng)時(shí)間的預(yù)處理會(huì)使秸稈中可酶解的成分流失更多，反而預(yù)處理效果不好[18]。結(jié)合圖5-B和圖5-C可知在試驗(yàn)條件下，預(yù)處理效果的對(duì)時(shí)間的響應(yīng)小于溫度和濃度的。

A-溫度和時(shí)間；B-濃度和溫度；C-濃度和時(shí)間圖5 響應(yīng)面交互作用圖Fig.5 Contour and interaction diagrams of response surface analysis

3.1.6 結(jié)果驗(yàn)證

經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化，得到最適酶解的預(yù)處理?xiàng)l件參數(shù)為A(溫度) 56.7 ℃、B(時(shí)間) 29.52 h、C(濃度) 1.35%。在此條件下初始秸稈比產(chǎn)糖量最大預(yù)測(cè)值為0.256 g/g。為了便于操作，將優(yōu)化參數(shù)修正為溫度55 ℃、時(shí)間30 h、濃度1.3%。在此條件下，進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證，下初始秸稈比產(chǎn)糖量為 0.271 g/g，與預(yù)測(cè)值相比，誤差為1.06%。因此該模型能夠預(yù)測(cè)該條件下水稻秸稈預(yù)處理和初始秸稈比產(chǎn)糖量的關(guān)系。

3.2 預(yù)處理前后結(jié)構(gòu)變化

由圖6可知，未處理秸稈表面光滑，結(jié)構(gòu)完整，呈規(guī)則的網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)，剛性強(qiáng)，不易被破壞；預(yù)處理后秸稈表面粗糙，蓬松柔軟，結(jié)構(gòu)坍塌，失去完整結(jié)構(gòu)。

A-未處理秸稈；B-預(yù)處理后的秸稈；C-未處理秸稈掃描電鏡圖；D-預(yù)處理秸稈掃描電鏡圖圖6 未處理(左)與堿處理秸稈(右)掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrographs of untreated (left) and NaOH treated (right) straw

結(jié)合堿處理機(jī)理，OH離子能削弱半纖維素同纖維素之間的氫鍵和木質(zhì)素分子與半纖維素之間的酯鍵，使秸稈結(jié)構(gòu)被打破，使半纖維素和木質(zhì)素溶出，使得碳水化合物更容易受到酶的攻擊，同時(shí)由于NaOH的作用，纖維素發(fā)生水化膨脹，導(dǎo)致纖維素的聚合度和結(jié)晶度有所下降，木質(zhì)素和堿抽出物等組分降解和溶出以及原料空隙發(fā)生潤(rùn)脹，使原料的多孔性增加和內(nèi)比表面積的增大，改善了酶的可滲透性，從而提高了酶與纖維素的接觸面積和酶的水解速率[18]。故經(jīng)過預(yù)處理的秸稈更易于纖維素酶的吸附、酶解。

3.3 紅外光譜分析

由圖7可知經(jīng)過預(yù)處理后，秸稈的部分特征峰發(fā)生了明顯變化。根據(jù)木質(zhì)纖維素官能團(tuán)的特征峰所知[19-20]，3 426 cm-1處代表的是O—H伸展振動(dòng)，而2 922 cm-1處的峰代表的是脂肪族中CH2和CH3伸縮振動(dòng)，這些與纖維素及木質(zhì)素、半纖維素中的脂肪族基團(tuán)相應(yīng)；1 734 cm-1代表半纖維中的乙?；蛱侨┧狨ユI或者木質(zhì)素和半纖維素間通過阿魏酸或?qū)ο愣顾徇B接的酯鍵；1 604 cm-1代表芳香族骨架振動(dòng)；1 246 cm-1代表愈創(chuàng)木基C—O；1 032 cm-1代表芳香碳?xì)滏I在平面變形。

圖7 預(yù)處理秸稈與未預(yù)處理秸稈紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of untreated and NaOH treated straw

這說明堿處理后，水稻秸稈外表面由長(zhǎng)鏈脂肪酸形成的致密保護(hù)層被破壞，水稻秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素間通過化學(xué)鍵連接的晶格結(jié)構(gòu)被打破，秸稈的頑抗性降低，結(jié)晶度減弱，微生物和酶更易進(jìn)入到水稻秸稈的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中，增強(qiáng)了微生物對(duì)水稻秸稈的生物降解性能。

3.4 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶初試

由圖8可以看出，以未處理的水稻秸稈唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種里氏木霉后，發(fā)酵液中未見微生物生長(zhǎng)，秸稈形態(tài)完整。與之相比，經(jīng)預(yù)處理的秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵液變成里氏木霉發(fā)酵的典型黃色，觀察發(fā)酵過程，在第2 d即可明顯看到大量里氏木霉菌體，同時(shí)觀察到秸稈段斷裂、變??；在發(fā)酵第5 d時(shí)，發(fā)酵液中已看不到成形的秸稈，而未處理秸稈幾乎無變化。對(duì)圖8中兩種發(fā)酵液，取發(fā)酵液測(cè)酶活，測(cè)得預(yù)處理秸稈發(fā)酵液中FPA酶活為0.522 IU/mL，未處理秸稈發(fā)酵液中未檢測(cè)到FPA酶活。

圖8 未處理(左)和預(yù)處理秸稈(右)接種里氏木霉發(fā)酵5 dFig.8 Untreated (left) and pretreated straw (right) were inoculated with Trichoderma reesei for 5 days

4 討論

水稻秸稈全球產(chǎn)量大，又需要合理利用，是重要的生物質(zhì)資源，但由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，難以直接利用，對(duì)于水稻秸稈的生物煉制來說，預(yù)處理是必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)。通過有效的預(yù)處理改變木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，使纖維素易被酶解轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為更多的高值產(chǎn)品。預(yù)處理是木質(zhì)纖維素生物煉制中成本最高的一步操作，通過研發(fā)、技術(shù)的改進(jìn)，預(yù)處理成本的降低還有很大的空間[21]。

通過試驗(yàn)和結(jié)合文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，溫度、時(shí)間和濃度對(duì)水稻秸稈預(yù)處理的影響都是正向貢獻(xiàn)的，是從三個(gè)維度上的強(qiáng)度積累，且都積累于打破秸稈結(jié)構(gòu)上。在這三個(gè)因素中，時(shí)間是對(duì)另外兩個(gè)因素的完全積累作用，溫度和濃度對(duì)預(yù)處理的積累作用是既有交互又有獨(dú)立的。因此，預(yù)處理對(duì)秸稈的影響的強(qiáng)度積累必然存在“閾值”，這個(gè)閾值很難直接找到，通常間接表現(xiàn)為一些觀測(cè)值，例如秸稈的物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)、試驗(yàn)響應(yīng)值等。閾值源于整個(gè)預(yù)處理過程中所有影響因素的共同積累，因此可以表現(xiàn)成多個(gè)點(diǎn)。在試驗(yàn)過程中可以根據(jù)單因素、正交、響應(yīng)面等試驗(yàn)方法尋找這些閥值的簡(jiǎn)化表現(xiàn)點(diǎn)，然后根據(jù)具體情況選擇我們需要的點(diǎn)，并做出適當(dāng)優(yōu)化，得到好的預(yù)處理方案。

本試驗(yàn)以常溫常壓低濃度，不需要減小秸稈的粒度的預(yù)處理思路出發(fā)，采用單因素和響應(yīng)面法探究水稻秸稈的堿處理?xiàng)l件，以秸稈保留量(g/g)，預(yù)處理秸稈產(chǎn)糖量(g/g)、初始秸稈比產(chǎn)糖量(g/g)為評(píng)估指標(biāo)。不同試劑的單因素實(shí)驗(yàn)顯示，NaOH對(duì)水稻秸稈的預(yù)處理效果最好，處理?xiàng)l件各因素對(duì)其影響主次為:濃度>溫度>時(shí)間，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。通過響應(yīng)面確定了最佳預(yù)處理?xiàng)l件為溫度55 ℃、時(shí)間30 h、濃度1.3%。對(duì)預(yù)處理后的水稻秸稈進(jìn)行掃描電鏡微觀結(jié)構(gòu)觀察和紅外光譜分析都表明預(yù)處理打破了水稻秸稈的一些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，使其更容易被纖維素酶吸附、酶解。對(duì)預(yù)處理后的水稻秸稈用里氏木霉進(jìn)行發(fā)酵，里氏木霉生長(zhǎng)良好，在發(fā)酵5 d測(cè)得FPA酶活為0.522 IU/mL，而未處理的秸稈完全不能被微生物利用。經(jīng)過預(yù)處理的水稻秸稈具有一定的生物煉制潛力，可以通過微生物發(fā)酵制備燃料乙醇、丁醇、秸稈飼料等。