孫紅爽 乜春城 李鵬霖 劉永雙 高玲娜
(衡水市人民醫(yī)院,河北 衡水 053000)
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一種與胰島素抵抗、糖尿病、肥胖等代謝高危因素密切相關(guān)的應(yīng)激性肝損傷,主要病理特征為脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)的過度沉積〔1〕。根據(jù)NAFLD的病程發(fā)展可以分為單純性脂肪肝變性、脂肪性肝炎、肝臟纖維化、肝硬化及肝癌〔2〕。目前對于NAFLD的治療并沒有特效制劑,生活方式的改變是首要的,藥物治療多是針對其并發(fā)癥如肥胖、糖尿病、血脂紊亂、高血壓和炎癥等〔3〕。前期研究,通過高熱量飼料結(jié)合慢性應(yīng)激成功建立NAFLD大鼠模型,該模型伴隨明顯的氧化應(yīng)激和下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)亢進(jìn)〔4,5〕。因此,本研究主要從改善這兩方面病變進(jìn)行針對性藥物治療,選用“萬能抗氧化劑”α-硫辛酸(LA)或抑制促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)釋放藥物賽庚啶(CYP)分別對高脂飼料結(jié)合慢性應(yīng)激引起的大鼠NAFLD模型進(jìn)行藥物治療,以觀察兩種藥物對NAFLD模型的治療作用特點。
1.1試劑與儀器 總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)測定試劑盒均購自長春匯力生物技術(shù)有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、游離脂肪酸(FFA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子(TNF)放射免疫分析試劑盒、皮質(zhì)醇放射免疫分析試劑盒、ACTH放射免疫分析試劑盒均購自北京北方生物技術(shù)研究所; T6紫外分光光度計購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;M-96型16管手動放射免疫γ計數(shù)器購自合肥眾成生物工程設(shè)備有限公司;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(GeneAmp PCR System 9600)購自美國Applied Biosystems公司。
1.2動物與分組 32只Wistar雄性大鼠,清潔級,購自揚州大學(xué)實驗動物中心,體重150~200 g,生產(chǎn)許可證號:SCXK滬2002-0002。動物單籠恒溫(23±2)℃、恒濕(60%±5%)飼養(yǎng),明暗周期12 h,自由飲水取食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,所有大鼠隨機分為對照組、模型組、LA組、CYP組各8只。對照組喂以普通飼料,其他3組喂以自制高脂飼料并輔以慢性應(yīng)激刺激。高脂飼料配方為22%豬油+8%糖+2%膽固醇+2%食鹽+66%基礎(chǔ)飼料。慢性應(yīng)激刺激采用足底電擊輔以噪聲刺激的方式,每日上、下午各2 h,方法同前期研究〔6〕。連續(xù)刺激8 w后,各組在高熱量飼料結(jié)合慢性應(yīng)激刺激的同時,LA組以100.0 mg/(kg·d)LA灌胃,CYP組以2.30 mg/(kg·d)CYP灌胃。所用藥物以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配成相應(yīng)濃度的混懸液,模型組及對照組灌胃給以相同體積的0.5%CMC-Na 溶液,均給藥4 w。
1.3肝指數(shù)的測定 給藥4 w后禁食12 h,稱重,腹腔注射20%烏拉坦注射液麻醉(0.5 ml/100 g)。頸動脈插管取血,全血3 500 r/min離心10 min獲得血清,-20℃冰箱保存。取肝臟,以4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗,濾紙吸干表面水分,稱取肝臟重量。肝指數(shù)(HI)=肝臟重量(g)/體重(g)×1000。
1.4血液學(xué)指標(biāo)的測定 血清皮質(zhì)醇、ACTH和TNF-α用DFM-96型16管放射γ免疫計數(shù)器檢測;血清TC、TG、HDL-C及FFA用比色法檢測;MDA用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測,SOD用羥胺法檢測。
1.5肝臟生化指標(biāo)的測定 0.2 g肝組織放入2 ml生理鹽水中,4℃下勻漿,制成10%肝組織勻漿,3 000 r/min離心15 min,獲得上清液,于-20℃冰箱保存。用于測定肝組織TC、TG、FFA、SOD、MDA及TNF-α含量,測定方法參照試劑盒說明書。
1.6肝臟TNF-α mRNA表達(dá)的檢測 新鮮肝組織100 mg,用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)漂洗,-80℃冰箱凍存,用于測定肝臟TNF-α mRNA表達(dá)。TNF-α引物:上游5′-CAGACCCTCACACTCAGATCA-3′,下游5′ TCTCCTGGTATGAAATGGCA,引物長度270 bp。PCR反應(yīng)條件為94℃,30 min預(yù)變性,然后94℃ 30 s;55℃ 30 s;72℃ 30 s;運行30個循環(huán),最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,全自動凝膠成像分析系統(tǒng)灰度掃描,計算各組相對灰度。相對灰度=各組泳道灰度/對應(yīng)泳道內(nèi)參灰度。
1.7肝組織形態(tài)學(xué)觀察 將動物新鮮肝組織在4℃的PBS中反復(fù)漂洗,在10%中性甲醛中固定,酒精梯度脫水,切片,蘇木素-伊紅(HE)染色。參照NASH臨床研究評分系統(tǒng)〔7〕,從5個方面評價肝組織病變程度,即脂肪變性(肝細(xì)胞脂肪變性<5%計0分,5%~33%計1分,34%~66%計2分,>66%計3分)、小葉炎癥(放大200倍視野下,無炎癥計0分,炎癥<2個計1分,2~4個計2分,>4個計3分)、匯管區(qū)炎癥(在低放大倍數(shù)下無到極輕的炎癥計0分,大于極輕的炎癥計1分)、肝細(xì)胞氣球樣變(無計0分,少數(shù)細(xì)胞氣球樣變計1分,多數(shù)細(xì)胞氣球樣變或顯著的氣球樣變計2分)和肝組織纖維化(竇周狀或門靜脈周圍的計1分,弱的、3區(qū)、竇周狀的計1分,中等的、3區(qū)、竇周狀的計1分,門靜脈或門靜脈周圍的計1分,竇周狀的和門靜脈/門靜脈周圍的計2分,橋連的纖維化計3分,硬化計4)。參照Matteoni等〔8〕的建議將病理切片進(jìn)行分為4個級別:1級,單純肝細(xì)胞脂變;2級,肝細(xì)胞脂變并伴小葉炎癥;3級,肝細(xì)胞脂變并伴氣球樣變;4級,肝細(xì)胞脂變并伴氣球樣變、肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)Mallory小體或肝纖維化。
1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗。
2.1各組給藥4 w后HI比較 與對照組〔(23.12±1.13)mg/g〕比較模型組〔(25.71±1.09)mg/g〕、LA組〔(24.57±1.53)mg/g〕及CYP組HI〔(25.16±0.89)mg/g〕均明顯增大(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,LA組及CYP組HI均無明顯差異(P>0.05)。提示,LA或CYP治療對HI的增大沒有明顯的抑制作用。
2.2血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果
2.2.1表示HPA軸激活程度的指標(biāo)——血漿皮質(zhì)醇和ACTH 與對照組比較,模型組、LA組及CYP組皮質(zhì)醇、ACTH濃度均明顯升高(P<0.01),CYP組顯著小于模型組(P<0.01),但LA組與模型組無明顯差異(P>0.05)。見表1。
2.2.2氧化應(yīng)激指標(biāo)——血清SOD及MDA 與對照組比較,模型組、LA組及CYP組 SOD活力均明顯下降(P<0.05,P<0.01),MDA濃度均明顯升高(P<0.01);LA組SOD活力明顯高于模型組且MDA濃度明顯低于模型組(P<0.01);CYP組SOD活力與模型組無明顯差異(P>0.05),但MDA濃度明顯小于模型組(P<0.05)。見表1。
2.2.3血脂檢測結(jié)果 與對照組比較,模型組及CYP組TC濃度明顯升高(P<0.01,P<0.05),模型組TG濃度明顯升高(P<0.01),各組HDL-C均明顯下降(P<0.01);與模型組比較,LA組及CYP組TC濃度均明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),CYP組TG濃度明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),LA組和CYP組HDL-C與模型組無明顯差異(P>0.05)。見表1。
2.2.4血液FFA檢測結(jié)果 與對照組比較,模型組、LA組及CYP組血FFA濃度均明顯升高(P<0.01);LA組及CYP組明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
2.2.5血漿TNF-α檢測結(jié)果 與對照組比較,模型組、LA組及CYP組TNF-α濃度均明顯升高(P<0.01);LA組及CYP組明顯低于模型組(P<0.01)。見表1。
表1 治療后4組生化指標(biāo)比較
與對照組比較:1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較:3)P<0.05.4)P<0.01;下表同
2.3肝組織生化指標(biāo) 與對照組比較,模型組、LA組及CYP組肝組織TNF-α含量均明顯升高(P<0.01);與模型組比較,LA組及CYP組肝組織TNF-α均明顯下降(P<0.01)。與對照組比較,模型組、LA組及CYP組肝組織SOD活力均明顯下降(P<0.01),MDA含量均明顯升高(P<0.05,P<0.01);LA組SOD活力明顯高于模型組(P<0.01),CYP組則與模型組無明顯差異(P>0.05),而LA、CYP組MDA含量均明顯低于模型組(P<0.05,P<0.01)。與對照組比較,模型組及CYP組肝組織TC、TG含量明顯升高(P<0.01);與模型組比較,LA組TC、TG含量均明顯低于模型組(P<0.01),CYP組兩指標(biāo)與模型組無明顯差異(P>0.05)。與對照組比較,模型組、LA組及CYP組肝組織FFA含量明顯升高(P<0.05,P<0.01);LA組及CYP組明顯低于模型組(P<0.01)。見表2。
表2 治療后各組肝組織生化指標(biāo)比較
2.4肝組織TNF-α mRNA表達(dá) 與對照組(0.052±0.008)比較,模型組(0.043±0.004)及LA組TNF-α mRNA表達(dá)(0.137±0.022)顯著升高(P<0.01),CYP組(0.085±0.005)與對照組無在顯著差異(P>0.05);與模型組比較,LA組及CYP組TNF-α mRNA表達(dá)均明顯下降(P<0.05,P<0.01)。見圖1。
圖1 肝組織TNF-α mRNA表達(dá)
2.5肝組織切片觀察 對照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、清晰,肝小葉結(jié)構(gòu)清楚,所有動物都未顯示有病變跡象;模型組8只動物中有7只存在輕度或中度脂變,4只有匯管區(qū)輕度炎癥,3只有輕度肝細(xì)胞氣球樣變,4只有輕度肝纖維化,所有動物均未見小葉炎癥;LA組8只動物中有5只出現(xiàn)輕度脂變,2只出現(xiàn)輕度匯管區(qū)炎癥,2只有輕度肝細(xì)胞氣球樣變,3只有輕度肝纖維化,所有動物均未發(fā)現(xiàn)小葉炎癥;CYP組8只動物1只有輕度脂變,1只有肝纖維化,而所有動物均未見小葉炎癥、匯管區(qū)炎癥及肝細(xì)胞氣球樣變形。見圖2。
圖2 各組肝組織切片(HE染色)
LA是一種超強生物抗氧化劑,兼具親水和親脂兩種特性,在水溶性和脂溶性環(huán)境中均有較好的抗氧化作用。LA易經(jīng)消化道吸收,在體內(nèi)部分轉(zhuǎn)化為抗氧化活性更強的二氫硫辛酸(DHLA),分布到機體組織中發(fā)揮抗氧化作用,并且可以通過血腦屏障,減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氧化損傷。LA的抗氧化作用主要體現(xiàn)在以下3個方面:①清除自由基和活性氧:LA 能夠有效清除羥基及一氧化氮自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧、次氯酸及過氧化亞硝基。雖然LA 不能清除超氧自由基和過氧化物自由基,但DHLA對單線態(tài)氧以外的其他自由基均有清除作用。由于體內(nèi)LA和DHLA同時存在,因此,上述所有自由基均可被有效清除;②鰲合金屬離子:LA能夠螯合Fe、Cu及其他過渡金屬元素(Mn2+、Cd2+、Zn2+等),減少細(xì)胞內(nèi)羥基自由基(·OH)的產(chǎn)生,進(jìn)而阻斷脂質(zhì)過氧化;③再生內(nèi)源性抗氧化劑:LA和 DHLA在體內(nèi)的相互轉(zhuǎn)化能再生維生素C、維生素E、谷胱甘肽、硫氧還原蛋白及泛醌等抗氧化劑,使這些抗氧化劑由氧化型轉(zhuǎn)化為還原型〔9〕。
自1980 年德國的Sachse首次將LA應(yīng)用到臨床后,該藥逐漸引起醫(yī)學(xué)界重視,僅糖尿病領(lǐng)域,人們已廣泛應(yīng)用LA的強抗氧化應(yīng)激能力,保護(hù)β細(xì)胞,延緩其衰減,減輕對其的攻擊;保護(hù)肌肉、脂肪細(xì)胞,增強對葡萄糖的利用,增強胰島素敏感性;保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞,改善糖尿病神經(jīng)病變;保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞,減少動脈粥樣硬化等〔10,11〕。近年來也有學(xué)者嘗試將LA應(yīng)用于NAFLD的治療,結(jié)果顯示LA可從多個環(huán)節(jié)阻止氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng),從而改善大鼠肝功能,是治療脂肪肝的有效藥物〔12,13〕。
CYP是一種非選擇性5-羥色胺(HT)受體阻斷劑,并且能夠阻斷組胺H1受體,屬于第二代抗組胺藥。CYP通過拮抗中樞特異性5-HT受體,減少促ACTH釋放因子(CRF)的釋放,進(jìn)而使血漿ACTH、皮質(zhì)醇濃度下降,降低HPA軸的反應(yīng)活性,臨床用于治療腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)癥。CYP也可抑制左旋多巴誘發(fā)的ACTH釋放,使血漿ACTH氫化可的松反應(yīng)。此外,研究發(fā)現(xiàn)該藥有鈣通道阻滯、自由基清除、抗感染、解熱鎮(zhèn)痛等作用〔14〕。王冰等〔15〕報道,外源性糖皮質(zhì)激素能引起大鼠HPA軸過度激活,肝脂代謝紊亂,加劇肝臟脂質(zhì)沉積,誘發(fā)大鼠肝脂肪變性。CYP可干擾HPA軸的過度激活,降低血清ACTH和皮質(zhì)醇水平,逆轉(zhuǎn)外源性糖皮質(zhì)激素引起的大鼠肝功能損傷,改善糖脂代謝紊亂。
本研究結(jié)果顯示,LA和CYP對高熱量飼料結(jié)合應(yīng)激引起的大鼠NAFLD均有治療作用,表現(xiàn)為血脂紊亂及肝臟脂質(zhì)沉積改善、血液及肝組織TNF-α表達(dá)降低、氧化應(yīng)激狀態(tài)改善、HI下降。但兩者對該模型的治療效果也存在差異:CYP可明顯抑制HPA軸過分激活,LA不能;LA的抗氧化應(yīng)激效果好于CYP。肝組織切片觀察顯示,CYP治療對該模型肝損傷的改善較明顯,可明顯改善肝脂肪沉積、肝細(xì)胞氣球樣變、匯管區(qū)炎癥等癥狀。本研究只是兩種不同作用機制藥物對NAFLD治療的初步探索,進(jìn)一步研究可觀察兩種藥物對胰島素抵抗、心血管系統(tǒng)損傷及脂肪組織病變等相關(guān)疾病的治療作用,為NAFLD及其相關(guān)疾病的臨床治療提供新思路。