劉振民，龐佳坤，鄭遠(yuǎn)榮

1(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436)2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

人體內(nèi)細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量自由基和活性氧，而抗氧化系統(tǒng)可以有效地清除自由基。當(dāng)自由基產(chǎn)生過(guò)多或抗氧化系統(tǒng)失效時(shí)，這種平衡就會(huì)被打破，機(jī)體將處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，這種情況會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷[1]。已有研究認(rèn)為持續(xù)的氧化應(yīng)激反應(yīng)是神經(jīng)退行性疾病[2-3]、癌癥[4]、肝損傷[1]、衰老[5]、心血管疾病[6-7]、慢性胰腺炎[8]等疾病的誘因。細(xì)胞一般通過(guò)預(yù)防、修復(fù)、產(chǎn)生抗氧化劑或攝入膳食中的抗氧化劑[9-10]來(lái)保護(hù)自己免受氧化損傷。內(nèi)源性抗氧化劑包括細(xì)胞內(nèi)酶——過(guò)氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶。已知的膳食抗氧化劑包括抗壞血酸,VE,多酚類物質(zhì)和類胡蘿卜素等。

人工合成的抗氧化劑雖然具有很強(qiáng)的抗氧化活性，但在機(jī)體內(nèi)存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)，于是人們把目光轉(zhuǎn)向了天然的抗氧化劑。其中乳清蛋白因其較強(qiáng)的抗氧化活性而備受關(guān)注，乳清是在干酪和干酪素的生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品。一般10 kg牛奶可以生產(chǎn)1～3 kg干酪，排出7～9 kg乳清。而乳清蛋白是乳清的主要成分之一，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性，被廣泛的應(yīng)用于各種食品中。乳清蛋白主要由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白以及其他多種活性成分組成。其中，β-乳球蛋白、α-乳白蛋白分別約占乳清蛋白的43.6%、19.7%，氨基酸序列見圖1。乳清蛋白富含的必需支鏈氨基酸，包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，在代謝、血糖穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)功能中發(fā)揮著重要作用。乳清蛋白產(chǎn)品可以分為乳清濃縮蛋白(whey protein concentration，WPC)，乳清分離蛋白(whey protein isolates，WPI)等。乳清蛋白是制備抗氧化肽的良好來(lái)源，本文對(duì)乳清蛋白源抗氧化肽的酶法制備及抗氧化活性的評(píng)價(jià)方法進(jìn)行了綜述，以期為進(jìn)一步綜合利用乳清蛋白產(chǎn)品提供思路。

圖1 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequence of α-lactalbumin and β-lactoglobulin

1 乳清蛋白源抗氧化肽的酶法制備

酶解是從完整的蛋白質(zhì)序列中釋放生物活性肽的有效途徑，可以使肽鍵斷裂形成更小的肽或游離氨基酸。具有水解條件溫和、對(duì)蛋白質(zhì)底物破壞較小等優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)食品級(jí)蛋白質(zhì)水解物的理想方法。

1.1 酶法制備

不同的蛋白酶和反應(yīng)條件(pH、溫度、時(shí)間、酶底比)會(huì)產(chǎn)生含有不同肽段和不同抗氧化活性的水解產(chǎn)物。目前制備乳清蛋白源抗氧化肽多選用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶等內(nèi)切酶(表1)。GAD等[11]發(fā)現(xiàn)乳清蛋白的抗氧化活性與濃度有關(guān)。為了提高乳清蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性，MAUX等[12]發(fā)現(xiàn)用木瓜蛋白酶水解WPC時(shí)，將pH控制在7時(shí)的水解產(chǎn)物抗氧化活性明顯高于不控制pH條件的水解產(chǎn)物抗氧化活性。這是由于pH值影響酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，因此pH值的微小變化也可能影響酶的構(gòu)象。許多研究表明，堿性蛋白酶水解WPC得到的水解產(chǎn)物比其他蛋白酶水解的乳清蛋白水解產(chǎn)物(whey protein hydrolysates，WPH)具有更強(qiáng)的抗氧化活性[13-15]。這是由于蛋白酶酶切位點(diǎn)的不同造成了抗氧化肽結(jié)構(gòu)和活性的差異。并且水解WPC前在95 ℃條件下預(yù)熱5～10 min，有助于蛋白質(zhì)球狀結(jié)構(gòu)的展開，使疏水區(qū)域更容易被酶利用[16-17]。PENG等[18]研究了不同水解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶WPH抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)過(guò)長(zhǎng)的水解時(shí)間會(huì)導(dǎo)致水解出過(guò)多的游離氨基酸，從而導(dǎo)致抗氧化活性降低。水解是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，肽段不斷地形成和降解，因此如何選擇和優(yōu)化水解條件以最大程度釋放出抗氧化肽是至關(guān)重要的。

表1 酶法制備乳清蛋白源抗氧化肽Table 1 Preparation of whey protein source antioxidant peptides by enzymatic method

注：WPI，乳清分離蛋白；WPC，乳清濃縮蛋白；WPH，乳清蛋白水解物；TE，Trolox等價(jià)物；“—”表示所引文獻(xiàn)的研究中未鑒定具體多肽序列；RP-HPLC，反相高效液相色譜；Q-TOF MS，三重四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜；MALDI-TOF MS，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；LC-MS/MS，液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用。

據(jù)報(bào)道，抗氧化肽都是一些分子質(zhì)量比較小的肽，并且WPH中得到的肽的種類比較多，肽的分子質(zhì)量比較接近，因此分離純化較困難，一般將多種分離技術(shù)連用進(jìn)行分離?？寡趸牡拇址蛛x一般使用超濾技術(shù)，按照分子質(zhì)量的大小進(jìn)行膜過(guò)濾，從而實(shí)現(xiàn)分離。有研究者[14,19]發(fā)現(xiàn)含有小分子質(zhì)量肽段的水解產(chǎn)物(<3 kDa)比那些含有大分子質(zhì)量肽段的水解產(chǎn)物具有更高的抗氧化活性。但超濾技術(shù)僅僅是按照分子質(zhì)量的大小進(jìn)行分離，如果需要純度更高的肽，需要進(jìn)一步采用柱層析結(jié)合高效液相色譜等手段進(jìn)行分離，得到純度比較高的抗氧化肽后，再通過(guò)質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列(表1)。部分研究者在酶解乳清蛋白水解產(chǎn)物中鑒定出了幾種來(lái)自于β-乳球蛋白的抗氧化肽，其中大部分肽都在f(42-61)、f(77-110)和f(123-135)范圍內(nèi)[20-21]。HERNANDEZLEDESMA等[22]用Corolase PP酶水解β-乳球蛋白，在水解產(chǎn)物3 kDa的組分中鑒定出了幾種肽和氨基酸。合成了MHIRL, YVEEL,和WYSLAMAASDI 3種多肽，分別測(cè)定其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)3種合成肽的抗氧化活性高于等摩爾對(duì)應(yīng)游離氨基酸的混合物，其中WYSLAMAASDI的抗氧化活性與合成的抗氧化劑丁基羥基乙醚相當(dāng)，約是植物多酚兒茶素和槲皮素的1/4左右。NONGONIERMA等[23]在α-乳白蛋白和乳鐵蛋白中發(fā)現(xiàn)了一種合成二肽WC，其IC50值為0.26 mmol/L，相當(dāng)于17.2 nmol/L的Trolox。此外，SADAT等[24]用嗜熱芽孢桿菌蛋白酶水解α-乳白蛋白得到純化肽LDQW、INYW，抗氧化活性分別為相同條件下Trolox的5和10倍。

1.2 抗氧化肽作用機(jī)理

目前，抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系及其機(jī)理尚未完全闡明。但已有的研究表明，抗氧化肽的活性與肽的氨基酸組成、序列、結(jié)構(gòu)和疏水性有關(guān)?？寡趸闹械氖杷园被崛绫彼?、纈氨酸、亮氨酸等的非極性脂肪烴側(cè)鏈能夠加強(qiáng)抗氧化肽與疏水性多不飽和脂肪酸互作，使肽與氧結(jié)合或抑制脂質(zhì)中氫的釋放，從而保護(hù)脂質(zhì)體系、膜質(zhì)的完整性，起到抗氧化作用[25]。而抗氧化肽中帶有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的殘基如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸由于酚羥基和吲哚基團(tuán)可以作為氫供體而具有較強(qiáng)的抗氧化活性，因?yàn)榉恿u基和吲哚基團(tuán)的自由基與簡(jiǎn)單的過(guò)氧自由基相比，具有穩(wěn)定性更高，壽命更長(zhǎng)的特點(diǎn)。其中酪氨酸的苯環(huán)是共軛體系，鄰、對(duì)位基團(tuán)易受側(cè)鏈基團(tuán)影響，是典型的氫供體。酪氨酸的誘導(dǎo)效應(yīng)是給電子，使酚羥基的密度進(jìn)一步增大，并使其脫掉質(zhì)子后形成更穩(wěn)定的自由基中間體[26]。

單純的氨基酸也有某些抗氧化活性，但大多數(shù)情況下低于其組成的抗氧化肽的活性。因此，可以認(rèn)為抗氧化肽的高生物活性源于肽鏈內(nèi)氨基酸之間的短程相互作用。含巰基的半胱氨酸作為抗氧化劑能夠和自由基直接作用，對(duì)肽的抗氧化活性具有重要貢獻(xiàn)。組氨酸的咪唑基團(tuán)與其金屬螯合、供氫和脂質(zhì)過(guò)氧化能力有關(guān)，含組氨酸的抗氧化肽的活性受物理環(huán)境的影響，特別是疏水化合物的存在可以增加對(duì)疏水自由基的接近性[27]。CHEN等[25]發(fā)現(xiàn)抗氧化肽的活性依賴于肽段His-His，去除C端His殘基，使得抗氧化活性降低約50%，而去除N端Leu則對(duì)抗氧化活性無(wú)影響。有研究[28]用統(tǒng)計(jì)建模方法對(duì)抗氧化肽的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)抗氧化肽的N和C端氨基酸是抗氧化活性的重要預(yù)測(cè)因子，N末端氨基酸的疏水性對(duì)肽段的抗氧化活性有重要影響，迄今發(fā)現(xiàn)的抗氧化肽中有一半以上在N端有疏水殘基。C末端氨基酸的電荷性質(zhì)(即凈電荷、分子極性)也是抗氧化活性的重要預(yù)測(cè)因子。這個(gè)位置是一個(gè)極性區(qū)域，受其靜電勢(shì)的影響，色氨酸、谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸和酪氨酸經(jīng)常出現(xiàn)。與C端相鄰的第二個(gè)氨基酸被認(rèn)為是抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者，如果該氨基酸具有較大的氫鍵和空間性質(zhì)，疏水性較低，則將增加潛在的抗氧化活性。乳清蛋白肽在這個(gè)位置通常是谷氨酸、精氨酸或天門冬氨酸。根據(jù)氨基酸的理化性質(zhì)可以對(duì)其活性機(jī)制進(jìn)行分類，如圖2所示[29]，抗氧化劑通過(guò)提供氫原子和提供電子兩種途徑清除自由基。在提供氫原子途徑中，抗氧化劑脫去一個(gè)H·給自由基A·，生成穩(wěn)定化合物AH，而抗氧化劑轉(zhuǎn)變?yōu)楸容^穩(wěn)定的自由基B·，不易引發(fā)新的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而使鏈反應(yīng)終止。而在提供電子的途徑中，則需要進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移和質(zhì)子轉(zhuǎn)移兩步反應(yīng)[29]。

圖2 抗氧化劑與自由基反應(yīng)機(jī)制Fig.2 Mechanisms of antioxidant reacting with free radical

總體來(lái)說(shuō)，乳清蛋白源抗氧化肽的活性可能是由上述部分或全部機(jī)制的聯(lián)合作用或者協(xié)同作用決定的。因此，在進(jìn)行活性評(píng)價(jià)時(shí)，評(píng)估每種類型的活性對(duì)于更好的理解相關(guān)機(jī)制至關(guān)重要。

2 評(píng)價(jià)方法

乳清蛋白/肽的抗氧化活性，需要用不同的方法進(jìn)行評(píng)估。目前常用的方法主要有體外化學(xué)法、體外細(xì)胞培養(yǎng)法和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法(表2)。

表2 不同評(píng)價(jià)方法的對(duì)比Table 2 Comparison of different evaluation methods

2.1 體外化學(xué)法

體外測(cè)定抗氧化活性是評(píng)價(jià)水解蛋白或多肽制劑抗氧化潛力的關(guān)鍵。由于抗氧化劑的復(fù)雜性，沒有一種單一的方法可以測(cè)量一種物質(zhì)的總抗氧化活性。因此，在進(jìn)行體外活性評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)盡可能的全面，或著重評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)關(guān)注的抗氧化指標(biāo)，選擇合適的試驗(yàn)方法。目前測(cè)定乳清蛋白/肽的體外抗氧化活性的方法主要有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力, 2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS)自由基清除能力,鐵離子還原能力(ferric-reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)，氧自由基清除能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)等。其中，DPPH和ABTS方法的機(jī)理是抗氧化化合物與自由基之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移。DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，在氮橋的一個(gè)原子上有一個(gè)不成對(duì)電子。溶液呈深紫色，樣品中的抗氧化化合物通過(guò)與孤電子配對(duì)，使得深紫色的DPPH自由基被還原成黃色。并且DPPH的褪色程度與其所接受的電子數(shù)量呈定量關(guān)系。因此較高的DPPH值代表著較高的抗氧化活性[30]。ABTS經(jīng)活性氧氧化后可以生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色的陽(yáng)離子ABTS+·，樣品中的抗氧化化合物可以與ABTS+·反應(yīng)，從而使體系褪色。ABTS自由基清除活性可以體現(xiàn)在將ABTS轉(zhuǎn)化為無(wú)色產(chǎn)物的能力，這與氫供體或鏈斷裂性能有關(guān)[29]。FRAP法的原理是基于氧化還原的比色法，屬于電子轉(zhuǎn)移途徑。Fe3+-TPTZ(三吡啶三嗪)在酸性條件下被樣品中的抗氧化化合物還原成Fe2+-TPTZ，溶液變成深藍(lán)色。其變色程度與還原能力呈定量關(guān)系[31]。ORAC法屬于氫原子轉(zhuǎn)移途徑，2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽分解生成的過(guò)氧自由基與熒光探針反應(yīng)生成非熒光產(chǎn)物。而樣品中的抗氧化化合物可以抑制探針氧化，從而保持熒光。隨著時(shí)間的推移，熒光產(chǎn)物的形成速率和數(shù)量決定了抗氧化化合物的能力，ORAC值表示為熒光衰減曲線的凈面積[32]。

2.2 體外細(xì)胞培養(yǎng)法

體外抗氧化活性分析的結(jié)果具有一定的局限性，因?yàn)檫@些分析不能反應(yīng)細(xì)胞的生理?xiàng)l件。因此，越來(lái)越多的研究者使用體外細(xì)胞培養(yǎng)法評(píng)估乳清蛋白/肽。其中體外細(xì)胞一般選擇經(jīng)常暴露于氧化應(yīng)激的靶器官(如肝臟、大腦或肌肉)細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)主要依賴于細(xì)胞中抗氧化劑的含量(谷胱甘肽(glutathione，GSH)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、過(guò)氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD))，這些抗氧化劑具有許多預(yù)防氧化的功能。通過(guò)飲食提高細(xì)胞中GSH、CAT、SOD的含量有助于健康和長(zhǎng)壽。

2.2.1 谷胱甘肽活性

GSH在細(xì)胞水平上可以通過(guò)氫原子轉(zhuǎn)移直接作用于自由基，并且可以促進(jìn)氨基酸的運(yùn)輸，通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)的一些活性氧自由基使抗氧化劑(如VC和VE)恢復(fù)其功能形式。為了證明乳清蛋白/肽對(duì)細(xì)胞的影響，最近的研究中，TSENG等[33]用WPC預(yù)處理大鼠腎細(xì)胞PC12，之后用乙醇刺激細(xì)胞，每毫克蛋白產(chǎn)生了59.4 mmol/L GSH，未預(yù)處理的細(xì)胞則每毫克蛋白產(chǎn)生29.9 mmol/L GSH(P<0.05)差異顯著。這表明，當(dāng)受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，乳清蛋白可以為細(xì)胞提供保護(hù)。PYO等[34]用WPC預(yù)處理人類肝細(xì)胞HepG2，之后用叔丁基過(guò)氧化氫刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)WPC預(yù)處理增加了未受刺激細(xì)胞的GSH水平，并將受刺激細(xì)胞的GSH水平恢復(fù)了80%。為了鑒定出乳清蛋白中增加GSH的具體片段OKEEFFE等[14]用3種酶水解的WPH處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，并監(jiān)控GSH水平，將水解產(chǎn)物用不同孔徑大小的膜進(jìn)行分離。與未處理的細(xì)胞相比，用WPH處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)GSH水平顯著增加，其中枯草桿菌蛋白酶水解產(chǎn)物中的1 kDa組分使HUVEC細(xì)胞中GSH含量比未處理細(xì)胞提高了153%。

2.2.2 過(guò)氧化氫酶活性和過(guò)氧化物歧化酶活性

為了研究乳清蛋白是否能增加細(xì)胞中的CAT活性和SOD活性，XU等[35]用WPC80處理H2O2氧化誘導(dǎo)損傷的C2C12肌肉細(xì)胞發(fā)現(xiàn)WPC80可以使細(xì)胞CAT活性和SOD活性顯著提高，此外，還使未受H2O2刺激的細(xì)胞的SOD活性明顯提高。OKEEFFE等[14]用Corolase PP水解的WPH中1 kDa組分處理H2O2氧化誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞，與未處理的細(xì)胞相比，CAT活性增加了141%，差異極顯著。KONG等[36]用枯草桿菌蛋白酶水解的WPH處理H2O2氧化誘導(dǎo)損傷的肺成纖維細(xì)胞MRC-5后，細(xì)胞CAT活性從每毫克蛋白25 U增長(zhǎng)到65 U，細(xì)胞SOD活性增加了248%。

PURPURA等[37]發(fā)現(xiàn)在攝入WPI后，血漿中氨基酸濃度最高，表明乳清蛋白在胃腸道中會(huì)快速被消化為游離氨基酸。POWER-GRANT等[38]對(duì)完整的WPC進(jìn)行模擬胃腸消化，然后用ORAC測(cè)定其抗氧化活性。胃消化WPC后，其ORAC值較未消化WPC增加2.5倍。為了測(cè)定置于經(jīng)胃消化后的乳清制品環(huán)境下的腸道細(xì)胞的抗氧化活性，PICCOLOMINI等[39]用胃消化的WPI處理H2O2氧化誘導(dǎo)損傷的腸上皮細(xì)胞Caco-2，與對(duì)照組相比，用胃消化的WPI處理后，Caco-2細(xì)胞的活性氧(reactive oxygen species，ROS)活性降低了32.5%。CORROCHANO等[40]對(duì)WPI進(jìn)行模擬胃腸消化，并經(jīng)Caco-2/HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，最終鑒定并合成了幾種乳清蛋白肽，其中肽ALPM, GDLE, VGIN和AVEGPK顯著降低了氧化誘導(dǎo)損傷細(xì)胞C2C12和HepG2的氧化水平。此外，JOUBRAN等[41]對(duì)α-乳白蛋白分別進(jìn)行嬰兒胃腸模擬消化和成人胃腸模擬消化后發(fā)現(xiàn)，嬰兒十二指腸消化樣品比成人十二指腸消化樣品具有更高的抗氧化活性，但是成人的胃消化樣品抗氧化活性高于嬰兒時(shí)期。這說(shuō)明乳清蛋白在腸道運(yùn)輸過(guò)程中的抗氧化活性不僅受腸道位置的影響，還可能和年齡階段有關(guān)。

體外細(xì)胞培養(yǎng)法是將細(xì)胞直接置于乳清蛋白/肽中，但是乳清蛋白/肽通常是作為食物被攝入體內(nèi)的，目標(biāo)細(xì)胞只會(huì)暴露在從腸道進(jìn)入血液的乳清成分中，在體外環(huán)境中具有抗氧化活性的乳清蛋白/肽在體內(nèi)不一定能保持其活性，因此這類試驗(yàn)的生物學(xué)意義還有待證實(shí)。

2.3 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法

乳清蛋白/肽能否在機(jī)體內(nèi)部發(fā)揮活性，需要通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，也是活性評(píng)估中最重要的一環(huán)，但是到目前為止，只有少數(shù)研究使用人體或者動(dòng)物的飲食干預(yù)試驗(yàn)評(píng)估乳清蛋白/肽的有效性。雖然生物標(biāo)志物是有限制的，但人體或動(dòng)物的飲食干預(yù)試驗(yàn)仍是目前最好的評(píng)估體內(nèi)抗氧化作用的方法。

2.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一般采用不同的小鼠模型進(jìn)行短期或長(zhǎng)期的飲食干預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)比較飲食干預(yù)前后小鼠血液或組織中GSH、CAT水平評(píng)估乳清蛋白/肽的有效性。GOLD[42]給17～20月大的老年C7BL/6NIA雄性小鼠喂食富含WPC的食物3個(gè)月。之后測(cè)量小鼠肝臟和心臟的GSH水平。食用WPC的小鼠肝臟和心臟的GSH水平明顯高于同期食用富含酪蛋白的食物或?qū)φ帐澄锏男∈?，這表明富含谷胱甘肽氨基酸前體(如Cys)的飲食可以促進(jìn)細(xì)胞GSH的產(chǎn)生。ASHOUSH等[43]發(fā)現(xiàn)添加10 %乳清粉的食物可以保護(hù)Wistar大鼠抵抗CCl4肝毒性，他們認(rèn)為這種抗性是由于血漿中GSH水平增加。KIM等[44]將Sprague-Dawley大鼠作為氧化應(yīng)激模型，一組喂食富含鐵的食物，另一組在喂食同樣富含鐵的食物外，額外喂食10 %的乳清蛋白食物，持續(xù)6周，發(fā)現(xiàn)含有乳清蛋白食物組的大鼠紅細(xì)胞中GSH含量有所增加，但是CAT活性卻沒有顯著提高。而ATHIRA等[45]觀察到，接受枯草桿菌蛋白酶水解的WPH腹腔注射的瑞士白化小鼠的肝臟CAT水平與未接受WPH注射的小鼠相比顯著升高。HARAGUCHI等[46]還發(fā)現(xiàn)富含乳清蛋白的飲食似乎可以延長(zhǎng)老年小鼠的生存時(shí)間。

2.3.2 人體實(shí)驗(yàn)

人體飲食干預(yù)實(shí)驗(yàn)可以更好地反映乳清蛋白/肽的有效性，目前的研究一般選擇特殊人群如持續(xù)高強(qiáng)度訓(xùn)練的人群、超重人群或患病人群進(jìn)行飲食干預(yù)實(shí)驗(yàn)。MIDDLETON等[47]對(duì)18名接受高強(qiáng)度有氧訓(xùn)練的男性參與者進(jìn)行了6周以上的血液中GSH水平的評(píng)估，他們每天補(bǔ)充與體重對(duì)應(yīng)比例的WPI。在進(jìn)行運(yùn)動(dòng)的受試者中，血液中GSH水平明顯低于沒有進(jìn)行運(yùn)動(dòng)的受試者。說(shuō)明在運(yùn)動(dòng)方案中添加WPC可以防止血液中GSH的消耗。SHEIKHOLESLAMI等[48]觀察到，在30名體重超重的年輕男性中，服用WPI并進(jìn)行8周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，血漿GSH水平增加。CHITAPANARUX等[49]發(fā)現(xiàn)，與補(bǔ)充WPI前相比，持續(xù)補(bǔ)充WPI 12周的肝病患者血漿中GSH水平也增加了23 %。而在ZAVORSKY等[50]進(jìn)行的另一項(xiàng)人體試驗(yàn)中，每天服用45 g WPI的受試者血液淋巴細(xì)胞的GSH水平比沒有服用WPI的受試者高24 %。

血漿中GSH水平是檢測(cè)乳清產(chǎn)品體內(nèi)抗氧化作用最常用的指標(biāo)之一。血漿低GSH水平與氧化應(yīng)激誘發(fā)的疾病(如心血管疾病、多囊卵巢綜合征和自閉癥)之間存在正相關(guān)[51]。然而，血漿GSH水平不太可能反映經(jīng)常暴露于氧化應(yīng)激的靶器官(如肝臟、大腦或肌肉)細(xì)胞內(nèi)的GSH水平。因此，記錄與疾病發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的特定蛋白質(zhì)的氧化水平，將在細(xì)胞檢測(cè)和飲食干預(yù)試驗(yàn)中提供更多相關(guān)的生物標(biāo)志物。

3 結(jié)論和展望

乳清和乳清蛋白具有抗氧化活性，并可通過(guò)酶解釋放生物活性肽提高活性。一些來(lái)源于β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的合成肽證明了抗氧化活性。乳清蛋白抗氧化的效果一般不如乳清蛋白源抗氧化肽，但是后者制備的成本比較高，因此如何工業(yè)化生產(chǎn)以及商業(yè)化應(yīng)用也是目前亟待解決的問(wèn)題。乳清蛋白/肽活性的測(cè)定方法有很多，但是并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，使得不同研究者得到的結(jié)論缺乏可比性，應(yīng)進(jìn)一步制定一個(gè)相對(duì)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。乳清蛋白/肽體外活性的研究相對(duì)較多，而對(duì)于體內(nèi)抗氧化機(jī)制的研究相對(duì)較少，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)等研究抗氧化肽的體內(nèi)活性，并比較體內(nèi)與體外活性之間的差異及相互聯(lián)系。最重要的是，抗氧化肽對(duì)人體產(chǎn)生有益作用的同時(shí)，也可能有一些副作用，這些副作用(細(xì)胞毒性、變態(tài)反應(yīng)等)可能是抗氧化肽本身具有的，未來(lái)要進(jìn)行更深層次的研究。