王進(jìn)，王丹，郇傳勝，李朝陽，呂偉，周丁華

(中國人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心，北京100088)

終末期肝病的最終治療手段是原位肝移植，心臟死亡器官捐獻(xiàn)(DCD)是主要的供肝來源，但DCD供肝常伴有嚴(yán)重的熱缺血再灌注損傷，受者術(shù)后早期肝功能明顯受到影響，移植物功能喪失發(fā)生率明顯升高[1]。為了增加供肝來源，臨床逐漸采用邊緣性供肝，其中以脂肪肝最為常見。但脂肪肝比正常肝對缺血再灌注損傷更敏感，肝功能損害、肝細(xì)胞凋亡、微循環(huán)障礙及氧化損傷更明顯，耐受缺血時間也比正常肝短，這些問題是脂肪肝供肝移植后患者肝功能障礙的主要原因[2,3]。因此，脂肪肝的脂肪變程度與移植后不良反應(yīng)密切相關(guān)，決定了供肝能否用于移植手術(shù)。微透析技術(shù)是一種將灌流取樣和透析技術(shù)結(jié)合起來，并逐漸完善的一種從生物活體內(nèi)進(jìn)行動態(tài)微量生化取樣的新技術(shù)，具有活體連續(xù)取樣、動態(tài)觀察、定量分析、采樣量小、組織損傷輕等特點[4]。通過微透析技術(shù)可觀察肝臟細(xì)胞外液樣本中化學(xué)物質(zhì)改變，監(jiān)測肝移植組織的代謝情況，提示細(xì)胞代謝異?；蚣?xì)胞受損狀況[5]。2017年1～12月，本研究采用微透析技術(shù)對脂肪肝大鼠肝臟熱缺血和冷缺血過程中的能量代謝指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測，并探討脂肪變和缺血損傷對肝臟代謝能力的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠12只，雄性，5～7周齡，體質(zhì)量180～220 g。飼養(yǎng)于屏障設(shè)施內(nèi)，室溫控制在20～25 ℃，濕度40%～70%，12 h照明、12 h黑暗。微透析相關(guān)試劑復(fù)方氯化鈉注射液、肝素鈉注射液均購自上海第一生化藥業(yè)有限公司，UW液購自美國Bridge to life公司。微透析設(shè)備CMA402雙通道微量注射泵、CMA600微透析分析儀、CMA30線性探針以及微透析注射器、夾持器均購自瑞典CMA公司。

1.2 建模與分組處理 將12只SD大鼠隨機分為C0組、C30組、F0組、F30組，每組3只。C0組、C30組喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料，F(xiàn)0組、F30組喂飼高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)12周。各組術(shù)前禁食12 h，自由進(jìn)水,稱重后取仰臥位，戊巴比妥腹腔麻醉。C0組和F0組腹部正中線開腹，按體質(zhì)量下腔靜脈注入肝素100 U/100 g，結(jié)扎腹腔干以上主動脈；分別經(jīng)主動脈和門靜脈灌注UW液約20 mL，灌注后分離肝臟，置于冷保存液中進(jìn)行冷缺血處理。C30組和F30組剪開膈肌，使心臟緩慢停搏5～10 min，造成無心跳供體(NHBD)的供肝模型，熱缺血30 min后參照上法灌注UW液、分離肝臟并進(jìn)行冷缺血處理。

1.3 肝臟透析液葡萄糖、乳酸、丙酮酸、甘油水平檢測 采用微透析技術(shù)。各組冷灌注后將CMA30線性探針插入肝左葉，留在肝左葉內(nèi)約1 cm。導(dǎo)管連接至微量泵，用無菌復(fù)方氯化鈉溶液進(jìn)行灌注，每20 min將透析液收集到微量管中。各組分別于冷缺血0、1、2、4、6、8、10、12 h，取透析液作為微透析標(biāo)本，采用CMA600微透析分析儀用酶試劑和色譜方法自動檢測葡萄糖、乳酸、丙酮酸、甘油水平，同時計算乳酸/丙酮酸。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間點透析液葡萄糖水平比較 與同組冷缺血0 h比較，各組其余時間點透析液葡萄糖水平均降低(P均<0.05)；隨著冷缺血時間的延長，各組透析液葡萄糖水平均呈降低趨勢。F0組冷缺血2～12 h透析液葡萄糖水平均高于C0組、F30組同時間點(P均<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點透析液葡萄糖水平比較

注：與同組冷缺血0 h比較，*P<0.05；與C0組同時間點比較，#P<0.05；與F30組同時間點比較，△P<0.05。

2.2 各組不同時間點透析液乳酸水平比較 與同組冷缺血0 h比較，C0組其余各時間點透析液乳酸水平均降低，C30組、F0組冷缺血4～12 h透析液乳酸水平均升高(P均<0.05)；隨著冷缺血時間的延長，C0組透析液乳酸水平呈降低趨勢，C30組、F0組呈升高趨勢，F(xiàn)30組無明顯變化。與C0組同時間點比較，其余各組透析液乳酸水平均升高，以F30組升高最明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 各組不同時間點透析液乳酸水平比較

注：與同組冷缺血0 h比較，*P<0.05；與C0組同時間點比較，#P<0.05；與F30組同時間點比較，△P<0.05。

2.3 各組不同時間點透析液丙酮酸水平比較 與同組冷缺血0 h比較，C0組、F0組冷缺血4～12 h透析液丙酮酸水平均升高，C30組、F30組冷缺血6～12 h透析液丙酮酸水平均降低(P均<0.05)；隨著冷缺血時間的延長，F(xiàn)30組透析液丙酮酸水平呈降低趨勢，其余三組無明顯變化趨勢。F30組冷缺血0～6 h透析液丙酮酸水平均高于其余各組同時間點(P均<0.05)。見表3。

表3 各組不同時間點透析液丙酮酸水平比較

注：與同組冷缺血0 h比較，*P<0.05；與C0組同時間點比較，#P<0.05；與F30組同時間點比較，△P<0.05。

2.4 各組不同時間點透析液乳酸/丙酮酸比較 與同組冷缺血0 h比較，C0組冷缺血1～12 h透析液乳酸/丙酮酸均降低，C30組、F30組冷缺血4～12 h透析液乳酸/丙酮酸水平均升高(P均<0.05)。與C0組同時間點比較，其余各組冷缺血1～12 h透析液乳酸/丙酮酸均升高，以F30組升高最明顯(P均<0.05)。見表4。

表4 各組不同時間點透析液乳酸/丙酮酸比較

注：與同組冷缺血0 h比較，*P<0.05；與C0組同時間點比較，#P<0.05；與F30組同時間點比較，△P<0.05。

2.5 各組不同時間點透析液甘油水平比較 隨著冷缺血時間的延長，C0組透析液甘油水平先降低后升高，其余各組均呈升高趨勢。與C0組同時間點比較，其余各組冷缺血1～12 h透析液甘油水平均升高，以F30組升高最明顯(P均<0.05)。見表5。

表5 各組不同時間點透析液甘油水平比較

注：與同組冷缺血0 h比較，*P<0.05；與C0組同時間點比較，#P<0.05；與F30組同時間點比較，△P<0.05。

3 討論

脂肪肝的脂肪變程度與肝移植后不良反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)，脂肪變程度決定了供肝能否用于移植手術(shù)。臨床上常規(guī)診斷脂肪肝的方法包括BMI、腰臀比、血清TG水平、超聲、CT、MRI和病理切片等。病理切片是判斷脂肪肝的金標(biāo)準(zhǔn)[6]，但病理判斷脂肪變程度比較主觀，很難定量，對病理醫(yī)師的經(jīng)驗要求高，而且切片厚度、染色技術(shù)等均可能對判斷脂肪變程度產(chǎn)生影響[7]。微透析技術(shù)以透析原理作為基礎(chǔ)，通過插入生物體內(nèi)的微透析探頭在非平衡條件下進(jìn)行灌流，物質(zhì)沿濃度梯度擴散，使被分析物質(zhì)穿過細(xì)胞膜擴散進(jìn)入透析管內(nèi)，并被透析管內(nèi)連續(xù)流動的灌流液不斷帶出，從而達(dá)到活體組織取樣的目的[8]。微透析系統(tǒng)由微透析導(dǎo)管、微量注射泵、微量收集瓶和微透析分析儀組成，微透析導(dǎo)管通過模擬毛細(xì)血管的被動轉(zhuǎn)運功能來監(jiān)測組織液的物質(zhì)成分變化。在肝移植領(lǐng)域，微透析技術(shù)已逐漸應(yīng)用于臨床肝移植術(shù)前準(zhǔn)備和術(shù)后監(jiān)測，且應(yīng)用前景良好。研究表明，肝臟熱缺血1 h為供體使用極限，脂肪肝冷缺血6 h為供體使用極限，而正常肝臟冷缺血時間也不能超過24 h[9]。因此，本研究選擇心跳停止后30 min作為熱缺血時間，冷缺血時間選擇12 h作為研究時間上限，微透析檢測每隔2 h進(jìn)行取樣，分析指標(biāo)包括反映細(xì)胞能量代謝的相關(guān)指標(biāo)葡萄糖、乳糖、丙酮酸、乳糖/丙酮酸以及反映細(xì)胞膜損傷的相關(guān)指標(biāo)甘油，以研究脂肪肝及缺血對肝臟功能的影響。

糖代謝主要是指葡萄糖在體內(nèi)通過一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生能量的過程，在缺氧條件下機體則通過糖酵解生成乳酸，產(chǎn)能效率低于有氧氧化。糖酵解最主要的生理意義在于迅速提供能量，其代謝反應(yīng)過程可分為兩個階段，第一階段是葡萄糖分解成丙酮酸的過程，稱為酵解途徑，第二階段是丙酮酸轉(zhuǎn)變成乳酸的過程。糖酵解反應(yīng)均在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，最終生成乳酸[10]。在葡萄糖的無氧代謝過程中，涉及到巴斯德效應(yīng)，即有氧氧化抑制糖酵解的現(xiàn)象。當(dāng)組織氧供充足時，有氧代謝抑制糖酵解，產(chǎn)生能量提供組織活動所需；缺氧時丙酮酸不能進(jìn)入三羧酸循環(huán)，在細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)變成乳酸，而丙酮酸和乳酸可通過彌散的方式通過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞外液中，從而可以被微透析儀器監(jiān)測到[11]。因此，監(jiān)測葡萄糖和乳酸水平可以反映肝組織內(nèi)進(jìn)行的是有氧代謝還是無氧代謝，監(jiān)測丙酮酸水平可以反映肝臟代謝的能量是否充足[12,13]。乳酸水平和乳酸/丙酮酸能夠反映組織葡萄糖酵解和無氧代謝的程度，也是反映細(xì)胞缺血缺氧的標(biāo)志物[14]。當(dāng)細(xì)胞主要依靠無氧酵解供能時，乳酸水平升高，而丙酮酸水平下降，二者比值則升高，提示氧氣和葡萄糖供應(yīng)不足[15]。本研究微透析結(jié)果顯示：①各組透析液葡萄糖水平均隨冷缺血時間均下降，說明冷保存過程中肝臟正在利用暫存的葡萄糖進(jìn)行能量代謝，各組下降趨勢一致，沒有明顯差異。②C0組和C30組乳酸水平維持較低水平，說明正常肝臟具備一定的抗缺血缺氧的能力。C30組乳酸水平高于C0組，說明熱缺血導(dǎo)致肝臟進(jìn)入無氧酵解，生成乳酸。F0組乳酸水平高于C0組，并隨冷缺血時間的延長逐漸升高，說明脂肪肝耐受缺血缺氧能力差，冷缺血后迅速進(jìn)入無氧酵解方式進(jìn)行能量供應(yīng)，丙酮酸生成乳酸，造成乳酸持續(xù)升高。F30組熱缺血后乳酸水平即顯著升高，在冷缺血過程中無明顯變化，但整體水平顯著高于其他各組;這說明F30組冷缺血前的熱缺血階段已經(jīng)迅速啟動無氧酵解產(chǎn)生能量，30 min的熱缺血過程幾乎耗盡了脂肪肝所有的能量代謝底物，丙酮酸生成大量乳酸，造成乳酸堆積而自身又無法清除，因此肝臟處于能量缺乏狀態(tài)。③F30組冷缺血0～6 h透析液丙酮酸水平均高于其余各組同時間點，且在熱缺血后即上升到很高水平，并隨時間延長呈下降趨勢；這說明熱缺血造成了有氧代謝缺失，無氧酵解發(fā)生，產(chǎn)生大量丙酮酸，隨著冷缺血時間的延長，丙酮酸代謝生成乳酸，乳酸增加而丙酮酸減少；同時脂肪肝耐受缺血的能力差，比正常肝臟更敏感。④各組乳酸/丙酮酸變化情況與乳酸表現(xiàn)相似，但C30組該比值隨冷缺血時間升高，而F30組不僅熱缺血后比值高且隨著冷缺血時間延長而繼續(xù)升高，因此熱缺血脂肪肝不耐受缺血缺氧損傷的表現(xiàn)更加明顯。因此，對于正常肝臟30 min的熱缺血和12 h的冷缺血并未引起肝臟明顯的代謝異常，肝臟對缺血缺氧的耐受能力以及修復(fù)能力可以使其仍能基本維持一個比較正常的代謝狀態(tài);但是,脂肪肝對缺血缺氧損傷的耐受力差，無法完成這種適應(yīng)性調(diào)節(jié)，代謝相關(guān)指標(biāo)水平改變顯著，缺氧狀態(tài)明顯。

甘油可反映細(xì)胞損傷，其主要在脂肪酸和磷脂代謝中釋放。磷脂是細(xì)胞膜的主要成分，能量缺乏使鈣內(nèi)流和磷脂酶類激活，導(dǎo)致甘油從細(xì)胞膜磷脂中脫離，甘油釋放意味著細(xì)胞膜損傷[16]。研究表明，連續(xù)監(jiān)測肝臟透析液中的甘油水平能夠在移植前評估細(xì)胞膜損傷程度[17]。本研究結(jié)果顯示，隨著冷缺血時間的延長，C0組透析液甘油水平先降低后升高，其余各組均呈升高趨勢；與C0組同時間點比較，其余各組冷缺血1～12 h透析液甘油水平均升高，以F30組升高最明顯；這說明脂肪肝和熱/冷缺血均會導(dǎo)致肝細(xì)胞膜損傷，且多種損傷因素同時存在會加重肝損傷。因此，在冷缺血中加強對肝細(xì)胞膜的保護(hù)可以減輕肝功能損傷，改善肝移植患者預(yù)后。甘油水平監(jiān)測有助于更好地評估肝移植過程中肝臟總體的損傷情況，早期評估肝臟質(zhì)量可避免使用較差質(zhì)量的移植肝進(jìn)行移植。

綜上所述，脂肪肝大鼠熱缺血后透析液葡萄糖水平降低，乳酸/丙酮酸、甘油水平升高，并隨冷缺血時間延長而加?。恢咀兒腿毖鶗斐筛渭?xì)胞損傷和肝臟代謝能力下降，兩種因素共同作用可導(dǎo)致肝損傷加重。微透析技術(shù)可以定量、敏感、持續(xù)并快速檢測供體損傷情況，是移植前供肝質(zhì)量評估實時、準(zhǔn)確的評價方法，值得推廣。