王貝貝，李昊聰，孫文敬,2,*，崔鳳杰,2，王大明，錢靜亞,2，齊方輝

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江莫省德興市百勤異VC鈉有限公司，江莫 德興 334221；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）為桿狀兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，廣泛存在于土壤、水體、植物、動(dòng)物與人體腸道等環(huán)境中，是一種臨床上常見的機(jī)會(huì)致病菌[1-2]。同時(shí)，粘質(zhì)沙雷氏菌又是一種具有廣闊應(yīng)用前景的微生物資源，能夠利用多種可再生碳源發(fā)酵生產(chǎn)許多高附加值的工業(yè)產(chǎn)品[3-6]。其中，利用粘質(zhì)沙雷氏菌轉(zhuǎn)化葡萄糖為2-酮基葡萄糖酸（2-ketogluconic acid，2KGA）的研究已有較多文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]。2KGA是雜環(huán)化合物合成、區(qū)域選擇性和立體選擇性化學(xué)反應(yīng)中的基礎(chǔ)材料[10]，目前大量用于食品抗氧化劑D-異抗壞血酸及其鹽類的工業(yè)生產(chǎn)中[11-15]。

粘質(zhì)沙雷氏菌屬于氧化細(xì)菌，其細(xì)胞質(zhì)膜上存在著與呼吸鏈相連的葡萄糖直接氧化系統(tǒng)[16-17]。該系統(tǒng)由膜結(jié)合的吡咯喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶（glucose dehydrogenase，GDH）[18-19]和膜結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性葡萄糖酸脫氫酶（gluconate dehydrogenase，GADH）[20-22]組成。在細(xì)胞的周質(zhì)空間中，GDH催化氧化來源于培養(yǎng)環(huán)境的葡萄糖為葡萄糖酸，而后GADH催化氧化葡萄糖酸為2KGA[23-24]。

作為氧化細(xì)菌葡萄糖代謝過程中一種重要的酶，多年來有關(guān)膜結(jié)合GADH的純化與酶學(xué)特性研究受到相關(guān)學(xué)者的關(guān)注。到目前為止，分離純化的膜結(jié)合GADH均來源于氧化細(xì)菌，如假單胞菌（Pseudomonas）[20-22]、克雷伯氏菌（K l e b s i e l l a）[22]、醋酸桿菌（Acetobacter）[22]、葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter）[25-26]、歐文氏菌（Erwinia）[27]、沙雷氏菌[28]等。相關(guān)研究結(jié)果表明，微生物來源的膜結(jié)合GADH均具有3 個(gè)亞基。其中：大亞基（脫氫酶亞基）為黃素蛋白，分子質(zhì)量為64.0～68.0 kDa；中亞基（細(xì)胞色素C亞基）含有細(xì)胞色素C，可能參與呼吸鏈中的電子傳遞，分子質(zhì)量為45.0～52.5 kDa；小亞基的功能尚不明確，分子質(zhì)量為15.5～22.0 kDa。盡管微生物來源的膜結(jié)合GADH結(jié)構(gòu)組成相似，但酶學(xué)性質(zhì)（如最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值）存在較大的差異。

粘質(zhì)沙雷氏菌JUIM03是本實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選的2KGA高產(chǎn)菌株，有望應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。本研究以粘質(zhì)沙雷氏菌JUIM03為材料，利用Triton X-114相分離法[29-30]提取膜蛋白，然后分離純化其中的GADH。在此基礎(chǔ)上，考察純化的膜結(jié)合GADH的酶學(xué)性質(zhì)，了解環(huán)境因子對其催化活性的影響，以期為粘質(zhì)沙雷氏菌2KGA生物合成的過程優(yōu)化與控制提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）JUIM03，由本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L，pH 7.0。

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)基：葡萄糖22.0 g/L，玉米漿粉5.0 g/L，尿素2.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，輕質(zhì)CaCO31.0 g/L，pH 7.0。

1.1.3 試劑

Triton X-114、Triton X-100、2,6-二氯靛酚（2,6-dichloroindophenol，DCIP）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）、改良型Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、DEAE-Sepharose Fast Flow填料生工生物（上海）股份有限公司；5×Protein十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）Loading Buffer、Premixed Protein Marker（Low） 寶生物工程（大連）有限公司；2KGA鈣鹽標(biāo)準(zhǔn)品 江莫省德興市百勤異VC鈉有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-18M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；L5型紫外-可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；BILON98-IIIDL型超聲波細(xì)胞破碎儀、YC-1型層析冷柜 上海比郎儀器有限公司；1260 Infinity高效液相色譜儀 美國Agilent公司；LPC-201型自動(dòng)中低壓層析系統(tǒng) 北京眾益中和生物技術(shù)有限公司；Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO30kDA）美國Milipore公司；Hydroxyapatite Fast Flow預(yù)裝柱（5 mL）、PowerPac Basic型電泳儀、GelDocTMXR+型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的分離純化

1.3.1.1 菌體細(xì)胞的培養(yǎng)與超聲破碎

從斜面中挑取活化的粘質(zhì)沙雷氏菌JUIM03，接種于菌種擴(kuò)大培養(yǎng)基（500 mL三角瓶的培養(yǎng)基裝量為50 mL）中，30 ℃、265 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)20 h，然后8 000 r/min離心10 min回集菌體，并用無菌水洗滌2 次。將回集的菌體細(xì)胞懸浮于含有10 g/L TritonX-114和150 mmol/L NaCl的10 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）中，調(diào)整細(xì)胞濃度至OD650nm為45.0左右，隨后在4 ℃、900 W的條件下超聲破碎細(xì)胞60 min，并對細(xì)胞的破碎效果進(jìn)行鏡檢觀察。

1.3.1.2 Triton X-114相分離法提取膜蛋白

在4 ℃、12 000 r/min條件下離心細(xì)胞破碎液30 min，棄去沉淀。將上清液置于37 ℃的水浴中保溫15 min，然后在25 ℃、12 000 r/min條件下離心5 min，使兩相分離（上層為水相，下層為去污劑相，膜蛋白溶解于去污劑相中）并分別回集。方回集的水相中添加TritonX-114至10 g/L，4 ℃下攪拌15 min至混合均勻，然后重復(fù)上述的兩相分離步驟。將3 次兩相分離得到的去污劑相合并，加入4 ℃的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）定容至離心所得上清液的原體積，4 ℃攪拌15 min，然后置于37 ℃水浴中保溫15 min，25 ℃、12 000 r/min離心5 min，使兩相分離。取去污劑相繼續(xù)加入4 ℃的PBS，再次進(jìn)行兩相分離，最后得到的去污劑相作為粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的粗酶液。

1.3.1.3 膜結(jié)合GADH的分離純化

參照文獻(xiàn)[22]的方法對粗酶液進(jìn)行鹽析，回集硫酸銨飽和度為25%～45%之間的沉淀組分。將鹽析得到的沉淀物懸浮于含有1 g/L TritonX-100、5 mmol/L MgCl2·6H2O和10 mmol/L D-葡萄糖酸鈉的10 mmol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 6.0，以下簡稱為緩沖液A）中并透析過夜。4 ℃、12 000 r/min條件下離心透析液5 min，然后將上清液上樣至已用緩沖液A平衡過的DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱（1.2 cm×60 cm）中，并依次用緩沖液A、含有0.1 mol/L KCl的緩沖液A、含有0.3 mol/L KCl的緩沖液A和含有0.5 mol/L KCl的緩沖液A洗脫，分部回集洗脫組分并測定其蛋白濃度和GADH活性。合并DEAE-Sepharose層析過程中回集的具有GADH活性的洗脫組分，超濾濃縮后用含有5 mmol/L MgCl2·6H2O和10 mmol/L D-葡萄糖酸鈉的10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.0，以下簡稱為緩沖液B）透析，再上樣至經(jīng)緩沖液B平衡過的Hydroxyapatite預(yù)裝柱（5 mL）中。上樣結(jié)束后，依次用緩沖液B、含有5 mmol/L MgCl2·6H2O和10 mmol/L D-葡萄糖酸鈉的100 mmol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）、含有1 g/L TritonX-100、5 mmol/L MgCl2·6H2O和10 mmol/L D-葡萄糖酸鈉的150 mmol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）進(jìn)行洗脫，然后分部回集洗脫組分。超濾濃縮具有GADH活性的洗脫組分，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.2.1 反應(yīng)溫度對膜結(jié)合GADH催化活性的影響及熱穩(wěn)定性分析

保持酶促反應(yīng)的其他條件不變，考察反應(yīng)溫度對酶活力的影響，確定膜結(jié)合GADH的最適反應(yīng)溫度。將最適反應(yīng)溫度下樣品的酶活力定義為100%，以此計(jì)算其余溫度下樣品的相對酶活力。

將純化的膜結(jié)合GADH置于不同的溫度下保溫處理一定時(shí)間，然后迅速冷卻并在最適反應(yīng)溫度下測定其殘留的酶活力。將未經(jīng)保溫處理的樣品在相同條件下的酶活力定義為100%，以此計(jì)算不同保溫處理?xiàng)l件下樣品的相對酶活力。

1.3.2.2 反應(yīng)pH值對膜結(jié)合GADH催化活性的影響及pH值穩(wěn)定性分析

保持其他反應(yīng)條件不變，考察反應(yīng)pH值對酶活力的影響，確定膜結(jié)合GADH的最適反應(yīng)pH值。將最適反應(yīng)pH值下樣品的酶活力定義為100%，以此計(jì)算其余pH值條件下樣品的相對酶活力。

將純化的膜結(jié)合GADH與不同pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（McIlvaine緩沖液）混合均勻，4 ℃處理16 h，然后在pH 6.0的反應(yīng)體系中測定各個(gè)處理樣品的酶活力，考察膜結(jié)合GADH的pH值穩(wěn)定性。將測得的處理樣品的最高酶活力定義為100%，以此計(jì)算其余pH值處理下樣品的相對酶活力。

1.3.2.3 金屬離子對膜結(jié)合GADH催化活性的影響

配制含有不同濃度、不同種類金屬離子的酶促反應(yīng)體系，保持其他反應(yīng)條件不變，在pH 6.0、最適反應(yīng)溫度下考察金屬離子對酶活力的影響。將未經(jīng)金屬離子處理的樣品在相同條件下的酶活力定義為100%，以此計(jì)算不同濃度、不同種類金屬離子處理樣品的相對酶活力。

1.3.2.4 變性劑和乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）對膜結(jié)合GADH催化活性的影響

將純化的膜結(jié)合GADH分別加入含有不同濃度的脲、巰基乙醇、SDS和EDTA的反應(yīng)體系中，保溫處理1 h，然后在最適反應(yīng)溫度下測定各個(gè)樣品的殘留酶活力。將未經(jīng)變性劑和EDTA處理的樣品在相同條件下的酶活力定義為100%，以此計(jì)算不同處理下樣品的相對酶活力。

1.3.2.5 有機(jī)溶劑對膜結(jié)合GADH催化活性的影響

配制含有不同濃度、不同種類有機(jī)溶劑的酶促反應(yīng)體系，以不添加任何有機(jī)溶劑的反應(yīng)體系為對照，保持其他反應(yīng)條件不變，在最適反應(yīng)溫度下考察有機(jī)溶劑對酶活力的影響。

1.3.2.6 有機(jī)酸對膜結(jié)合GADH催化活性的影響

配制含有不同濃度、不同種類有機(jī)酸的酶促反應(yīng)體系，以不添加任何有機(jī)酸的反應(yīng)體系為對照，保持其他反應(yīng)條件不變，在最適反應(yīng)溫度下考察有機(jī)酸對酶活力的影響。

1.3.2.7 膜結(jié)合GADH的底物特異性

分別利用相同濃度的不同碳源替代D-葡萄糖酸鈉作為酶促反應(yīng)體系中的底物，在最適反應(yīng)條件下測定膜結(jié)合GADH的催化活性。將D-葡萄糖酸鈉作為底物時(shí)的酶活力定義為100%，以此計(jì)算不同底物條件下膜結(jié)合GADH的相對酶活力。

1.3.2.8 膜結(jié)合GADH的Km值和Vm值

在pH 6.0、25 ℃的條件下，測定膜結(jié)合GADH催化氧化不同濃度D-葡萄糖酸鈉的反應(yīng)初速度。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，計(jì)算膜結(jié)合GADH的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vm。

1.3.3 分析方法

1.3.3.1 膜結(jié)合GADH的酶活力測定

參照Matsushita等[22]的方法進(jìn)行測定。反應(yīng)體系（3.0 mL）：10 mmol/L DCIP 0.1 mL，3 mmol/L PMS 0.1 mL，1.0 mol/LD-葡萄糖酸鈉0.1 mL，100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）1.0 mL，適量的膜結(jié)合GADH和蒸餾水。酶活力單位（U）的定義：25 ℃條件下，在上述反應(yīng)體系中，每分鐘還原1.0 μmol DCIP或者氧化1.0 μmolD-葡萄糖酸鈉所需要的酶量。比活力的定義：每毫克蛋白所具有的酶活力。

1.3.3.2 蛋白質(zhì)的測定與SDS-PAGE分析

參照文獻(xiàn)[18]方法。

1.3.3.3 膜結(jié)合GADH大亞基中黃素腺嘌呤二核苷酸的預(yù)測

參照Shinagawa等[25]的方法進(jìn)行預(yù)測。

1.3.3.4 膜結(jié)合GADH中細(xì)胞色素C的定性分析

參照Shinagawa等[28]的方法，將純化得到的膜結(jié)合GADH于0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）中透析過夜，調(diào)整其蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL左右。方酶液中加入適量的D-葡萄糖酸鈉或鐵氰化鉀，使膜結(jié)合GADH呈還原型或氧化型。以0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）為對照，分別測定還原型或氧化型膜結(jié)合GADH在波長400～600 nm的吸回光譜。

1.3.3.5 膜結(jié)合GADH催化氧化D-葡萄糖酸所形成的產(chǎn)物分析

反應(yīng)體系：32 mmol/LD-葡萄糖酸，16 mmol/L輕質(zhì)CaCO3，0.1 mmol/L PMS和適量純化膜結(jié)合GADH酶液，用蒸餾水定容。反應(yīng)條件為30 ℃、24 h。在反應(yīng)液中加入5 g/L的活性炭，75 ℃攪拌脫色20 min；抽濾除去不溶物，減壓（-0.096 MPa）濃縮濾液至無色結(jié)晶出現(xiàn)；4 ℃結(jié)晶4 h，過濾得到反應(yīng)產(chǎn)物；真空干燥，獲得無色粉末狀樣品，即為提取的反應(yīng)產(chǎn)物。將適量的2KGA（鈣鹽）標(biāo)準(zhǔn)品和反應(yīng)產(chǎn)物分別溶解于0.01 mol/L的KH2PO4溶液（pH 3.0），經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，備用，進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。HPLC采用Hypersil SAX色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.01 mol/L KH2PO4（pH 3.0）；流速1.0 mL/min；紫外檢測器；檢測波長216 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的分離純化

表1 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的純化Table 1 Summary of puri fication procedures of membrane-bound GADH from S. marcescens

圖1 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的DEAE-Sepharose離子交換層析Fig. 1 DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography of membranebound GADH from S. marcescens

圖2 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的Hydroxyapatite柱層析Fig. 2 Hydroxyapatite chromatography of membrane-bound GADH from S. marcescens

粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的分離純化結(jié)果如表1所示。Triton X-114相分離法是一種有效的膜蛋白提取方法。通過水相與去污劑相的分離，大部分的親水性蛋白被去除，膜結(jié)合GADH被純化了2.2 倍，且具有較高的回回率。在利用鹽析從提取膜蛋白中分離純化GADH的過程中，硫酸銨飽和度為25%～45%時(shí)，沉淀的蛋白具有很高的GADH活性，而從其他飽和度下的沉淀物中基本檢測不到GADH活力。經(jīng)過鹽析處理后，膜結(jié)合GADH被進(jìn)一步純化到3.3 倍，同時(shí)除去了膜蛋白中的Triton X-114。利用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析純化鹽析得到膜蛋白時(shí)，用含有0.1 mol/L KCl的緩沖液A洗脫的組分具有較高的GADH活性，其最大比活力為88.95 U/mg（圖1）。經(jīng)過陰離子交換純化后，膜結(jié)合GADH的比活力提高至80.95 U/mg，純化倍數(shù)增加至142.0 倍。利用Hydroxyapatite Fast Flow層析對經(jīng)過陰離子交換處理的膜蛋白進(jìn)行純化的過程中，用含有1 g/L TritonX-100、5 mmol/L MgCl2·6H2O和10 mmol/L D-葡萄糖酸鈉的150 mmol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）洗脫的組分具有較高的GADH活性，其最大比活力為103.25 U/mg（圖2）。經(jīng)過上述純化，獲得了比活力為91.43 U/mg的粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH，其最終的純化倍數(shù)為160.4，回回率為3.8%。

2.2 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 膜結(jié)合GADH的SDS-PAGE分析

圖3 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of membrane-bound GADH from S. marcescens

從圖3可以看出，經(jīng)鹽析處理后，大部分的雜蛋白被除去；經(jīng)DEAE-Sepharose陰離子交換層析后，具有GADH活性的洗脫液中的雜蛋白進(jìn)一步減少；經(jīng)Hydroxyapatite層析后，SDS-PAGE的凝膠上顯示出3 條明顯的條帶，分別對應(yīng)的分子質(zhì)量大約為65.0、45.0、23.0 kDa。上述結(jié)果表明，來源于粘質(zhì)沙雷氏菌JUIM03的膜結(jié)合GADH由3 個(gè)亞基組成，即65.0 kDa的大亞基（脫氫酶亞基）、45.0 kDa的中亞基（細(xì)胞色素C亞基）和23.0 kDa的小亞基，與來源于其他氧化細(xì)菌[20-22]的膜結(jié)合GADH在亞基組成上一致。

2.2.2 膜結(jié)合GADH大亞基中黃素腺嘌呤二核苷酸的預(yù)測

參照Shinagawa等[25]的方法，對純化的粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH進(jìn)行SDS-PAGE分離，然后將未染色的分離膠置于紫外光下，在對應(yīng)大亞基（脫氫酶亞基）的條帶位置可以觀察到熒光出現(xiàn)，說明純化的膜結(jié)合GADH大亞基中應(yīng)該含有黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）。用10%的三氯乙酸對純化的膜結(jié)合GADH進(jìn)行處理，然后對其進(jìn)行SDS-PAGE分離，再將未染色的分離膠置于紫外光下，仍能在對應(yīng)大亞基條帶的位置觀察到熒光出現(xiàn)，說明FAD與大亞基之間應(yīng)該是以共價(jià)鍵緊密結(jié)合的，即FAD在膜結(jié)合GADH中以輔基而不是輔酶的形式存在。

2.2.3 膜結(jié)合GADH中細(xì)胞色素C的定性分析

還原型的細(xì)胞色素C在可見光區(qū)具有特征性的吸回光譜，在波長550～555、520～525 nm和415～420 nm處有3 個(gè)吸回峰，即α吸回峰、β吸回峰和γ吸回峰。膜結(jié)合GADH中含有細(xì)胞色素C，其還原型的吸回光譜中具有典型的細(xì)胞色素C吸回峰；同時(shí)，因?yàn)槟そY(jié)合GADH中含有FAD，屬于黃素蛋白，其還原型在450 nm區(qū)域的吸光度明顯低于其氧化型的吸光度[28]。

圖4 純化的粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的吸收光譜Fig. 4 Absorption spectra of purified membrane-bound GADH from S. marcescens

從圖4可以看出，該酶還原型的吸回光譜中有3 個(gè)吸回峰，分別處于419、520、554 nm的位置，且其在450～500 nm區(qū)域內(nèi)的吸光度明顯低于其氧化型的吸光度，可以認(rèn)為本研究純化的膜結(jié)合GADH是含有細(xì)胞色素C的黃素蛋白。

2.2.4 膜結(jié)合GADH催化氧化D-葡萄糖酸所形成產(chǎn)物分析

2KGA是由膜結(jié)合的FAD依賴性GADH催化葡萄糖酸形成的產(chǎn)物[31]。從粘質(zhì)沙雷氏菌JUIM03純化的膜結(jié)合GADH催化氧化D-葡萄糖酸所形成的產(chǎn)物在HPLC中的保留時(shí)間為4.382 min，與2KGA鈣鹽標(biāo)準(zhǔn)品在HPLC中的保留時(shí)間4.287 min一致（圖5），說明本研究所純化的膜結(jié)合GADH可能是FAD依賴性GADH。

圖5 膜結(jié)合GADH催化氧化D-葡萄糖酸所形成的產(chǎn)物的HPLC分析Fig. 5 HPLC analysis of the products formed from D-gluconic acid under the catalysis of membrane-bound GADH

2.3 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 膜結(jié)合GADH的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

在20～40 ℃的范圍內(nèi)，粘質(zhì)沙雷氏菌JUIM03膜結(jié)合GADH的催化活性隨著反應(yīng)溫度的升高而增大，在溫度達(dá)到40 ℃時(shí)活性最大；當(dāng)反應(yīng)溫度高于40 ℃時(shí)，酶活力迅速下降，在60 ℃時(shí)幾乎無法檢測到膜結(jié)合GADH活力（圖6）。粘質(zhì)沙雷氏菌JUIM03膜結(jié)合GADH的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，明顯高于來源于2KGA工業(yè)發(fā)酵常用的假單胞菌的膜結(jié)合GADH最適反應(yīng)溫度（30 ℃）[20-22]，從側(cè)面預(yù)示了沙雷氏菌和假單胞菌2KGA合成對溫度條件的不同要求。

圖6 溫度對膜結(jié)合GADH催化活性的影響Fig. 6 Effect of temperature on membrane-bound GADH activity

30 ℃保溫45 min，粘質(zhì)沙雷氏菌JUIM03膜結(jié)合GADH活力沒有變化；40 ℃保溫45 min，酶活力降低了30%左右；50 ℃保溫30 min，酶活力降低了80%以上；60 ℃保溫15 min，酶活力完全喪失（圖7）。

圖7 膜結(jié)合GADH的熱穩(wěn)定性Fig. 7 Thermal stability of membrane-bound GADH from S. marcescens

2.3.2 膜結(jié)合GADH的最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定性

圖8 pH值對膜結(jié)合GADH催化活性和穩(wěn)定性的影響Fig. 8 Effect of pH on membrane-bound GADH activity and stability

如圖8所示，反應(yīng)體系的pH值從3.0升至5.0的過程中，膜結(jié)合GADH的催化活性呈上升趨勢；反應(yīng)體系的pH值從5.0升至8.0的過程中，酶的催化活性逐步降低直至完全失活。因此，該酶最適反應(yīng)pH值為5.0。將純化的膜結(jié)合GADH置于pH 5.0～7.0的緩沖液中處理16 h后，其酶活力沒有發(fā)生明顯的變化； 在pH值低于5.0或高于7.0的緩沖液中對膜結(jié)合GADH進(jìn)行處理，都會(huì)導(dǎo)致其酶活力的明顯下降。

2.3.3 金屬離子對膜結(jié)合GADH催化活性的影響

圖9 金屬離子對膜結(jié)合GADH催化活性的影響Fig. 9 Effect of metal ions on membrane-bound GADH activity

從圖9可以看出，膜結(jié)合GADH活力基本不被Na+影響；Mg2+對該酶的催化活性略有促進(jìn)作用；低濃度的Mn2+對酶活力略有促進(jìn)作用，而隨著濃度的增加又會(huì)抑制酶活力。Ni2+、Cd2+、Fe3+、Cu2+和Zn2+對膜結(jié)合GADH的催化活性均有抑制作用，且濃度越高抑制作用越強(qiáng)。其中，100 mmol/L的Fe3+、Cu2+或Zn2+均可使膜結(jié)合GADH活力喪失85%以上，甚至可完全抑制其活力。

2.3.4 變性劑和EDTA對膜結(jié)合GADH催化活性的影響

脲和EDTA對膜結(jié)合GADH的催化活性基本沒有影響，而巰基乙醇和SDS對膜結(jié)合GADH的催化活性均有抑制作用。10 mmol/L的巰基乙醇可使該酶活力下降30%左右；10 mmol/L的SDS可使該酶活力喪失90%左右（表2）。

表2 變性劑和EDTA對膜結(jié)合GADH催化活性的影響Table 2 Effects of denaturants and EDTA on membrane-bound GADH activity

2.3.5 有機(jī)溶劑對膜結(jié)合GADH催化活性的影響

有機(jī)溶劑通過降低酶分子周圍介質(zhì)的極性、增加酶分子周圍環(huán)境的疏水性而影響酶活力。如圖10所示，甘油對膜結(jié)合GADH的催化活性沒有影響，而甲醇、丙酮、異丙醇和乙醇對其具有明顯的抑制作用。在反應(yīng)體系中有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)為15%的條件下，甲醇或丙酮可使膜結(jié)合GADH的催化活性喪失80%左右，異丙醇可使其催化活性喪失90%左右，乙醇幾乎能夠完全抑制該酶的催化活性。

圖10 有機(jī)溶劑對膜結(jié)合GADH催化活性的影響Fig. 10 Effect of organic solvents on membrane-bound GADH activity

2.3.6 有機(jī)酸對膜結(jié)合GADH催化活性的影響

乙醇酸、乙醛酸和2KGA對膜結(jié)合GADH的催化活性幾乎沒有影響，而低濃度的草氨酸或草酸能對膜結(jié)合GADH的催化活性產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用（表3）。15 mmol/L的草酸可使膜結(jié)合GADH活力降低30%左右，5 mmol/L的草氨酸可使膜結(jié)合GADH活力降低90%以上。

表3 有機(jī)酸對膜結(jié)合GADH催化活性的影響Table 3 Effect of organic acids on membrane-bound GADH activity

2.3.7 膜結(jié)合GADH的底物特異性

以2KGA、DL-蘋果酸、L-抗壞血酸、酒石酸、檸檬酸、D-山梨醇、D-果糖、D-半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-甘露醇或L-阿拉伯糖代替D-葡萄糖酸鈉作為酶活力測定體系中的底物時(shí)，檢測不到膜結(jié)合GADH的催化活性。只有以D-葡萄糖酸鈉作為底物時(shí)，膜結(jié)合GADH才具有催化活性。因此，粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH具有嚴(yán)格的底物特異性。

2.3.8 膜結(jié)合GADH的Km值和Vm值

圖11 雙倒數(shù)法測定膜結(jié)合GADH的米氏常數(shù)Fig. 11 Km determination of membrane-bound GADH by Lineweaver-Burk plot

從圖11可以看出，在25 ℃、pH 6.0的條件下，反應(yīng)速率與底物D-葡萄糖酸濃度之間存在線性關(guān)系，其擬合方程為y=0.508 6x+0.381 8（R2=0.992 8），由此計(jì)算得到的Km值為1.33 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vm為2.62 μmol/（mL·min）。

2.3.9 不同微生物來源的膜結(jié)合GADH比較

微生物來源的膜結(jié)合GADH均具有嚴(yán)格的底物特異性，即只有在D-葡萄糖酸作為底物時(shí)才具有催化活性。在結(jié)構(gòu)和酶學(xué)特性上，不同微生物來源的膜結(jié)合GADH存在一定差異，主要反映在亞基的分子質(zhì)量、酶的最適反應(yīng)溫度、酶的最適反應(yīng)pH值和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km等方面（表4）。

表4 不同微生物來源的膜結(jié)合GADH的性質(zhì)Table 4 Properties of membrane-bound GADHs from various microorganisms

3 結(jié) 論

本研究以2KGA高產(chǎn)菌株粘質(zhì)沙雷氏菌JUIM03為材料，利用Triton X-114相分離法提取其膜蛋白，經(jīng)硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Hydroxyapatite層析步驟，獲得了比活力為91.43 U/mg的粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH，其最終的純化倍數(shù)為160.4 倍，回回率為3.8%。

SDS-PAGE分析表明，從粘質(zhì)沙雷氏菌JUIM03中純化的膜結(jié)合GADH由3 個(gè)亞基組成，其分子質(zhì)量分別為65.0、45.0、23.0 kDa左右，與來源于其他氧化細(xì)菌的膜結(jié)合GADH在亞基組成上是一致的。另外，純化的膜結(jié)合GADH的大亞基含有FAD，且FAD以輔基的形式與大亞基共價(jià)結(jié)合。可見光區(qū)吸回光譜分析結(jié)果表明，還原型的純化產(chǎn)物具有還原型細(xì)胞色素C的特征性吸回光譜，因此可以認(rèn)為所純化的膜結(jié)合GADH是含有細(xì)胞色素C的黃素蛋白。HPLC分析表明，純化的膜結(jié)合GADH催化氧化D-葡萄糖酸所形成的產(chǎn)物為2KGA，進(jìn)一步說明了所純化的膜結(jié)合GADH是FAD依賴性GADH。

酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，粘質(zhì)沙雷氏菌JUIM03膜結(jié)合GADH的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適反應(yīng)pH值為5.0，在30 ℃以下、pH 5.0～6.0的條件下較為穩(wěn)定；該酶具有嚴(yán)格的底物特異性，只有在D-葡萄糖酸作為底物時(shí)才具有催化活性，其Km值為1.33 mmol/L，Vm為2.62 μmol/（mL·min）；一些金屬離子（如Fe3+、Cu2+和Zn2+）、有機(jī)溶劑（乙醇、異丙醇、甲醇和丙酮）、變性劑（SDS和巰基乙醇）以及有機(jī)酸（草氨酸和草酸）對膜結(jié)合GADH的催化活性具有明顯的抑制作用。

該研究結(jié)果為粘質(zhì)沙雷氏菌2KGA生物合成的過程優(yōu)化與控制提供了一定的理論依據(jù)，同時(shí)也對2KGA酶法生產(chǎn)工藝的開發(fā)具有潛在的借鑒作用。