張震，熊海波，徐慶陽(yáng),2,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457) 3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

L-色氨酸為8種必需氨基酸之一，在人體代謝過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的重要作用，故又被稱(chēng)為第二必需氨基酸[1]。它可以促進(jìn)人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)節(jié)其新陳代謝水平和生理功能，促進(jìn)消化，提高機(jī)體免疫力，因而被廣泛用于食品、醫(yī)藥、飼料和農(nóng)業(yè)等行業(yè)，在氨基酸生產(chǎn)中占有重要地位[2-3]。微生物直接發(fā)酵法是當(dāng)前L-色氨酸生產(chǎn)的主流方法，該法利用性能優(yōu)越的工程菌株生產(chǎn)色氨酸，其中大腸桿菌應(yīng)用較多[4-5]。

在工程菌的大規(guī)模發(fā)酵過(guò)程中，外源基因表達(dá)水平以及菌體密度決定了重組異源蛋白產(chǎn)物的宏觀合成量[6]。從理論上說(shuō)，在維持外源基因表達(dá)水平不變的前提下，提高工程菌的發(fā)酵密度可以大幅度提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量，提高發(fā)酵效率，降低生產(chǎn)成本[7]。而大腸桿菌工程菌的高密度培養(yǎng)技術(shù)(high cell density cultivation, HCDC)為解決這一需要應(yīng)運(yùn)而生。但是，限制大腸桿菌高密度培養(yǎng)的因素有很多，如宿主菌類(lèi)型、培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)方式、發(fā)酵條件控制、抑制性副產(chǎn)物的積累等[9-11]。因此除應(yīng)用目的產(chǎn)物高產(chǎn)工程菌外，確定合適的發(fā)酵工藝并對(duì)工程菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化是提高發(fā)酵水平的有效手段之一。其中，發(fā)酵接種量和底物磷酸鹽添加量是2個(gè)重要的限制性因素[8, 12]，二者直接影響工程菌的生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物的合成，從而影響整體發(fā)酵質(zhì)量。

本研究在大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-色氨酸時(shí)，通過(guò)梯度試驗(yàn)先后對(duì)發(fā)酵接種量和底物磷酸鹽添加量進(jìn)行了優(yōu)化，大幅提高了菌體最高密度及L-色氨酸產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)了較高水平的大腸桿菌高密度培養(yǎng)，為大腸桿菌高密度培養(yǎng)在L-色氨酸發(fā)酵中的應(yīng)用提供了新思路。同時(shí)，對(duì)底物磷酸鹽添加量對(duì)發(fā)酵的影響進(jìn)行了著重分析，為L(zhǎng)-色氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中底物磷酸鹽的調(diào)控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-色氨酸工程菌EscherichiacoliTRTH (trpEDCBA+TetR)，由天津科技大學(xué)代謝工程研究室提供。

1.2.1 活化培養(yǎng)基

酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂粉20 g/L，四環(huán)素20 mg/L。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖40 g/L，酵母粉4 g/L，檸檬酸0.5 g/L， (NH4)2SO41 g/L，KH2PO45 g/L，VB11 mg/L，VH0.3 mg/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.8 mg/L，微量元素混合溶液0.2%(體積分?jǐn)?shù)),參照楊夢(mèng)晨[13]的方法配制。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖10 g/L，酵母粉4 g/L，檸檬酸2 g/L，(NH4)2SO44 g/L，KH2PO46 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 75 mg/L，VB15 mg/L，VH0.2 mg/L，微量元素混合溶液0.2%(體積分?jǐn)?shù))。

注：對(duì)于底物KH2PO4添加量梯度試驗(yàn)，除KH2PO4分別改為相應(yīng)濃度外，其他成分均與上述發(fā)酵培養(yǎng)基一致。

1.3 主要儀器

LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠； 5 L不銹鋼機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；30 L不銹鋼機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；TU 1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LC20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；S-433D氨基酸分析儀，德國(guó)賽卡姆公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

取甘油管中菌種接種于斜面培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，傳代2次，每代培養(yǎng)12 h。

1.4.2 5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：利用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行種子培養(yǎng)，初始發(fā)酵液體積定容至3 L。初始通氣量為2 L/min，初始攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，通過(guò)自動(dòng)流加25%(質(zhì)量濃度)的氨水控制發(fā)酵液pH值在7.0～7.2之間， 37 ℃培養(yǎng)，通過(guò)攪拌和通風(fēng)控制溶氧，維持在250～350 mg/L之間，培養(yǎng)至細(xì)胞干重達(dá)到5～6 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)：參照程立坤等[14]的方法，利用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，初始發(fā)酵液體積定容至3 L。通過(guò)自動(dòng)流加25%(質(zhì)量濃度)的氨水控制培養(yǎng)基pH值在7.0～7.2之間，控制溶氧在250～400 mg/L，發(fā)酵過(guò)程中以泡敵消泡。底物葡萄糖消耗完后，根據(jù)DO反饋補(bǔ)料策略，流加質(zhì)量濃度為800 g/L的葡萄糖溶液，維持零殘?zhí)前l(fā)酵[15]。過(guò)程中每隔2 h測(cè)樣、記錄數(shù)據(jù)。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 接種量梯度控制發(fā)酵

當(dāng)種子培養(yǎng)至細(xì)胞干重達(dá)到5～6 g/L時(shí)，分別按10%、15%、20%、25%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入到新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比試驗(yàn)，以菌體密度和產(chǎn)量為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選擇最優(yōu)結(jié)果。

1.5.2 底物磷酸鹽梯度添加控制發(fā)酵

在最適接種量的基礎(chǔ)上，以KH2PO4添加量作為變量，在不同批次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的底物中分別添加6、8、10、12 g/L KH2PO4，其他培養(yǎng)條件不變，進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比試驗(yàn)，以綜合表現(xiàn)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選擇最優(yōu)結(jié)果。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 pH值測(cè)定

采用Hamilton pH電極在線檢測(cè)，精密試紙(pH 6.4～8.0)輔助檢測(cè)。

1.6.2 菌體生物量測(cè)定

菌體密度以菌體干重表示，取10 mL發(fā)酵液，13 000 r/min離心2 min，將菌體用蒸餾水洗滌2次后置于真空干燥箱中80 ℃干燥至恒重后用分析天平稱(chēng)重。

1.6.3L-色氨酸含量測(cè)定

采用高效液相色譜法檢測(cè)L-色氨酸含量。具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]。

1.6.4 有機(jī)酸副產(chǎn)物含量測(cè)定

采用高效液相色譜法檢測(cè)有機(jī)酸含量。色譜柱Aminex HPX-87H Column(300 mm×7.8 mm)；流動(dòng)相5 mmol/L H2SO4；柱溫30 ℃；流速0.5 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm。

1.6.5 氨基酸副產(chǎn)物含量測(cè)定

采用德國(guó)賽卡姆公司氨基酸分析儀(S-433D)進(jìn)行測(cè)定，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[16]。

1.6.6 磷酸鹽含量的測(cè)定[17]

磷酸鹽含量測(cè)定采用田康明等[17]的方法，采用江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司磷酸鹽快速檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.7 分析方法

1.7.1 糖酸轉(zhuǎn)化率計(jì)算

糖酸轉(zhuǎn)化率SA根據(jù)公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：ρ，L-色氨酸質(zhì)量濃度，g/L；V，發(fā)酵液總體積，L；m，總耗糖量，g。

1.7.2 菌體比生長(zhǎng)速率[18]

菌體比生長(zhǎng)速率μ定義為單位質(zhì)量菌體的瞬時(shí)增量，根據(jù)李會(huì)等[18]的研究，用公式(2)計(jì)算:

(2)

式中：X，x，菌體量，g/L；t，時(shí)間，h；μ，菌體比生長(zhǎng)速率，h-1。

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次實(shí)驗(yàn)的平均值。利用軟件IBM SPSS Statistics 25進(jìn)行分析，來(lái)確定數(shù)據(jù)差異的顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 接種量梯度發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果分析

為探究提高接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響，設(shè)置10%、15%、20%、25%(體積分?jǐn)?shù))四個(gè)接種量梯度，并以10%(體積分?jǐn)?shù))(初始發(fā)酵工藝)作為對(duì)照組，進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比試驗(yàn)，檢測(cè)菌體在發(fā)酵過(guò)程中的菌體密度與產(chǎn)量變化并繪制L-色氨酸合成速率曲線，結(jié)果如圖1、2所示。

圖1 接種量對(duì)菌體密度和L-色氨酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of inoculation amount on cell density and L-tryptophan production注：圖1中空心圖標(biāo)為菌體密度，實(shí)心圖標(biāo)為L(zhǎng)-色氨酸產(chǎn)量。

圖2 接種量對(duì)L-色氨酸合成速率的影響Fig.2 Effects of inoculation amount on the rate of L-tryptophan synthesis

由圖1可知，發(fā)酵延滯期隨著接種量的增加逐漸縮短，接種量提高到20%(體積分?jǐn)?shù))，發(fā)酵延滯期縮短至2 h以內(nèi)；接種量繼續(xù)提高至25%(體積分?jǐn)?shù))，發(fā)酵延滯期幾乎消失，菌體快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。同時(shí)，接種量從10%逐步提高到20%(體積分?jǐn)?shù))，最高菌體密度從44.79 g/L增加到47.76 g/L，有小幅增長(zhǎng)(P<0.05)；最終L-色氨酸產(chǎn)量分別為45.30 g/L與47.71 g/L，無(wú)顯著差異(P>0.05)。接種量繼續(xù)增加到25%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)，最高菌體密度及最終L-色氨酸產(chǎn)量分別為47.07 g/L與46.51 g/L，與20%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)相比沒(méi)有明顯提升，且發(fā)酵中后期菌體活力開(kāi)始衰弱，菌體密度呈明顯下降趨勢(shì)。另外，從L-色氨酸合成速率(圖2)來(lái)看，20%(體積分?jǐn)?shù))接種量時(shí)，發(fā)酵表現(xiàn)出更強(qiáng)的單位產(chǎn)酸能力，最高L-色氨酸合成速率為1.92 g/(L·h)，遠(yuǎn)高于對(duì)照發(fā)酵的1.67 g/(L·h)，產(chǎn)酸高峰期維持時(shí)間(6～30 h)也較長(zhǎng)，這更有利于色氨酸的大量積累和實(shí)現(xiàn)菌體高密度培養(yǎng)。

分析可知，接種量影響菌體的適應(yīng)能力和生長(zhǎng)速率，是影響大腸桿菌高密度發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一。種子液中含有大量的胞外水解酶，能促進(jìn)菌體快速分解利用底物[19]，接種量的增加使這些酶的量也相應(yīng)增加，因此在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足的條件下，較大的接種量能強(qiáng)化菌體對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)能力，縮短延滯期，增強(qiáng)菌體活力，提高生長(zhǎng)、產(chǎn)酸效率，為菌體的高密度培養(yǎng)打下良好基礎(chǔ)。但同時(shí)，接種量過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)過(guò)快，在發(fā)酵后期容易發(fā)生菌體自溶、迅速老化的情況，給發(fā)酵帶來(lái)不利影響。綜合考慮，選擇20%(體積分?jǐn)?shù))作為接種量最優(yōu)值，繼續(xù)下一步優(yōu)化。

2.2 底物磷酸鹽梯度添加控制發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 底物中KH2PO4添加量對(duì)菌體密度和產(chǎn)酸的影響

在接種量提高到20%(體積分?jǐn)?shù))的基礎(chǔ)上，對(duì)底物K2HPO4添加量設(shè)置6、8、10、12 g/L四個(gè)梯度進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比試驗(yàn)，測(cè)定菌體在發(fā)酵過(guò)程中的菌體密度與產(chǎn)酸變化，計(jì)算并繪制比生長(zhǎng)速率與L-色氨酸合成速率曲線，結(jié)果如圖3所示。

由圖3-a可知，隨著底物KH2PO4添加量的提高，最高菌體密度逐漸增加，并在底物KH2PO4為12 g/L時(shí)達(dá)到峰值，為67.92 g/L，較底物KH2PO46 g/L(47.43 g/L)時(shí)提高了43.20%；最終L-色氨酸產(chǎn)量先增加，在底物KH2PO4為10 g/L時(shí)達(dá)到最高，為59.55 g/L，較6 g/L KH2PO4(47.49 g/L)時(shí)提高25.39%，之后開(kāi)始下降。同時(shí)，從比生長(zhǎng)速率μ(圖3-b)和L-色氨酸合成速率(圖3-c)來(lái)看，底物KH2PO4濃度的增加使菌體活力更加旺盛，前期生長(zhǎng)速度明顯加快，μmax也隨之提高，并在12 g/L KH2PO4時(shí)達(dá)到最高，為0.53 h-1，較6 g/L KH2PO4時(shí)(0.34 h-1)提高了55.88%；10 g/L KH2PO4時(shí)，菌體表現(xiàn)出更持久的高單位產(chǎn)酸能力，其最高L-色氨酸合成速率為2.47 g/(L·h)，較6 g/L KH2PO4時(shí)的1.87 g/(L·h)提高了46.52%，整體產(chǎn)酸水平隨之大幅提升。

圖3 不同KH2PO4添加量對(duì)菌體密度(a)、比生長(zhǎng)速率(b)、L-色氨酸合成速率(c)的影響Fig.3 Effects of different KH2PO4 additions on cell density(a), specific growth rate(b),the rate of L-tryptophan synthesis(c)注：圖3(a)中空心圖標(biāo)為菌體密度，實(shí)心圖標(biāo)為L(zhǎng)-色氨酸產(chǎn)量。

2.2.2 底物KH2PO4添加量對(duì)發(fā)酵過(guò)程中磷酸鹽消耗的影響

圖4 底物KH2PO4添加量對(duì)發(fā)酵過(guò)程中磷酸鹽消耗的影響Fig.4 Effect of substrate KH2PO4 addition on phosphate consumption during fermentation

表1 不同KH2PO4添加量對(duì)每4 h內(nèi)平均消耗速率的影響 單位：mmol/(L·h)Table 1 Effects of different KH2PO4 additions on average consumption rate of s every 4 h

2.2.3 底物中KH2PO4添加量對(duì)發(fā)酵耗糖和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

發(fā)酵結(jié)束后，計(jì)算并繪制補(bǔ)糖速率與糖酸轉(zhuǎn)化率過(guò)程曲線，結(jié)果如圖5所示。由圖5-a可知，底物KH2PO4為由6 g/L增加至12 g/L，最高補(bǔ)糖速率由13.06 g/(L·h)提升至15.51 g/(L·h)，菌體糖代謝水平顯著提升。同時(shí)，就糖酸轉(zhuǎn)化率(圖5-b)而言，底物KH2PO4為10 g/L時(shí)的糖酸轉(zhuǎn)化率在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)均處于較高水平，其峰值達(dá)到了21.35%，較6 g/L KH2PO4時(shí)(18.82%)提高了13.44%，更多的碳源流向了目的產(chǎn)物，原料利用率大幅提高。

圖5 不同KH2PO4添加量對(duì)補(bǔ)糖速率(a)和糖酸轉(zhuǎn)化率(b)的影響Fig.5 Effects of different KH2PO4 additions on glucose feeding rate (a) and glucose conversion rate (b)

2.2.4 底物中KH2PO4添加量對(duì)發(fā)酵副產(chǎn)物的影響[20]

發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)主要抑制性副產(chǎn)物乙酸、乳酸及丙氨酸最終含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示?？芍孜颣H2PO4添加量由6 g/L提高至10 g/L，各副產(chǎn)物積累量均有小幅上漲，但整體差異不大，且都處于合理水平，不會(huì)對(duì)發(fā)酵造成負(fù)面影響；底物KH2PO4添加量繼續(xù)增加至12 g/L時(shí)，3種副產(chǎn)物積累量均大幅增加，其中，乙酸和乳酸均超過(guò)5 g/L，菌體代謝異常，正常生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響[11]，進(jìn)而出現(xiàn)糖酸轉(zhuǎn)化率降低、產(chǎn)品質(zhì)量下降、提取難度加大等一系列問(wèn)題。

圖6 不同KH2PO4添加量對(duì)發(fā)酵副產(chǎn)物的影響Fig.6 Effects of different KH2PO4 additions on fermentation by-products

3 結(jié)論

在大腸桿菌的高密度發(fā)酵中，接種量和底物磷酸鹽添加量是2個(gè)重要的限制性因素，二者直接影響最終發(fā)酵結(jié)果。本試驗(yàn)利用梯度試驗(yàn)先后對(duì)發(fā)酵接種量及底物KH2PO4添加量進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定最佳接種量為20%(體積分?jǐn)?shù))，底物KH2PO4添加量為10 g/L。試驗(yàn)結(jié)果表明，在優(yōu)化后的條件下，底物磷酸鹽能被菌體充分有效利用，發(fā)酵整體糖代謝水平提升，細(xì)胞生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物表達(dá)得到促進(jìn)，最高菌體密度達(dá)到65.39 g/L，最終L-色氨酸產(chǎn)量為59.55 g/L，分別較優(yōu)化前(10%(體積分?jǐn)?shù))接種量，6 g/L KH2PO4)的44.79 g/L(最高菌體密度)和45.30 g/L(最終L-色氨酸產(chǎn)量)，增加了45.99%和31.17%，設(shè)備利用率大幅提高。同時(shí)，由于延滯期的縮短和生長(zhǎng)期的提前優(yōu)化后的發(fā)酵批次在24 h左右就達(dá)到了優(yōu)化前40 h時(shí)的產(chǎn)酸水平(45.30 g/L)，在原有產(chǎn)酸指標(biāo)不變的情況下，壓縮了發(fā)酵周期，降低了時(shí)間成本，極大提高了發(fā)酵效率。