劉娟 商黔惠，2 李璐 趙宇

(1遵義醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究所 心血管病研究所 高血壓研究室，貴州 遵義 563003；2遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科)

鹽是高血壓的重要易患因素之一，高鹽攝入可使大鼠血壓升高，同時出現(xiàn)血管纖維化和(或)心肌纖維化(MF)，增加心血管病的發(fā)生率〔1，2〕。研究證實，整體實驗中高鹽不僅可導(dǎo)致動物血壓升高，且可引起心血管、腎等重要靶器官的損傷〔3～6〕，鹽負荷加劇了各靶器官的損傷〔7，8〕。MF是多因素導(dǎo)致的心肌纖維持續(xù)性和反復(fù)加重的結(jié)果，是長期高血壓等疾病后心肌的代償性改變，主要表現(xiàn)為細胞增殖及膠原合成或分泌增加。長期高鹽飲食可誘導(dǎo)MF的發(fā)生〔9，10〕，MF后易誘發(fā)心力衰竭等的發(fā)生，加劇MF患者的死亡率〔11〕。心臟成纖維細胞(CFs)占心臟間質(zhì)細胞總數(shù)的60%～70%〔12〕，參與細胞外基質(zhì)合成和代謝〔13〕。CFs在外界病理因素的刺激下，可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，激活的肌成纖維細胞增殖和分泌細胞外基質(zhì)的能力增強，進而加劇MF〔14〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1主要由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞等細胞合成，可控制多種細胞的增殖、分化及刺激細胞外基質(zhì)的分泌。磷酸化smad2/3(p-smad2/3)是其下游信號分子，介導(dǎo)TGF-β1促纖維化的效應(yīng)，smad7在該信號通路中主要發(fā)揮負性調(diào)控作用〔15〕。TGF-β1/smads通路是纖維化發(fā)生的重要分子機制〔16〕。課題組前期實驗表明，8%高鹽誘導(dǎo)的Wistar大鼠左心室纖維化模型中心肌細胞增大，膠原容積分數(shù)增大，其機制與TGF-β1/smads表達異常相關(guān)〔5，17，18〕。那么，在體外實驗中，高鹽是否能夠誘導(dǎo)CFs增殖和膠原分泌增加呢？是否會引起TGF-β1/smads信號通路蛋白表達異常？本研究旨在通過體外誘導(dǎo)實驗，以SD乳鼠CFs為研究對象，對高鹽致CFs增殖的Na+濃度、作用時間及膠原分泌進行初步研究，分析高鹽誘導(dǎo)CFs發(fā)生增殖及導(dǎo)致膠原分泌增加的可能機制，以期為相關(guān)實驗提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料 雄性SD大鼠12只，雌性SD大鼠24只，體重200 g左右〔許可證號為：SCXK-(渝)2012-0005〕，購買于中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心，購買后進行合籠配種，取1～3天齡乳鼠進行細胞培養(yǎng)；DMEM培養(yǎng)基購買于美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自南美MRC；CCK-8細胞增殖試劑盒購自凱基生物；波形蛋白、TGF-β1、p-smad3、smad7一抗購買于美國Santa Cruz公司；二抗購于中國Proteintech公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.2實驗動物倫理 本方案經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院動物實驗倫理會審查，遵循動物福利和倫理原則，審查編號倫審〔2016〕2-067號。

1.3乳鼠CFs的培養(yǎng)及鑒定 3天齡乳鼠無菌條件下于超凈臺上開胸取出心臟，剔除心臟結(jié)締組織，留取心尖部并剪碎〔19〕，0.125%胰酶消化20 min，終止消化，1 500 r/min離心5 min，棄上清，再用0.75 mg/ml膠原酶Ⅱ于37℃消化2 h，終止消化后再次1 500 r/min離心5 min，棄上清，貼壁培養(yǎng)90 min，棄去尚未貼壁的細胞懸液，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，倒置相差顯微鏡下觀察乳鼠CFs的生長狀況。波形蛋白免疫熒光法進行細胞鑒定。選取狀態(tài)良好的第4代CFs用于后續(xù)實驗。

1.4CCK-8測高鹽對乳鼠CFs增殖的影響并篩選促CFs增殖的最佳Na+濃度和作用時間 胰酶消化乳鼠CFs后，制備(3～5)×104個/ml的細胞懸液，每孔100 μl接種在96孔板中，血清饑餓法同步化24 h后，于DMEM培養(yǎng)基中加入相應(yīng)NaCl，使培養(yǎng)基中Na+濃度范圍在146～176 mmol/L，梯度3 mmol/L，共分11組，培養(yǎng)基中Na+終濃度146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176 mmol/L(對應(yīng)的NaCl濃度分別為：131.8、134.5、137.1、139.9、142.6、145.3、148.0、150.7、153.4、156.1、158.8 mmol/L)，加入培養(yǎng)基的NaCl分別為：1.39、1.56、1.74、1.92、2.09、2.27、2.44、2.62、2.79、2.97、3.14 mg/ml；對照組培養(yǎng)基Na+終濃度139 mmol/L為培養(yǎng)基中原有濃度，對應(yīng)的NaCl濃度110 mmol/L。各組分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔加入增殖檢測液10 μl，37℃孵育3 h，波長450 nm處測定OD值。根據(jù)CCK-8結(jié)果確定促CFs增殖的最佳Na+濃度和作用時間，進行后續(xù)實驗。

1.5CCK-8增殖試劑盒檢測滲透壓對乳鼠CFs增殖的影響 CFs接種數(shù)量及同步化同1.4，根據(jù)1.4結(jié)果分為對照組(培養(yǎng)基Na+終濃度139 mmol/L)、高鹽組(培養(yǎng)基Na+終濃度161 mmol/L)、甘露醇組(甘露醇濃度為29.334 mg/ml，與高鹽組等滲，滲透壓為355.55 mOsm/kg)，培養(yǎng)48 h，每孔加入細胞增殖檢測液10 μl，37℃孵育3 h，波長450 nm處測定OD值。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測高鹽對乳鼠CFs中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達的影響 乳鼠CFs以5×105個/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中，同步化及分組同1.5，培養(yǎng)48 h后收集細胞培養(yǎng)上清液，按照酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明進行Ⅰ型及Ⅲ型膠原的測定。

1.7Western印跡檢測高鹽對乳鼠CFs中TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達的影響 細胞以5×105個/ml接種于培養(yǎng)瓶中，同步化及分組同1.5，培養(yǎng)48 h后收集細胞，總蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法行蛋白定量。十二烷基硫代硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進行電泳，電轉(zhuǎn)到0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，4℃孵育TGF-β1、p-smad3、smad7一抗過夜；TBST洗膜，室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜，將ECL化學(xué)發(fā)光試劑加在膜表面后，經(jīng)Bio-Rad凝膠成像儀采集圖像，采用Quantity One定量分析軟件進行積分吸光度測定，目的蛋白的積分吸光度值除以內(nèi)參照GAPDH的積分吸光度值，得到各組蛋白條帶相對值。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1乳鼠CFs的生長形態(tài)及鑒定 CFs在培養(yǎng)60 min后大多數(shù)已貼壁，伸展成梭形，多邊形，乳鼠CFs生長迅速，2～3 d即可進行傳代培養(yǎng)，傳代后CFs鋪滿培養(yǎng)瓶底，平行排列呈峰、谷樣結(jié)構(gòu)特征(圖1)。波形蛋白單克隆抗體免疫熒光鑒定〔17〕結(jié)果顯示乳鼠CFs胞質(zhì)著綠色熒光，4′,6-二脒基-2-苯基嘴哚(DAPI)復(fù)染胞核著藍色熒光，合并圖后胞核清晰可見，見圖2。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察乳鼠CFs的生長狀態(tài)和生長形態(tài)(×100)

圖2 乳鼠CFs 波形蛋白免疫熒光染色(×400)

2.2高鹽誘導(dǎo)乳鼠CFs增殖的時效量效關(guān)系及促CFs增殖的最佳Na+濃度和作用時間 CCK-8結(jié)果顯示，與對照組(培養(yǎng)基Na+終濃度139 mmol/L)比較，培養(yǎng)基Na+終濃度146～176 mmol/L作用48、72 h OD值顯著增高，其中培養(yǎng)基Na+終濃度161 mmol/L作用48 h時CFs增殖效應(yīng)最為明顯，培養(yǎng)基Na+終濃度146～176 mmol/L 培養(yǎng)96 h OD值降低。由此確定，高鹽誘導(dǎo)乳鼠CFs增殖的最佳Na+終濃度為161 mmol/L，適宜的作用時間為48 h。見表1。

2.3滲透壓對乳鼠CFs增殖的影響 選擇促乳鼠CFs增殖最為顯著的培養(yǎng)基Na+終濃度161 mmol/L為高鹽組作用48 h后，高鹽組細胞OD值為1.214±0.154，細胞活性較對照組(OD值為0.857±0.064)和甘露醇組(OD值為0.906±0.119)顯著增高(均P<0.05)，甘露醇組細胞活性與對照組比較未見明顯變化(P>0.05)?？梢?，高鹽組與甘露醇組雖為等滲，但對細胞增殖的影響卻是不同的，高鹽組促進了細胞增殖，但甘露醇組對細胞增殖無影響。

表1 高鹽對乳鼠CFs增殖的影響

與對照組比較：1)P<0.05

2.4高鹽對大鼠CFs Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原分泌的影響 高鹽(培養(yǎng)基Na+終濃度161 mmol/L)作用48 h后，高鹽組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原分泌較對照組和甘露醇組顯著增多(P<0.05)，甘露醇組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原分泌與對照組比較無差異(P>0.05)。見表2。

表2 高鹽對乳鼠CFs膠原分泌的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與高鹽組比較：2)P<0.05；下表同

2.5高鹽對大鼠CFs 中TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達的影響 高鹽組TGF-β1和p-smad3蛋白表達較對照組和甘露醇組顯著增多(P<0.05)，smad7蛋白表達顯著減少(P<0.05)；甘露醇組TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達與對照組比較無差異(P>0.05)。見表3、圖3。

表3 高鹽對乳鼠CFs TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達的影響

圖3 高鹽對乳鼠CFs TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達的影響

3 討 論

MF是指單位質(zhì)量細胞外基質(zhì)(ECM)中膠原含量或膠原容積分數(shù)明顯高于正常值及成纖維細胞增殖的病理表現(xiàn)，它與高血壓、心功能不全、心律失常等疾病密切相關(guān)〔20〕。ECM由膠原、彈性蛋白、纖維蛋白及蛋白聚糖等組成，其主要成分是膠原蛋白，且以Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原為主，二者為參與MF的膠原蛋白類型〔21〕。CFs是心臟組織的主要組成細胞，CFs主要合成的膠原類型為Ⅰ型和Ⅲ型膠原〔13〕。正常生理情況下，成纖維細胞少量分泌膠原蛋白，維持心臟的結(jié)構(gòu)和功能，當(dāng)受到外界病理因素刺激時，CFs處于激活狀態(tài)，重新增殖，并轉(zhuǎn)化成肌成纖維細胞，進而介導(dǎo)膠原蛋白過度沉積，導(dǎo)致MF發(fā)生〔22〕。

食鹽與高血壓的關(guān)系一直為人們所重視，高鹽飲食誘導(dǎo)高血壓及其靶器官損害的防治仍是重要的臨床課題。近年研究發(fā)現(xiàn)，高鹽飲食可誘導(dǎo)高血壓大鼠和正常血壓大鼠心血管纖維化〔6〕。另有體外實驗證實，高鈉鹽培養(yǎng)液能引起血管平滑肌細胞(VSMC)增殖、蛋白合成增加〔23〕，但高鈉鹽培養(yǎng)是否會影響CFs增殖和膠原分泌少見報道。本實驗通過模擬體外高鹽環(huán)境，觀察到當(dāng)鹽濃度到達一定程度時會發(fā)生成纖維細胞增殖，另一方面，同樣的培養(yǎng)基Na+終濃度范圍，當(dāng)培養(yǎng)時間延長至96 h時，OD值降低，表明細胞的死亡可能與時間的延長及濃度的增加有關(guān)，這樣的結(jié)果又會與各種心血管疾病的發(fā)生相關(guān)聯(lián)，故在后續(xù)實驗中選擇培養(yǎng)基Na+終濃度161 mmol/L作為高鹽組進行相關(guān)指標(biāo)檢測。Na+是細胞外液中的主要陽離子，在維持細胞外液晶體滲透壓中的作用不容小覷，本實驗說明高鹽組與甘露醇組雖為等滲，但對細胞增殖的影響卻是不同的，高鹽促進了細胞增殖，與培養(yǎng)基中Na+濃度增加有關(guān)，并非是高鹽所致的滲透壓增高影響了細胞的增殖。課題組前期整體動物實驗結(jié)果顯示，長期給予Wistar大鼠8%高鹽飲食后，發(fā)現(xiàn)大鼠血管周圍和心臟間質(zhì)發(fā)生了明顯的纖維化Masson染色顯示大鼠左心室膠原合成增加〔5〕。本實驗結(jié)果說明膠原分泌的增加與培養(yǎng)基中Na+濃度增加有關(guān)，與高鹽所致高滲透壓無關(guān)。

TGF-β1是強有力的促纖維化的細胞因子〔24〕，參與ECM的合成。TGF-β1 有3種亞型，分別是Ⅰ型(TβR-Ⅰ) 、Ⅱ型(TβR-Ⅱ) 和Ⅲ型(TβR-Ⅲ) ，其中 TβR-Ⅲ是由二硫鍵鏈接的蛋白聚糖，含量最多，與 TGF-β1 結(jié)合后，可將 TGF-β1 傳遞給TβR-Ⅰ或者 TβR-Ⅱ?；罨蟮腡βR-Ⅰ則調(diào)控下游smad2/3磷酸化，磷酸化smad2/3與smad4 結(jié)合形成活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合產(chǎn)物共同進入細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相應(yīng)的靶基因轉(zhuǎn)錄，刺激成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞從而導(dǎo)致器官纖維化的發(fā)生與發(fā)展〔25〕。本實驗說明滲透壓相等的高鹽組與甘露醇組，對CFs中TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達的影響不同，高鹽導(dǎo)致CFs中TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達異常，僅僅與培養(yǎng)基中Na+濃度增加相關(guān)。 綜上所述，高鹽能夠誘導(dǎo)大鼠CFs發(fā)生增殖，當(dāng)Na+濃度161 mmol/L，作用48 h時CFs增殖效應(yīng)最為顯著。高鹽可誘導(dǎo)CFs發(fā)生增殖以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原分泌增加，與培養(yǎng)基中Na+濃度增加有關(guān)，并非是高鹽所致的滲透壓增高影響了細胞的增殖及膠原分泌，其機制可能與培養(yǎng)基中Na+濃度增加導(dǎo)致TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表達異常有關(guān)。