楊銘華，闞秀梅，孫喜娟，晏培杰，宋娜

哈爾濱市兒童醫(yī)院檢驗科，黑龍江 哈爾濱 150010

1 材料與方法

1.1 材料 菌株來源：由實驗室保存和分離的43種臨床常見菌株。主要試劑和儀器：MALDI-TOFMS微生物樣品處理試劑，384目標板，組分I（包括乙腈，甲酸，純水）6,000 μL，組分II（包括乙腈，三氟乙酸，純水）200 μL哥倫比亞血液板，沙寶弱片[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)（Microflex，北京布魯克科技有限公司），生物安全柜（Biobse B2-x），恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher 3111），紅外接種環(huán)滅菌器（UniPower-I），渦旋混合器（GL-88B），緊湊型離心機（LX-300）。

1.2 方法

1.2.1 菌株傳代 將在哥倫比亞血液平板上收集的革蘭氏陽性細菌（16株）和革蘭氏陰性菌（14株）雜交，并將真菌（13株）用沙寶弱板培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)條件：將細菌置于37 ℃，含5%CO2培養(yǎng)箱中18-24小時，并在35 ℃真菌培養(yǎng)箱中制備霉菌24-48小時。

1.2.2 儀器校準 在測試之前，使用單個大腸桿菌ATCC 25922菌落作為儀器校準標準。

1.2.3 提取方法 將20-30 μL組分I加入每個離心管（200 μL）中，從上部菌落中取出單個菌落，并與1 μL無菌接種環(huán)或移液管尖端混合?；旌喜u動5分鐘后，將1 μL樣品加入到靶板中并使其風(fēng)干，加入1 μL組分II以覆蓋樣品點并使其風(fēng)干。每個樣品平行檢測3次[1]。

2 結(jié)果

見表1。

3 討論

在這項研究中，43種臨床分離株以兩種不同的方式進行預(yù)處理，并通過MALDI-TOFMS進行鑒定。結(jié)果表明，MALDI-TOFMS鑒定革蘭氏陽性菌和真菌的準確率明顯高于提取方法后的涂片處理。可以看出，適當?shù)奈⑸镱A(yù)處理可以改善MALDI-TOFMS鑒定。蛋白質(zhì)指紋精確度和穩(wěn)定性以上結(jié)果與趙桂明等的結(jié)果一致直接應(yīng)用快速且易于處理，但對其他細菌代謝物更敏感、更容易變化。但是，甲酸-乙腈提取可以從細菌中提取蛋白質(zhì)。得到的圖中蛋白質(zhì)離子峰的強度是一致的。但提取方法得到的離子峰的信號峰值相對較高，包括更多蛋白質(zhì)標記物[2]。有研究[3]使用直接涂抹和提取方法鑒定和驗證了200株肺炎野生菌株。該比率為100%，通過比較細菌肺炎的特征峰，可以鑒定亞種，為鑒定肺炎克雷伯菌提供了一種快速有效的方法。

表1 臨床分離菌的檢測效果

總之，為了檢測更具體的離子峰并提高蛋白質(zhì)指紋的準確性和可重復(fù)性，本研究提出使用提取方法預(yù)處理微生物樣品。這樣可以優(yōu)化工藝步驟，減少樣品損失，建立標準的微生物檢測過程，并提高質(zhì)譜鑒定的準確性，對未來的檢測工作都具有非凡的意義。