梁濱，肖永生，李榮霖

(天津市寧河區(qū)醫(yī)院，天津301500)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其臨床治療方法主要以外科手術為主，并輔助放療、化療等[1]。放、化療藥物在某種程度上能夠抑制乳腺癌的發(fā)展，但其不良反應較大，在殺死腫瘤細胞的同時對機體正常細胞也會造成損傷，并且易產(chǎn)生耐藥性[2,3]。因此，從天然產(chǎn)物中尋找高效且不良反應小的抗乳腺癌藥物是近年來研究的熱點。山奈素是一種在高等植物中廣泛存在的黃酮類化合物，具有降血壓、降血脂、祛痰等多種功效。目前，山奈素對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響及其相關機制均鮮見報道。為此，我們于2018年6月～2019年4月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌MCF7細胞購于中國科學院上海細胞庫。山奈素購于上海純優(yōu)生物科技有限公司，有絲分裂原活化蛋白激酶(Ras/Raf/MEK/ERK)信號通路抑制劑索拉菲尼(sorafenib)購于美國Glpbio公司，Ras/Raf/MEK/ERK信號通路激活劑ML-099購于上海偉寰生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購于北京雷根生物技術有限公司，RIPA裂解液和BCA蛋白測定試劑盒購于中國碧云天生物技術研究所，磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(p-Raf-1)、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)和β-肌動蛋白(β-actin)抗體均購于美國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出MCF7細胞凍存管，37 ℃水浴快速融合，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。加入適量PBS混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入適量PRMI1640培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入適量含10% FBS的PRMI1640培養(yǎng)基，混懸后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合至80%～90%時，胰酶消化，傳代培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

1.3 山奈素濃度篩選 采用MTT法。取對數(shù)生長期的MCF7細胞，調(diào)整細胞密度為2.5×104/mL，每孔200 μL接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2、97%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后分為兩部分，一部分分別加入含終濃度為25、50、75、100 μg/mL山奈素[4]的培養(yǎng)基，另一部分加入等量PRMI1640培養(yǎng)基。兩部分細胞分別于培養(yǎng)12、24、48、72 h，每孔加入濃度為5 g/L的MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。吸棄培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜溶液150 μL，孵育5 min，混合均勻。于全自動酶標儀檢測490 nm波長處的光密度(OD)值，計算細胞增殖抑制率。結果顯示，加入75 μg/mL山奈素作用48 h后細胞增殖抑制率為54.39%±1.73%，達到半數(shù)有效劑量。因此，選擇75 μg/mL山奈素作用48 h作為后續(xù)研究的實驗條件。

1.4 細胞分組處理 取對數(shù)生長期的MCF7細胞，細胞貼壁后分為山奈素組、sorafenib組、ML-099+山奈素組、空白對照組，分別加入含75 μg/mL山奈素的培養(yǎng)基、含10 μmol/L sorafenib[5]的培養(yǎng)基、含5 μmol/L ML-099[6]與75 μg/mL山奈素的培養(yǎng)基、等量PRMI1640培養(yǎng)基。

1.5 細胞增殖抑制率檢測 各組培養(yǎng)48 h，參照1.3采用MTT法檢測細胞增殖抑制率。

1.6 細胞凋亡能力檢測 采用流式細胞術。各組培養(yǎng)48 h，吸棄上清液，預冷的PBS清洗細胞，胰酶消化后收集細胞。調(diào)整細胞密度為1×106/mL,取0.5 mL細胞懸液于1.5 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入195 μL的Annexin V-FITC結合液重懸細胞，再加入5 μL的Annexin V-FITC結合液，輕輕吹打均勻，室溫條件下避光反應15 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入190 μL的Annexin V-FITC結合液重懸細胞，再加入10 μL PI，輕輕吹打均勻，冰浴避光反應15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 細胞Raf-1、ERK、Cyclin D1、Caspase-3 mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。各組培養(yǎng)48 h，胰酶消化并收集細胞。PBS清洗，加入TRIzol試劑提取總RNA。紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度合格后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進行PCR擴增。Raf-1上游引物5′-GGAGCTTGGAAGACGATCAG-3′，下游引物5′-CTCCGTGCCATTTACCCTTA-3′，引物長度1 096 bp；ERK上游引物5′-TCATAGGCATCCGAGACATC-3′，下游引物5′-TGGTAGAGGAAGTAGCAGA TG-3′，引物長度186 bp；Cyclin D1上游引物5′-GCATGTTCGTGGCCTCTAAGA-3′，下游引物5′-CGGTGTAGATGCACAGCTTCTC-3′，引物長度246 bp；Caspase-3上游引物5′-AAAGTGCCTGGACGCGCGTT-3′，下游引物5′-AGTGGGCCGCCTGGAGAGG-3′，引物長度238 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-CTGGGACGACATGGACAAAA-3′，下游引物5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′，引物長度180 bp。PCR擴增條件：95 ℃、10 min，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共45個循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法計算Raf-1、ERK、Cyclin D1、Caspase-3 mRNA相對表達量。

1.8 p-Raf-1、p-ERK、Cyclin D1、Caspase-3蛋白表達檢測 采用Western blotting法。各組培養(yǎng)48 h，胰酶消化并收集細胞。PBS清洗后，加入不含蛋白酶的RIPA裂解液，置于冰上裂解，時間30 min。4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，收集上清液即為蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，蛋白變性后行SDS-PAGE電泳。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入p-Raf-1(1∶600)、p-ERK(1∶800)、Cyclin D1(1∶400)和Caspase-3(1∶200)一抗，4 ℃孵育12 h。次日洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的IgG(1∶200)，室溫孵育1 h。再次洗膜，加入ECL化學發(fā)光試劑，避光顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。采用Image Pro Plus6.0軟件分析蛋白條帶的灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率及細胞凋亡率比較 見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率及細胞凋亡率比較

注：與山奈素組比較，*P<0.05；與sorafenib組比較，#P<0.05；與ML-099+山奈素組比較，△P<0.05。

2.2 各組細胞Raf-1、ERK、Cyclin D1、Caspase-3 mRNA表達比較 見表2。

表2 各組細胞Raf-1、ERK、Cyclin D1、Caspase-3 mRNA相對比表達量比較

注：與山奈素組比較，*P<0.05；與sorafenib組比較，#P<0.05；與ML-099+山奈素組比較，△P<0.05。

2.3 各組細胞p-Raf-1、p-ERK、Cyclin D1、Caspase-3蛋白表達比較 見表3。

表3 各組細胞p-Raf-1、p-ERK、Cyclin D1、Caspase-3蛋白相對比表達量比較

注：與山奈素組比較，*P<0.05；與sorafenib組比較，#P<0.05；與ML-099+山奈素組比較，△P<0.05。

3 討論

乳腺癌具有較高的發(fā)病率和病死率，已成為嚴重威脅女性健康的“頭號殺手”。近年來乳腺癌患者的治療效果有了較大改善，但放、化療藥物具有較大的不良反應和腫瘤耐藥性，因此尋找新的高效、低毒藥物成為研究者們關注的熱點[7]。研究顯示，從天然植物中提取的黃酮類化合物具有較好的抗腫瘤作用，如槲皮素可通過抑制STAT通路抑制膠質(zhì)瘤干細胞增殖并促進其凋亡[8,9]。木犀草素可能通過激活p53信號通路、上調(diào)miR-34a-5p表達，發(fā)揮抑制肺癌細胞增殖并促進其凋亡的作用[10]。芹菜素可抑制乳腺癌多藥耐藥MCF-7/ADR細胞的增殖，誘導其凋亡，具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥的作用[11]。山奈素作為一種黃酮類化合物，也表現(xiàn)出了一定的抗腫瘤作用，但目前其對乳腺癌細胞的作用機制鮮見報道。本研究結果顯示，山奈素可抑制乳腺癌MCF7細胞增殖并促進其凋亡，具有濃度和時間相關性，提示山奈素可能是乳腺癌治療的潛在藥物。其中加入75 μg/mL山奈素作用48 h后細胞增殖抑制率為54.39%±1.73%，達到半數(shù)有效劑量，因此選擇75 μg/mL山奈素作用48 h作為后續(xù)研究的實驗條件。

Raf-1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與促進有絲分裂信號從細胞膜到細胞核的轉(zhuǎn)導，在細胞增殖相關信號轉(zhuǎn)導途徑中發(fā)揮重要作用，與腫瘤發(fā)生、細胞周期調(diào)控及細胞凋亡等密切相關[12]。ERK屬于酪氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有ERK1和ERK2兩種亞型。MEK屬于MAP2K家族成員，其作用是磷酸化并激活下游底物ERK1/2[13]。Cyclin D1是調(diào)控細胞周期G1期的關鍵蛋白，其表達升高可促使細胞由G1期向S轉(zhuǎn)換，促進細胞增殖[14]。Caspase級聯(lián)反應參與細胞的凋亡過程，Caspase-3是細胞凋亡的“執(zhí)行者”，其表達升高可促進細胞凋亡[15]。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[16,17]。Ras募集并激活Raf，激活后的Raf可促進MEK1/2和ERK1/2激活，激活后的ERK1/2可調(diào)節(jié)多個轉(zhuǎn)錄因子，引起不同基因表達。Raf/MEK/ERK通路激活后，p-Raf-1、p-MEK、p-ERK蛋白表達增加，促進Cyclin D1與CDK4/6結合形成復合體并激活CDK，加速細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而促進細胞增殖，引起腫瘤發(fā)生[18]。本研究結果顯示，sorafenib 組細胞增殖抑制率及細胞凋亡率均高于空白對照組，說明Ras/Raf/MEK/ERK信號通路參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展；山奈素組細胞Raf-1、ERK、Cyclin D1 mRNA及蛋白相對表達量均低于ML-099+山奈素組、空白對照組，Caspase-3 mRNA及蛋白相對表達量均高于ML-099+山奈素組、空白對照組，說明山奈素可下調(diào)乳腺癌細胞Ras/Raf/MEK/ERK信號通路相關基因和蛋白表達，Ras/Raf/MEK/ERK信號通路激活劑的加入可降低山奈素對該信號通路的影響。因此，抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號通路可能是山奈素抑制乳腺癌細胞增殖并促進其凋亡的機制之一。

綜上所述，山奈素能在一定程度上抑制乳腺癌細胞增殖和促進其凋亡，其可能通過抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的激活而發(fā)揮作用，是乳腺癌治療的潛在藥物。但是，山奈素是否通過其他通路發(fā)揮抗乳腺癌作用仍有待深入研究。