鄧必勇 鄧必祥

(貴州省骨科醫(yī)院骨外科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療惡性腫瘤具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其中紫草為紫草科草本植物，有悠久的藥用歷史，主治血熱毒盛、麻疹不透、濕疹、燙傷等。近年隨著對(duì)紫草研究的深入，已明確紫草主要成分是紫草素、紫草寧和其衍生物萘醌類(lèi)化合物〔1〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明紫草素有多種生物活性，如抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗甲狀腺亢進(jìn)、降血糖、抗免疫低下等，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有確切的促凋亡和抑制生長(zhǎng)的效果〔2〕。有研究證明紫草分離物有抗人癌細(xì)胞ECA-109、MGC-803的作用，紫草萘醌類(lèi)衍生物可濃度依賴(lài)性的抑制多種前列腺癌細(xì)胞增殖〔3〕。但天然的紫草類(lèi)化合物存在毒性大或抗瘤作用達(dá)不到理想結(jié)果等不足，仍沒(méi)有在臨床上應(yīng)用。為了增強(qiáng)其抗腫瘤作用及降低毒副作用，黃志紓等〔4〕合成紫草素萘醌類(lèi)衍生物，并證實(shí)半合成的紫草類(lèi)衍生物抗腫瘤作用高于天然紫草類(lèi)化合物。SYUNZ-7是由紫草素天然分離物β-二甲基丙烯阿卡寧基礎(chǔ)上進(jìn)行改造得到〔5〕，本研究擬探討天然紫草素衍生物SYUNZ-7對(duì)腫瘤的作用效果及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株 昆明種小鼠(清潔級(jí)，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK軍2002-001)，體重20～24 g，雌雄各半。BALB/c裸小鼠，4～5周齡，雌雄各半(SPF級(jí)，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)N0003915)。小鼠移植性腫瘤艾氏腹水癌(EAC)、人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63、人肺癌細(xì)胞株GLC-82、人口底癌細(xì)胞株KB、人肝癌細(xì)胞株HepG2、人胃癌細(xì)胞株MGC-803均來(lái)源于貴州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院研究所。

1.2試劑、儀器和樣品 SYUNZ-7由貴州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院改造，在臨床應(yīng)用前需先進(jìn)行溶解，可用二甲基亞砜(DMSO)處理，再通過(guò)雙蒸水稀釋。噻唑藍(lán)(MTT)由上海益啟生物科技有限公司生產(chǎn)，羥基喜樹(shù)堿為黃石李時(shí)珍藥業(yè)集團(tuán)武漢李時(shí)珍藥業(yè)有限公司。第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體為上海臻科生物科技有限公司生產(chǎn)。BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD Biosciences生產(chǎn)，model 550 Microplate reader為(美國(guó))賽默飛/Thermo Fisher產(chǎn)品。

1.3MTT法〔6〕檢測(cè)SYUNZ-7的抗瘤作用 在96孔板上接種以上5種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，每孔0.195 ml，培養(yǎng)4 h，再分別在每孔中將0.39～25.00 μg/ml 5 μl的SYUNZ-7加入，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h在每孔中加入10 μl 5 mg/ml的MTT溶液，測(cè)定前棄去培養(yǎng)液，每孔加入0.1 ml的DMSO。每孔的吸光度(A)值通過(guò)Thermo Fisher550酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)抑制率=(1-用藥組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%公式求出增殖抑制率，半數(shù)抑制濃度(IC50值)通過(guò)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)集法計(jì)算程序可求。

1.4抗小鼠移植性腫瘤 根據(jù)《抗腫瘤藥物藥效學(xué)指導(dǎo)原則》〔7〕進(jìn)行試驗(yàn)，在無(wú)菌條件下抽取小鼠腫瘤EAC細(xì)胞，再用氯化鈉溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尦?.5×107個(gè)/ml。在每只昆明種小白鼠右腋皮下接種0.2 ml，并隨機(jī)分為1、2、4、8 mg/kg不同劑量的SYUNZ-7組、 羥基喜樹(shù)堿陽(yáng)性藥物(HCPT)對(duì)照組(4 mg/kg)、15%DMSO溶液對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組各10只，雌雄各半。在瘤株接種24 h后進(jìn)行腹腔注射給藥，1次/2 d，共5次。給藥完成后的第2日處死小鼠，稱(chēng)體重，分離瘤塊稱(chēng)重，抑瘤率=(1-用藥組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100%，重復(fù)測(cè)量2次，取平均值。

1.5抗人癌裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn) 把體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml，在每只BALB/c裸小鼠右腋皮下接種0.2 ml，待腫瘤生長(zhǎng)可以度量時(shí)，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)。體積=(π/6)×〔(a+b)/2〕3。后根據(jù)腫瘤的大小隨機(jī)將BALB/c裸小鼠分為1、2、4 mg/kg不同劑量的SYUNZ-7組、 HCPT對(duì)照組(5 mg/kg)、15%DMSO溶液對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組各10只，雌雄各半。再進(jìn)行腹腔注射給藥，1次/3 d，共7次。實(shí)驗(yàn)完成時(shí)處死小鼠，稱(chēng)體重，并將瘤塊剝出來(lái)稱(chēng)重，抑瘤率同1.4，重復(fù)測(cè)量2次，取平均值。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè) 收集不同時(shí)間(24、48、72、96 h)處理的MG-63細(xì)胞和不同濃度(1.56、3.12、6.25 μg/kg)處理的SYUNZ-7，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次后以70%濃度的乙醇固定并過(guò)夜，采用10 μmol/L碘化丙啶進(jìn)行細(xì)胞染色，染色5 min，低溫避光0.5 h，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量，BectonDickinson公司LYSIS軟件進(jìn)行分析。

1.7免疫組化法 在上述裸小鼠實(shí)驗(yàn)完成時(shí)，用10%甲醛溶液固定1、2、4 mg/kg不同濃度的SYUNZ-7組、HCPT對(duì)照組、15%DMSO溶液對(duì)照組、裸小鼠NS對(duì)照組的腫瘤組織標(biāo)本，石蠟包埋，3 μm切片。在到0.01 mol/l pH為6.0的枸櫞酸緩沖液中置入脫蠟、水化、封閉處理好的切片。滴加第一抗體兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體20 μl，稀釋成1∶200濃度，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌。滴加生物素標(biāo)記的第二抗體，37℃孵育0.5 h，PBS洗滌，滴加過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉素抗生物素蛋白，37℃孵育0.5 h，洗滌，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，后常規(guī)沖洗，復(fù)染，封片，顯微鏡觀察。根據(jù)Weidner等〔8〕報(bào)道的檢測(cè)方法測(cè)定腫瘤微血管密度(MVD)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SYUNZ-7體內(nèi)抗腫瘤及體外抗增殖活性作用

2.1.1SYUNZ-7對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用 經(jīng)MTT法測(cè)得結(jié)果顯示，SYUNZ-7對(duì)MG-63、GLC-82、HepG2、KB、MGC-803細(xì)胞的IC50值分別為(4.15±0.07)μg/ml、(2.17±0.03)μg/ml、(9.98±0.22)μg/ml、(5.42±0.01)μg/ml、(6.42±0.15)μg/ml，提示SYUNZ-7可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性，見(jiàn)表1。

表1 SYUNZ-7對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率

-代表無(wú)抑制率；表2同

2.1.2SYUNZ-7人骨肉瘤MG-63細(xì)胞裸小鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用 1、2、4、8 mg/kg SYUNZ-7對(duì)小鼠EAC(實(shí)體型)的抑瘤率分別為(40.4±0.2)%、(50.8±2.2)%、(61.2±1.9)%、(65.5±7.2)%。隨著SYUNZ-7劑量的增加對(duì)MG-63細(xì)胞裸小鼠移植瘤的抑瘤率增高，見(jiàn)表2。

表2 SYUNZ-7人骨肉瘤MG-63細(xì)胞裸小鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用

與NS組比較:1)P<0.05;與15%DMSO組比較:2)P<0.05；3)死亡2只

2.2SYUNZ-7誘導(dǎo)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡 經(jīng)流式細(xì)胞儀分析得，MG-63細(xì)胞經(jīng)6.25 μg/ml SYUNZ-7處理24、48、72、96 h和2%DMSO處理72 h的凋亡率分別為27.9%、58.2%、65.0%、71.5%、1.2%。MG-63細(xì)胞經(jīng)1.56、 3.12、6.25、12.50 μg/ml SYUNZ-7處理72 h的凋亡率分別為11.8%、68.1%、70.4%、51.4%。提示SYUNZ-7可濃度依賴(lài)性及時(shí)間依賴(lài)性誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡，但是經(jīng)12.5 μg/ml SYUNZ-7處理的MG-63細(xì)胞72 h凋亡率低于6.25 μg/ml SYUNZ-7處理的，可能和長(zhǎng)時(shí)間及濃度高藥物處理引起MG-63細(xì)胞溶解及壞死相關(guān)。

2.3SYUNZ-7對(duì)MG-63細(xì)胞周期的作用 隨著 SYUNZ-7處理濃度的增加或作用時(shí)間的延長(zhǎng)，MG-63細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例上升，提示 SYUNZ-7對(duì)MG-63細(xì)胞S期至G2/M期轉(zhuǎn)化有阻滯作用，見(jiàn)表3、4。

表3 6.25 μg/ml SYUNZ-7作用MG-63細(xì)胞的周期分布(%，n=5)

表4 不同劑量SYUNZ-7作用MG-63細(xì)胞的周期分布(%，n=5)

2.4SYUNZ-7對(duì)MG-63細(xì)胞裸小鼠移植瘤血管生成的作用 1、2、4 mg/kg SYUNZ-7組的MVD值分別為(20.1±2.8)條/每視野、(15.8±2.6)條/每視野、(13.5±1.7)條/每視野。15%DMSO溶液對(duì)照組、羥基喜樹(shù)堿陽(yáng)性對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組MVD分別為(27.0±2.3)條/每視野、(16.4±2.0)條/每視野、(25.2±2.8)條/每視野。SYUNZ-7各濃度組腫瘤組織中的MVD值均低于15%DMSO溶液對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組(P<0.05)，提示SYUNZ-7可抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞裸小鼠移植瘤血管的生成。

3 討 論

本研究提示SYUNZ-7有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，臨床上對(duì)于GLC-82、HepG2、MG-63、KB人癌細(xì)胞的研究鮮有報(bào)道〔9〕。天然紫草萘醌衍生物天然紫草萘醌衍生物93/637(SA)及萘醌化合物L(fēng)Ⅲ對(duì)體外培養(yǎng)的DU145、PC-3、ECA109等人癌細(xì)胞有強(qiáng)細(xì)胞毒作用〔10〕。表明無(wú)論是紫草萘醌衍生物或化合物均對(duì)多種人癌細(xì)胞有抗癌活性。而關(guān)于體內(nèi)抗瘤作用研究，國(guó)內(nèi)外臨床上相關(guān)研究較少，較為典型的是趙守先〔11〕報(bào)道顯示紫草提取物紫草素A可抗小鼠移植腫瘤S-180、EAC。本研究結(jié)果提示，在不同劑量下SYUNZ-7對(duì)小鼠EAC(實(shí)體型)的抑瘤率均高于30%，且呈劑量依賴(lài)性抑制。2、4 mg/kg SYUNZ-7對(duì)MG-63細(xì)胞裸小鼠均有明顯的抑瘤率。

細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及退化過(guò)程中有重要作用，在大多數(shù)腫瘤組織中均存在細(xì)胞凋亡〔12〕。研究報(bào)道，新疆紫草素對(duì)大腸癌細(xì)胞凋亡有誘導(dǎo)作用〔13〕。本研究結(jié)果也證實(shí)SYUNZ-7對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡有誘導(dǎo)作用，使細(xì)胞周期停滯在S期，但具體通過(guò)什么途徑調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，臨床尚未闡明，本實(shí)驗(yàn)也未深入探討。但紫草素對(duì)惡性黑色素瘤A375-S2細(xì)胞周期研究中發(fā)現(xiàn)存在細(xì)胞周期調(diào)控因子細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶(CDK)4活性降低及P53活性異常增高〔14〕。而Caspase-3激活是紫草衍生物紫草衍生物β-羥基異戊酰紫草素(β-HIVS)對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用機(jī)制之一〔15〕。提示紫草素萘醌衍生物或化合物調(diào)控細(xì)胞周期因子活性與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用密切相關(guān)〔16〕。而關(guān)于SYUNZ-7對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用有待深入探討。新生血管和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖也有重要作用，腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及分化和新生血管的密度密切相關(guān)〔17〕。MVD是臨床上反映腫瘤血管生成的常用客觀指標(biāo)，既往研究報(bào)道，紫草素對(duì)B16黑色素瘤的血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移有抑制作用〔18〕。本研究表明SYUNZ-7可抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞裸小鼠移植瘤血管的生成。綜上，天然紫草素衍生物SYUNZ-7體內(nèi)外抗瘤作用較強(qiáng)，其抗瘤作用機(jī)制可能和抑制腫瘤血管生成、阻滯細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)，從而可抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成及腫瘤細(xì)胞增殖。本研究?jī)H為一個(gè)初步試驗(yàn)，日后可增加毒性試驗(yàn)及瘤譜試驗(yàn)進(jìn)行多作用靶點(diǎn)的研究。