鄭蘭 林貞花 楊洋

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉 133002)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤在成人中是一種最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)發(fā)病率占50%以上〔1〕，是最具侵襲性的亞型，患者中位生存期約18個(gè)月〔2〕。目前GBM的標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括手術(shù)治療、結(jié)合放療和化療〔3〕。然而，由于GBM腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)及受腫瘤部位制約，手術(shù)難以完整切除腫瘤。此外放化療無(wú)法特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，且易耐藥，患者臨床獲益甚微。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)大腦通過(guò)腦膜淋巴管與外周免疫系統(tǒng)相連〔4〕，這一重要發(fā)現(xiàn)使得腫瘤免疫治療有望成為GBM最具前景的治療策略，為其治療提供了新的方向。本文就目前GBM 免疫治療的策略及與臨床試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記物的研究進(jìn)展做一綜述。

1 免疫檢查點(diǎn)抑制劑

T細(xì)胞表面的抑制性受體，即免疫檢查點(diǎn)，可降低T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。免疫檢查點(diǎn)抑制劑可通過(guò)提高免疫檢查點(diǎn)調(diào)解T細(xì)胞活性，從而誘導(dǎo)持續(xù)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)用為晚期癌癥的治療帶來(lái)了近乎革命性的改變。免疫檢查點(diǎn)抑制劑包括程序性細(xì)胞死亡蛋白(PD)-1，其配體PD-L1和4型細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白(CTLA-4)抑制劑，能夠改變?nèi)梭w免疫系統(tǒng)，從正常的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)樵鰪?qiáng)的免疫活化系統(tǒng)。在臨床前研究中檢查點(diǎn)抑制劑顯示出治療GBM的前景。目前美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑包括ipilimumab(CTLA-4 抑制劑)，pembrolizumab和nivolumab(PD-1抑制劑)及durvalumab，atezolizumab和avelumab(PD-L1抑制劑)。PD-1抑制劑聯(lián)合CTLA-4抑制劑〔5〕和放射治療〔6〕能顯著延長(zhǎng)GBM模型小鼠生存期。Checkmate143觀察nivolumab對(duì)復(fù)發(fā)性GBM患者中位總生存時(shí)間(OS)無(wú)改善作用。Filley等〔7〕分析該結(jié)果可能與GBM腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，系統(tǒng)免疫抑制及抗體無(wú)法通過(guò)血腦屏障有關(guān)；在復(fù)發(fā)性GBM中免疫檢查點(diǎn)抑制劑在重新激活免疫細(xì)胞方面效果較差；此外該研究在終止免疫治療前沒(méi)有通過(guò)病理檢查證實(shí)腫瘤復(fù)發(fā)，因很難區(qū)分炎癥治療反應(yīng)和腫瘤進(jìn)展，可能導(dǎo)致過(guò)早終止試驗(yàn)。目前關(guān)于抗LAG3檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合PD-1和CD137抑制劑治療復(fù)發(fā)性GBM的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，結(jié)果尚未公布(NCT02658981)。

2 腫瘤疫苗

一般來(lái)說(shuō)，疫苗將免疫系統(tǒng)暴露在一個(gè)被削弱或被殺死的抗原下，以建立免疫記憶，以抵御未來(lái)任何對(duì)該抗原的暴露。腫瘤疫苗作用機(jī)制與此類似，可利用腫瘤相關(guān)抗原激活特異性T細(xì)胞并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤能力，達(dá)到抑制腫瘤目的。

2.1樹突細(xì)胞(DCs)疫苗 DCs是骨髓來(lái)源淋巴細(xì)胞CD4+和CD8+T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞(APC)，在主要組織相容性復(fù)合體(MHC)環(huán)境下也是自然殺傷(NK)細(xì)胞和NK-T細(xì)胞的激動(dòng)劑。在GBM微環(huán)境中MHC表達(dá)下調(diào)，抗原提呈效率下降〔8〕，使得有效的抗原提呈對(duì)大腦成功的免疫治療至關(guān)重要。在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)外周注射DC疫苗能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的應(yīng)答而不產(chǎn)生自身免疫應(yīng)答；DC疫苗有靶向抑瘤作用，對(duì)正常腦組織無(wú)損傷〔9〕。CD133+細(xì)胞是潛在的腦腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞，也是GBM腫瘤干細(xì)胞常用標(biāo)記物〔10〕，與GBM對(duì)放、化療抵抗及放療后腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)。Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)載有ICT-121的DCs(CD133致敏)能顯著延長(zhǎng)表達(dá)人類白細(xì)胞抗原(HLA)-A2的復(fù)發(fā)性GBM患者的生存期(NCT02049489)。在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中Liau等〔11〕采用自體腫瘤裂解液構(gòu)建的DCVax-L疫苗治療已接受標(biāo)準(zhǔn)放療聯(lián)合莫替唑胺(TMZ)化療的GBM患者，其OS達(dá)到了23.1個(gè)月。大量的臨床試驗(yàn)(NCT01808820、NCT02649582、NCT02529072、NCT01567202、NCT0-1567202、NCT01204684、NCT00639639、NCT02465268)仍在進(jìn)行中。

2.2多肽疫苗 多肽疫苗中被廣泛研究的靶點(diǎn)是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)。在GBM中EGFR高表達(dá)，常發(fā)生突變，其中EGFRRvⅢ截短突變體最為常見(jiàn)。與野生型EGFR比較，EGFRRvⅢ沒(méi)有配體結(jié)合域，因此呈持續(xù)激活狀態(tài)，促進(jìn)GBM發(fā)生，因此EGFRRvⅢ可作為免疫治療的腫瘤特異性靶點(diǎn)。Ⅱ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接受EGFRvⅢ靶向肽類疫苗-Rindopepimut(CDX-110)治療GBM初診患者無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)和OS分別延長(zhǎng)至14.2個(gè)月和26個(gè)月，無(wú)明顯不良反應(yīng)〔12〕。細(xì)胞替代療法(ACT)-Ⅱ試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GBM初診患者接受Rindopepimut與TMZ聯(lián)合治療后生存獲益，但TMZ高劑量治療患者表現(xiàn)為更重的毒性作用，如骨髓移植和淋巴細(xì)胞減少癥。ACT-Ⅲ試驗(yàn)中納入65例GBM初診患者接受Rindopepimut與TMZ聯(lián)合治療，患者PFS和中位OS均延長(zhǎng)，而且85%患者抗EGFRvⅢ抗體滴度升高〔13〕。ACT-Ⅳ試驗(yàn)〔14〕在期中分析后終止，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rindopepimut不能延長(zhǎng)新診斷膠質(zhì)瘤患者OS。ReACTⅡ期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明Rindopepimut+血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)單克隆抗體——bevacizumab能有效延長(zhǎng)GBM復(fù)發(fā)患者PFS〔15〕。除了靶向EGFRvⅢ外，正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)使用針對(duì)多種抗原的疫苗，例如IMA950試驗(yàn)〔16〕靶向11種腫瘤相關(guān)肽，這種多肽方法可以克服針對(duì)單一腫瘤相關(guān)抗原時(shí)常見(jiàn)的抗原丟失。進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)(NCT03223103、NCT02864368、NCT02754362、NCT-02722512、NCT02455557、NCT02287428)仍在進(jìn)行中。

2.3熱休克蛋白(HSPs)疫苗 HSPs能夠廣泛激活先天性和獲得性免疫系統(tǒng)，同時(shí)能夠上調(diào)MHCⅠ和MHCⅡ抗原表達(dá)，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。在HSP家族中，HSP70和HSP96具有護(hù)送抗原轉(zhuǎn)交給APC并結(jié)合至MHC-Ⅰ類分子上的功能。所以當(dāng)HSP96結(jié)合具有腫瘤特異性的抗原多肽，就能夠誘導(dǎo)特異性腫瘤免疫反應(yīng)。Ⅰ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接受HSP96肽復(fù)合物疫苗治療的12例復(fù)發(fā)GBM中有11例腫瘤部位出現(xiàn)免疫應(yīng)答，無(wú)顯著不良反應(yīng)；11例免疫應(yīng)答患者中位OS為47 w，1例無(wú)免疫應(yīng)答患者生存期為16 w〔17〕。Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)疫苗與TMZ聯(lián)合應(yīng)用安全有效〔18〕。此外，PD-L1在遷移的骨髓細(xì)胞中表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫抑制，能夠削弱疫苗的作用。在新診斷的GBM患者中MGMT甲基化、Karnofsky表現(xiàn)評(píng)分(KPS)和PD-L1表達(dá)水平是疫苗有效性的預(yù)后指標(biāo)〔19〕。相關(guān)臨床試驗(yàn)(NCT01814813、NCT02722512、NCT03650257)仍在開展中。

3 ACT

ACT是近年來(lái)備受矚目的治療多種惡性腫瘤的免疫治療方法，發(fā)展迅速。目前已體現(xiàn)出廣泛的治療范圍，包括多種治療方式：腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)免疫治療、T細(xì)胞受體(TCR)治療，嵌合抗原受體(CAR)-T細(xì)胞治療。

3.1TIL治療 TIL存在于腫瘤周圍，具有增強(qiáng)的腫瘤特異性。該治療包括腫瘤切除后TIL收集，擴(kuò)增和白細(xì)胞介素(IL)-2刺激，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)4個(gè)步驟。TIL治療GBM可能是一種很有前景的治療模式，但由于其潛在的毒性作用和細(xì)胞因子釋放綜合征的風(fēng)險(xiǎn)，TIL治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤還需要進(jìn)一步研究。

3.2TCR治療 TCR治療是利用患者外周血中修飾后的T細(xì)胞(表達(dá)腫瘤特異性α和β鏈)增強(qiáng)對(duì)實(shí)體腫瘤的抗原識(shí)別。備受關(guān)注的臨床應(yīng)用包括靶向T細(xì)胞識(shí)別的黑色素瘤相關(guān)抗原(MART)-1(NCT00509288)、黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGE)-A3〔20〕和紐約食管鱗狀細(xì)胞癌抗原(NY-ESO-1)〔21〕。以上研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和滑膜肉瘤患者接受TCR治療后出現(xiàn)部分免疫應(yīng)答細(xì)胞替代療法。目前TCR靶向特異性抗原尚未在GBM中進(jìn)行試驗(yàn)，但這些抗原也存在于GBM中，因此TCR對(duì)其他癌癥的療效值得進(jìn)一步研究〔22〕。

3.3CAR-T細(xì)胞治療 第一代CARs只簡(jiǎn)單設(shè)計(jì)了一個(gè)抗原識(shí)別域，第二代及其后CARs擁有額外的共同刺激域，如CD28和4-1BB能夠降低激活屏障并優(yōu)化受體功能。在GBM中，CAR-T細(xì)胞靶向3種GBM特異性抗原：人類表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)2、IL13Rα2或EGFRvⅢ。

HER2是絡(luò)氨酸激酶受體，在80%GBM患者中過(guò)表達(dá)。在2010年一項(xiàng)應(yīng)用CAR-T細(xì)胞靶向HER2Ⅰ期臨床試驗(yàn)已完成。值得注意的是這些CARs是利用CD28信號(hào)域生產(chǎn)并依據(jù)其自然識(shí)別巨噬細(xì)胞(CMV)的能力進(jìn)行預(yù)選，在GBM微環(huán)境中可能增強(qiáng)這些細(xì)胞的治療效果同時(shí)能靶向CMV相關(guān)肽。該研究共納入16例HER2陽(yáng)性的GBM復(fù)發(fā)患者，二代合成的HER2-CAR CMV-T細(xì)胞治療后1例患者表現(xiàn)部分應(yīng)答，OS>9個(gè)月；7例病情穩(wěn)定，OS達(dá)29個(gè)月；僅7例患者能夠在治療6 w后采集的血液標(biāo)本中檢測(cè)出HER2-CARs，而且其表達(dá)水平持續(xù)下降，說(shuō)明CARs不能在體內(nèi)擴(kuò)增〔23〕。目前如何延長(zhǎng)CAR-T細(xì)胞存活時(shí)間仍是一個(gè)重要挑戰(zhàn)。

IL-13Rα2是另一個(gè)被寄予厚望的抗原，在約75%的GBM患者中表達(dá)。Brown等〔24〕進(jìn)行了一項(xiàng)隊(duì)列研究中納入3例高級(jí)別膠質(zhì)瘤(HGG)患者，利用第一代CAR-T細(xì)胞針對(duì)IL13Rα2經(jīng)顱內(nèi)注射至手術(shù)部位，患者沒(méi)有因缺乏IL13Rα2抗原則被排除?？傮w上所有3例HGG患者在治療后表現(xiàn)為腫瘤中IL13Rα2表達(dá)下調(diào)，復(fù)發(fā)后平均OS為11個(gè)月。隨后該團(tuán)隊(duì)利用第二代IL-13Rα2-41BB共刺激CAR-T細(xì)胞，通過(guò)腔內(nèi)注射、腫瘤內(nèi)注射或心室內(nèi)灌注方法治療復(fù)發(fā)或難治性HGG患者，該研究仍在進(jìn)行中，最終結(jié)果尚未公布。該研究中1例多病灶復(fù)發(fā)的GBM患者被證明完全應(yīng)答，生存7.5個(gè)月。該例患者采用腔內(nèi)灌注治療，直至發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展，此時(shí)房?jī)?nèi)灌注CAR-T細(xì)胞，導(dǎo)致短暫的完全應(yīng)答，但值得注意的是，復(fù)發(fā)最終以遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的形式發(fā)生，表達(dá)較低水平的IL13Rα2。盡管該研究入組患者例數(shù)較少，但為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

針對(duì)EGFRvⅢ的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，目前仍在進(jìn)行(NCT01454596)。該研究發(fā)現(xiàn)10例患者中有7例在治療后再次手術(shù)，3例組織中EGFRvⅢ表達(dá)下調(diào)，2例完全轉(zhuǎn)陰。值得注意的是CAR-T細(xì)胞治療后腫瘤的手術(shù)標(biāo)本的腫瘤微環(huán)境中PD-L1、吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β及FoxP3+Tregs顯著上調(diào)。該結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞適應(yīng)了該CAR-T細(xì)胞治療通過(guò)激活多種免疫抑制通路發(fā)生免疫逃逸。進(jìn)一步的體內(nèi)動(dòng)物模型研究表明，可以通過(guò)其他免疫調(diào)節(jié)療法靶向這種相互免疫抑制從而獲得CAR-T細(xì)胞治療的持久抗腫瘤反應(yīng)〔24〕。

4 病毒療法

病毒治療使用復(fù)制能力強(qiáng)的病毒，盡管是減毒或轉(zhuǎn)基因的，利用溶瘤和非溶瘤機(jī)制的優(yōu)勢(shì)，靶向高級(jí)別GBM。這些病毒治療劑的臨床應(yīng)用面臨一個(gè)實(shí)際的巨大挑戰(zhàn)：既需要能夠通過(guò)血腦屏障達(dá)到充分的血藥濃度，又需要最大限度地降低全身毒性的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)流增強(qiáng)交付(CED)技術(shù)已被用來(lái)克服這些方面的挑戰(zhàn)。PRECISE治療是截至目前唯一完成的Ⅲ期CED治療GBM的評(píng)估。該試驗(yàn)使用了一種突變的銅綠假單胞菌毒素與重組IL-13結(jié)合而成的嵌合細(xì)胞毒素cintredekin besudotox，通過(guò)CED，該細(xì)胞毒素靶向表達(dá)IL-13受體的細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與植入Gliadel晶圓相比，復(fù)發(fā)性GBM的PFS增加，但OS沒(méi)有改善〔25〕。這次試驗(yàn)的失敗可能歸因于不足70%的導(dǎo)管是按照規(guī)定放置的；同時(shí)，盡管CED組達(dá)到了統(tǒng)計(jì)所需的總體存活率的顯著性，對(duì)照組OS比預(yù)期明顯延長(zhǎng)，減少了兩者結(jié)果的差異。經(jīng)CED在復(fù)發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤注入Delta-24-RGD溶瘤病毒的動(dòng)物試驗(yàn)和Ⅰ期臨床試驗(yàn)已完成。研究發(fā)現(xiàn)在接受病毒治療2 w后切除的腫瘤組織中仍有活躍的病毒復(fù)制，但在治療6 w和2.5年后切除的腫瘤組織中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。此外，接受腺病毒治療4 w后切除組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)增強(qiáng)，T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3表達(dá)降低。因?yàn)門IM-3在T細(xì)胞中表達(dá)被認(rèn)為是T細(xì)胞耗竭的標(biāo)志，說(shuō)明治療后促進(jìn)了腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞的功能。與治療后2 w切除的腫瘤組織比較，治療后4 w切除的組織免疫反應(yīng)顯著增強(qiáng)，研究者認(rèn)為腫瘤消退是因?yàn)槔^發(fā)遲發(fā)性免疫反應(yīng)，而不是直接的溶瘤作用〔26〕。

5 未來(lái)的研究方向和生物學(xué)標(biāo)志物

即使是在最成功的癌癥免疫治療試驗(yàn)中，僅一小部分患者獲益。臨床中仍缺乏有效的生物學(xué)標(biāo)志用于預(yù)測(cè)患者對(duì)免疫治療的應(yīng)答。迄今為止在GBM患者中免疫表型分析受到限制，因?yàn)榉治鲞^(guò)程通常依賴于重復(fù)的組織取樣。雖然立體定向活檢的并發(fā)癥發(fā)生率相對(duì)較低，但重復(fù)活檢在膠質(zhì)瘤臨床試驗(yàn)中并不被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)做法，臨床研究中大多沒(méi)有通過(guò)組織檢查確認(rèn)腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展，而免疫治療引起的炎癥反應(yīng)很難與腫瘤進(jìn)展相鑒別。Desjardins等〔27〕報(bào)道GBM患者在溶瘤腺病毒(Delta-24-RGD)治療后其T細(xì)胞內(nèi)TIM-3表達(dá)水平上調(diào)，說(shuō)明該治療促進(jìn)了T細(xì)胞功能。Ali等〔28〕報(bào)道EGFRvⅢ CAR-T細(xì)胞治療后切除的腫瘤組織中PD-L1，IDO和TGF-β及FoxP3+Tregs表達(dá)水平上調(diào)，可能反映了腫瘤的適應(yīng)性和免疫逃逸。然而，低侵入性的血清生物標(biāo)志物也得到了有效的應(yīng)用。在Rindopepimut的Ⅲ期ACT-Ⅳ試驗(yàn)中，研究人員使用EGFRvⅢ抗體的血清滴度來(lái)監(jiān)測(cè)接種后宿主對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)程度〔29〕。Guo等〔30〕自體頭部HSP肽疫苗治療在GBM的Ⅱ期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，外周血髓細(xì)胞PD-L1表達(dá)低的患者總體OS為45個(gè)月，而表達(dá)高的患者OS為18個(gè)月。微量透析技術(shù)在神經(jīng)腫瘤學(xué)中的應(yīng)用是對(duì)GBM患者免疫監(jiān)測(cè)的補(bǔ)充，具有良好的應(yīng)用前景。早期使用腦微透析主要針對(duì)神經(jīng)損傷或蛛網(wǎng)膜下腔出血患者，證明了該技術(shù)的安全性和可行性。目前利用細(xì)胞因子微透析對(duì)復(fù)發(fā)性GBM患者進(jìn)行免疫監(jiān)測(cè)的研究(NCT03493932)正在進(jìn)行。

綜上，GBM是一種高度惡性的疾病，目前尚無(wú)有效治療手段，因此，尋找新的治療策略迫在眉睫。近年來(lái)對(duì)GBM的發(fā)病機(jī)制及其與宿主關(guān)系的研究取得了巨大進(jìn)展。隨著對(duì)免疫功能的系統(tǒng)和腫瘤微環(huán)境的深入了解，為腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)。此外，對(duì)每個(gè)患者特定疾病的深入了解可能有助于改善患者的分類，從而確定最佳的新療法。目前正在開發(fā)的多種免疫治療策略具有越來(lái)越大的潛力，有望從根本上改變GBM患者的治療方式。