袁 悅，趙永強(qiáng)，楊賢慶,*，李來(lái)好，吳燕燕，魏 涯，岑劍偉

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005）

魚(yú)糜制品是以魚(yú)類(lèi)為原料，經(jīng)過(guò)采肉、漂洗、擂潰、凝膠化等工序加工制成，是我國(guó)魚(yú)類(lèi)精深加工的一個(gè)重要發(fā)展方方。魚(yú)糜制品味道鮮美、蛋白質(zhì)含量豐富、食用方便，且易工業(yè)化生產(chǎn)，越來(lái)越受到消費(fèi)者喜愛(ài)[1-2]。作為魚(yú)糜制品生產(chǎn)的重要原料，冷凍魚(yú)糜在凍藏過(guò)程中易發(fā)生冷凍變性，且其內(nèi)源性蛋白酶有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)自溶[3]，因此，有必要尋找方法或技術(shù)延緩蛋白質(zhì)的變性。另外，魚(yú)糜制品在冷凍貯藏過(guò)程中，脂質(zhì)在發(fā)生氧化變性時(shí)產(chǎn)生的自由基攻擊魚(yú)糜中的蛋白質(zhì)后生成α-氨基己二酸、γ-谷氨酸半醛及其他活性羰基衍生物等有害物質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化變性[4]。氧化后的蛋白質(zhì)更易發(fā)生交聯(lián)、聚集，進(jìn)而影響?hù)~(yú)糜的質(zhì)地特征、感官品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5]。因此，抑制魚(yú)糜冷凍貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)氧化引起的肌原纖維蛋白降解對(duì)維持魚(yú)糜品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。

多酚類(lèi)物質(zhì)在自然界中含量豐富，且擁有較強(qiáng)的自由基清除及金屬離子結(jié)合能力[6]，目前已有研究表明多酚類(lèi)物質(zhì)能夠有效抑制肉制品中蛋白質(zhì)的氧化。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中最有效的抗氧化多酚類(lèi)物質(zhì)，在清除體內(nèi)自由基、抗衰老、抗炎、抗癌、抗突變及改善肝功能等方面具有較好的功效[7]。根據(jù)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，為方便食品的生產(chǎn)、加工、包裝、運(yùn)輸或者貯藏，廠(chǎng)家可以使用食品添加劑，在肉灌腸類(lèi)食品中可以添加茶多酚作為抗氧化劑，且用量不得超過(guò)0.3 g/kg。為防止魚(yú)糜在凍藏過(guò)程中因蛋白質(zhì)的氧化變性而引起的魚(yú)糜品質(zhì)劣化，本實(shí)驗(yàn)以羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）冷凍魚(yú)糜為研究對(duì)象，探討EGCG對(duì)冷凍魚(yú)糜的抗凍效果，旨在為EGCG在冷凍魚(yú)糜中充當(dāng)抗凍保護(hù)劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活羅非魚(yú)購(gòu)于附近超市，體質(zhì)量（500±50）g。

EGCG（純度≥95%） 酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司；蛋白定量試劑盒、蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)試盒 南京建成生物工程有限公司；BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他常見(jiàn)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T50型均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司；HWS 24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；3K30型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；UV2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)Brookfield公司；基礎(chǔ)電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Image Scanner III掃描儀 美國(guó)GE公司。

1.3 方法

1.3.1 魚(yú)糜制作

將超市購(gòu)得的鮮活羅非魚(yú)擊暈，取背部肌肉，然后去皮得到魚(yú)片。用自來(lái)水沖盡魚(yú)片表面污漬，并用小刀切成塊狀，于豆?jié){機(jī)中初步絞碎，將碎肉與蒸餾水按照1∶4的比例漂洗2 次，之后按同樣的比例用0.25%的食鹽水漂洗1 次，整個(gè)漂洗過(guò)程盡量保持在10 ℃以下。碎肉漂洗后經(jīng)脫水于斬拌機(jī)中擂潰，隨后每份取1 kg魚(yú)糜，分別加入0.002 5%、0.01%、0.02%、0.03%的EGCG混合均勻（用5 mL水溶解EGCG，隨后引入魚(yú)糜中，用攪拌機(jī)混勻），最后分裝于-18 ℃冰箱中凍藏。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參考Manuel等[8]的方法并略作改動(dòng)。定期取0.50 g冷凍魚(yú)糜樣品，加入2.5 mL冰浴冷卻的Tris-HCl緩沖液（10.00 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2，5.00 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF）），在冰水浴的條件下以12 000 r/min均質(zhì)，為避免機(jī)器過(guò)熱，每均質(zhì)15 s停10 s，總時(shí)間為2 min。均質(zhì)后得到勻漿，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min。棄上清液，并于沉淀中加入10 倍體積的鹽溶液（0.60 mol/L NaCl，10.00 mmol/L Tris-HCl緩沖液，5.00 mmol/L PMSF，pH 7.2）后均質(zhì)混勻。將溶液放在冰水浴里面靜置25～30 min后，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，所得上清液即為肌原纖維蛋白溶液，并置于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.3 肌原纖維蛋白含量的測(cè)定

采用Bradford蛋白檢測(cè)試劑盒方法測(cè)定。

1.3.4 肌原纖維蛋白巰基含量的測(cè)定

參考Kittiphattanabawon等[9]的方法并略作修改。取0.50 mL提取的蛋白質(zhì)溶液（必要時(shí)加以稀釋?zhuān)?，空白?duì)照組則取0.60 mol/L的NaCl溶液，隨后加入4.50 mL的Tris-HCl緩沖液（0.20 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，8.00 mol/L尿素，20.00 g/L SDS，10.00 mmol/L EDTA），旋渦混勻1 min。接著取3.00 mL上述溶液，加入0.30 mL 5,5’-二硫代雙(2-硝基)苯甲酸（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）溶液（1.00 g/L DTNB，0.20 mol/L Tris-HCl，pH 8.0），最后利用恒溫水浴鍋水浴加熱，溫度40 ℃，時(shí)間25 min。雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各組溶液在波長(zhǎng)412 nm處的吸光度，巰基含量計(jì)算如式（1）所示[10-11]：

式中：A為412 nm波長(zhǎng)處的吸光度；n為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾吸光系數(shù)13 600 L/（mol?cm）；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 肌原纖維蛋白羰基含量的測(cè)定

采用蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)試盒測(cè)定方法。

1.3.6 SDS-PAGE分析

將提取的肌原纖維蛋白溶液用相應(yīng)的蛋白提取液稀釋到1.00 mg/mL左右，參考李娜等[12]的方法進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。將稀釋后的肌原纖維蛋白溶液與2×SDS-PAGE上樣緩沖液等體積混合，100 ℃水浴5 min，12 000 r/min離心5 min后，回集上清液作為電泳待上樣品。本實(shí)驗(yàn)選擇的分離膠12%，濃縮膠5%，上樣量為15.0 μL。電泳開(kāi)始時(shí)，先以80 V恒壓使樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線(xiàn)，之后將電壓切換到150 V，直到溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)R250染色，之后脫色至背景無(wú)色，最后掃描并分析條帶。

1.3.7 魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

將冷凍的羅非魚(yú)魚(yú)糜樣品解凍，然后絞碎，加入2.5%食鹽并擂潰3 min，灌入腸衣。采用二段式加熱（40 ℃加熱30 min，90 ℃加熱15 min）使其凝膠化[13]，冷卻至室溫后于4 ℃冰箱過(guò)夜。將樣品切成25 mm高的圓柱體，用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定凝膠強(qiáng)度。探頭直徑5 mm、下壓位移15 mm、觸發(fā)值5 g、測(cè)試速率1.0 mm/s。凝膠強(qiáng)度計(jì)算如式（2）所示：

1.3.8 魚(yú)糜凝膠持水性的測(cè)定

將1.3.7節(jié)制得的魚(yú)糜凝膠樣品切成3 mm的薄片，稱(chēng)其質(zhì)量記為m1，然后薄片上下均放3 層濾紙，最后放置5 kg的重物，10 min后稱(chēng)其質(zhì)量記為m2。壓出水分代表持水性，其計(jì)算如式（3）所示：

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007作圖，SPASS 22.0進(jìn)行方差分析。各組計(jì)算數(shù)據(jù)均以表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG添加量對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維鹽溶性蛋白含量的影響

圖1 羅非魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維鹽溶性蛋白含量的變化Fig. 1 Changes in salt solubility of myofibrillar protein from Nile tilapia surimi during frozen storage

魚(yú)糜中的蛋白質(zhì)包含鹽溶性蛋白、水溶性蛋白以及不溶性蛋白，魚(yú)糜凝膠形成機(jī)理主要是肌原纖維蛋白通過(guò)氫鍵、二硫鍵、離子鍵等化學(xué)作用力形成三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的過(guò)程[1]，且魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度與鹽溶性蛋白含量呈極顯著正相關(guān)[14]，因此鹽溶性蛋白含量的高低是魚(yú)糜品質(zhì)的重要影響因素。如圖1所示，隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，5 組羅非魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維鹽溶性蛋白呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）。其中，空白組、EGCG添加組魚(yú)糜肌原纖維鹽溶性蛋白含量分別從凍藏第1周的（18.80±0.56）、（19.95±1.20）、（20.33±0.49）、（20.27±0.55）、（19.57±0.06）mg/g下降至第10周的（5.98±0.44）、（7.02±0.13）、（9.25±0.27）、（7.08±0.38）、（6.37±0.45）mg/g，下降率分別為68.2%、64.8%、54.5%、65.1%與67.5%。由此可知，EGCG添加組肌原纖維鹽溶性蛋白下降率減少，且當(dāng)EGCG添加量為0.01%時(shí)，肌原纖維鹽溶性蛋白下降的幅度最少。汪金林[15]在研究茶多酚對(duì)冷藏養(yǎng)殖大黃魚(yú)品質(zhì)影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)茶多酚處理組的魚(yú)肉肌原纖維鹽溶性蛋白下降速度減慢，且隨著茶多酚濃度的增加，下降速率越小。

2.2 EGCG添加量對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白巰基含量的影響

巰基是肌原纖維蛋白中最具反應(yīng)活性的功能基團(tuán)，魚(yú)糜在凍藏期間，巰基易被氧化成二硫鍵導(dǎo)致含量下降。此外，蛋白質(zhì)發(fā)生冷凍變性引起空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，隱藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的巰基暴露，進(jìn)而被氧化成二硫鍵，導(dǎo)致總巰基含量進(jìn)一步下降[16]。二硫鍵的形成會(huì)影響蛋白質(zhì)的一些功能特性如持水、乳化能力和可溶性等，因而巰基含量的變化可以反映出蛋白質(zhì)變性的程度[17]。如圖2所示，在前2 周的凍藏期間，魚(yú)糜肌原纖維蛋白總巰基含量增加，可能是由于肌原纖維蛋白發(fā)生冷凍變性，空間結(jié)構(gòu)易位，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的巰基暴露出來(lái)，同時(shí)凍藏初期的巰基氧化較少，導(dǎo)致總巰基含量有一個(gè)小幅度上升；2 周后，各組羅非魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白總巰基含量顯著下降（P＜0.05）；凍藏至第10周，空白組和添加0.002 5%、0.01%、0.02%、0.03% EGCG的魚(yú)糜組肌原纖維蛋白總巰基含量分別從凍藏前的8.11×10-5、8.65×10-5、9.25×10-5、9.22×10-5mol/g和8.39×10-5mol/g降低到3.01×10-5、3.76×10-5、4.7×10-5、3.27×10-5mol/g和3.09×10-5mol/g，分別降低了62.9%、56.5%、49.2%、64.5%和63.2%，且0.01% EGCG魚(yú)糜組總巰基含量顯著高于其他組（P＜0.05）。由此可知，添加EGCG一定程度上能夠抑制肌原纖維蛋白巰基含量的下降，但當(dāng)EGCG添加量過(guò)高時(shí)，反而會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白巰基含量下降，可能的原因是部分EGCG氧化成相應(yīng)的醌類(lèi)物質(zhì)，而醌類(lèi)物質(zhì)既可能催化巰基方二硫鍵轉(zhuǎn)變，又可能直接與巰基共價(jià)結(jié)合，這都會(huì)導(dǎo)致巰基含量的降低。Amjad等[18]研究發(fā)現(xiàn)，氧化多酚（阿魏酸、單寧酸、兒茶素和咖啡酸）添加會(huì)引起魚(yú)糜蛋白巰基含量降低，二硫鍵含量升高；Cao Yungang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度綠原酸添加會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白巰基含量降低。

2.3 EGCG添加量對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白羰基含量的影響

圖3 羅非魚(yú)魚(yú)糜中肌原纖維蛋白羰基含量的變化Fig. 3 Changes in carbonyl content of myofibrillar protein from Nile tilapia surimi during frozen storage

蛋白質(zhì)羰基化是一種不可逆的、非酶促引起的蛋白質(zhì)修飾，魚(yú)糜在凍藏時(shí)容易發(fā)生氧化羰基化，破環(huán)蛋白質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)，進(jìn)而影響?hù)~(yú)糜的品質(zhì)，因此羰基含量常用作魚(yú)糜蛋白質(zhì)氧化變性的一個(gè)重要指標(biāo)[20]。由圖3可知，隨著魚(yú)糜凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組羰基含量呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明魚(yú)糜肌原纖維蛋白發(fā)生了不同程度的氧化。凍藏前4 周，各組魚(yú)糜肌原纖維蛋白羰基含量上升趨勢(shì)較緩慢，且空白組羰基含量顯著高于EGCG添加組（P＜0.05）；4 周以后，各組魚(yú)糜中蛋白質(zhì)羰基含量上升速度加快，到了凍藏末期，空白組羰基含量達(dá)到了（6.32±0.78）nmol/mg，各EGCG添加組分別為（4.86±0.09）、（3.69±0.11）、（3.76±0.16）、（3.66±0.45）nmol/mg，蛋白質(zhì)羰基含量上升幅度均顯著低于空白組（P＜0.05），且EGCG添加量為0.01%、0.02%、0.03%時(shí)沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。此結(jié)果與Manuel等[8]在研究茶多酚對(duì)馬鮫魚(yú)（Scomberomorus niphonius）魚(yú)糜肌原纖維蛋白羰基化的抑制效果相類(lèi)似。

2.4 SDS-PAGE分析

肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白約占肌原纖維蛋白的70%[21]。由圖4能夠清晰看到肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和5 個(gè)未知條帶。圖中沒(méi)有出現(xiàn)肌球蛋白輕鏈，可能的原因是長(zhǎng)時(shí)間的凍藏導(dǎo)致輕鏈降解。此外，EGCG添加組的肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白以及未知名蛋白質(zhì)（I、II）條帶顏色較空白組深，而原肌球蛋白和未知名蛋白質(zhì)（III、IV、V）條帶與空白組基本相同，說(shuō)明EGCG對(duì)肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白以及未知名蛋白質(zhì)（I、II）具有一定的保護(hù)作用，而對(duì)原肌球蛋白和未知名蛋白質(zhì)（III、IV、V）的降解沒(méi)有明顯抑制作用，最后，添加了0.01% EGCG的組蛋白條帶顏色最深。結(jié)果表明，冷凍羅非魚(yú)魚(yú)糜在凍藏過(guò)程中，肌原纖維蛋白容易受到冷凍變性、氧化變性、自身蛋白酶及微生物蛋白酶共同作用而降解。另外，空白組降解速率明顯快于EGCG添加組，故EGCG在一定程度上能夠延緩肌原纖維蛋白的降解和變性，且添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的EGCG效果最佳。Sun Lijun等[22]研究了青蘋(píng)果多酚對(duì)草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）魚(yú)糜的影響，發(fā)現(xiàn)添加青蘋(píng)果多酚的組肌原纖維蛋白條帶密度明顯比空白組高，且此研究還能略微看到肌球蛋白輕鏈條帶。

圖4 凍藏末期肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE profiles of myofibrillar protein at the end of frozen storage

2.5 EGCG添加量對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的影響

圖5 -18 ℃凍藏過(guò)程中羅非魚(yú)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的變化Fig. 5 Changes in gel properties of Nile tilapia surimi during frozen storage at -18 ℃

凝膠強(qiáng)度發(fā)生變化，可以一定程度說(shuō)明肌原纖維蛋白發(fā)生了變化，同時(shí)魚(yú)糜的品質(zhì)也在發(fā)生變化。如圖5所示，隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），其中空白組基本呈顯著直線(xiàn)下降（R=0.997），而EGCG添加組的凝膠強(qiáng)度在前面4 周下降趨勢(shì)較為緩慢，之后速度變快。凍藏末期，空白組魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度由4 330.91 g·mm下降到909.23 g·mm，下降幅度達(dá)79.0%，其中EGCG添加量為0.01%時(shí)，凝膠強(qiáng)度顯著高于其他各組（P＜0.05），由起初的4 285.81 g·mm下降到1 739.20 g·mm，下降率為59.4%，為抗凍效果最好的一組。EGCG屬于多酚類(lèi)物質(zhì)，含有大量的羥基，可能與蛋白質(zhì)形成牢籠式結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物從而束縛大量水分子，同時(shí)減少了水溶性蛋白對(duì)魚(yú)糜凝膠的影響，使得凝膠結(jié)構(gòu)更為致密，凝膠強(qiáng)度變高[3]。此外，凍藏末期，EGCG添加量為0.02%和0.03%時(shí)，魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度顯著低于其他EGCG組（P＜0.05），表明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)EGCG對(duì)魚(yú)糜的抗凍效果要比低質(zhì)量分?jǐn)?shù)EGCG差。Jongberg等[23]發(fā)現(xiàn)高濃度綠茶提取物破壞乳化肉體系的凝膠性能，但低濃度并無(wú)顯著影響；曹云剛[24]研究發(fā)現(xiàn)，在輕度氧化條件下，添加少量沒(méi)食子酸能提高肌原纖維蛋白的凝膠性能，過(guò)量則會(huì)明顯破壞其凝膠性能。

2.6 EGCG添加量對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)糜持水性的影響

圖6 -18 ℃凍藏過(guò)程中羅非魚(yú)魚(yú)糜凝膠持水性的變化Fig. 6 Changes in water-holding capacity of Nile tilapia surimi during frozen storage at -18 ℃

持水性是指魚(yú)糜凝膠在強(qiáng)烈擠壓下維持水分的能力[25]，壓出的水分越少，樣品的持水性越好[26]。反之，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越不致密，凝膠特性越差。因此持水性的大小也是決定魚(yú)糜凝膠品質(zhì)的重要因素之一。如圖6所示，空白組和EGCG添加組魚(yú)糜凝膠壓出水分顯著上升（P＜0.05），表明持水性降低。前4 周，空白組魚(yú)糜持水性逐漸降低，各EGCG添加組魚(yú)糜持水性降低速度較空白組慢；4 周之后，各組魚(yú)糜持水性下降速度加快，其中添加0.002 5%和0.01% EGCG的魚(yú)糜組持水性相對(duì)于其他組而言，凝膠持水性下降趨勢(shì)比較緩慢；凍藏末期，添加0.02%和0.03% EGCG的魚(yú)糜組壓出水分顯著高于空白組（P＜0.05），表明EGCG添加量過(guò)大反而促使羅非魚(yú)魚(yú)糜凝膠持水性降低，可能是由于EGCG濃度過(guò)大，與蛋白質(zhì)間相互作用形成的混合體系與其他成分交叉連接變多，導(dǎo)致大顆粒的形成和難溶物質(zhì)的凝集，這種聚集現(xiàn)象導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間接觸頻率減少，使得蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)斷裂[27-28]，鎖水能力下降，凝膠的持水性下降，此結(jié)果說(shuō)明低添加量EGCG對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)糜具有一定的保水效果，反之則有害，這與凝膠強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)果相似。米紅波等[29]研究發(fā)現(xiàn)，添加6-姜酚后草魚(yú)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度和持水性明顯高于空白組，且添加量為1%時(shí)效果最好。

3 討 論

作為優(yōu)質(zhì)天然高效抗氧化劑，植物多酚或者富含多酚的植物提取物逐漸被應(yīng)用于肉制品中以替代可能對(duì)人體健康具有潛在危害的合成抗氧化劑[30-31]。多酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化機(jī)理在于[32-34]：1）酚羥基可作為氫供體，具有良好的自由基清除能力，能有效減慢或終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；2）多酚類(lèi)物質(zhì)具有金屬離子螯合能力；3）酚類(lèi)化合物可以通過(guò)非共價(jià)相互作用與某些促氧化酶結(jié)合，抑制酶的活性，達(dá)到抗氧化效果。

在凍藏過(guò)程中，魚(yú)糜蛋白易發(fā)生冷凍變性和蛋白質(zhì)氧化變性[35]。結(jié)果顯示，肌原纖維蛋白巰基含量在凍藏期間先小幅度上升，隨后逐漸下降，可能原因是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生改變，分子內(nèi)部巰基暴露，肌原纖維蛋白降解[36-37]。EGCG影響了冷凍羅非魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白巰基含量，很可能是因?yàn)镋GCG含有的8 個(gè)羥基通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的作用與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)結(jié)合，延緩疏水基團(tuán)的釋放，從而抑制肌原纖維蛋白降解[38]。此外，在凍藏過(guò)程中魚(yú)糜蛋白發(fā)生氧化羰基化作用，導(dǎo)致肌原纖維蛋白羰基含量上升，破壞了蛋白質(zhì)的完整性，添加EGCG后，羰基含量明顯減少，這可能要?dú)w因于EGCG的自由基清除能力及金屬離子螯合能力[39]，咖啡酸能有效阻止魚(yú)糜在加工及凍藏時(shí)蛋白質(zhì)的氧化[40]；Shi Ce等[41]發(fā)現(xiàn)葡萄籽及丁香苞提取物能減緩凍藏時(shí)鰱魚(yú)（Hypophthalmichthys molitrix）蛋白質(zhì)的氧化。

冷凍魚(yú)糜中肌原纖維蛋白含量最為豐富，將其斬拌后添加配料，灌入腸衣，經(jīng)過(guò)加熱后得到彈性凝膠體。有不少研究[42-44]表明，冷凍魚(yú)糜在凍藏時(shí)鹽溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活性隨凍藏時(shí)間延長(zhǎng)而降低、液滴損失隨凍藏時(shí)間延長(zhǎng)而增加，這些指標(biāo)變化通常與魚(yú)糜持水性相關(guān)聯(lián)。從本實(shí)驗(yàn)可以看出，隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組魚(yú)糜鹽溶性蛋白含量、凝膠強(qiáng)度、持水性均逐漸下降，可能的原因是蛋白質(zhì)發(fā)生冷凍變性及氧化降解。此外，與空白組相比，EGCG能有效抑制肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白以及未知名蛋白質(zhì)（I、II）的降解，肌球蛋白重鏈降解程度與水產(chǎn)品蛋白質(zhì)冷凍變性程度呈正相關(guān)[45]，且當(dāng)EGCG添加量為0.01%時(shí)，效果最佳。

綜上，EGCG在冷凍羅非魚(yú)魚(yú)糜的凍藏過(guò)程中能有效防止蛋白質(zhì)變性，提高魚(yú)糜的品質(zhì)，有望作為一種新型抗凍劑。但EGCG添加量不宜過(guò)大，否則會(huì)起相反作用，魚(yú)糜中EGCG添加量為0.01%時(shí)，肌原纖維鹽溶性蛋白含量下降最少；總巰基含量降低最少；凝膠強(qiáng)度下降最低；持水性下降最低，魚(yú)糜還能保持較好品質(zhì)。今后的研究還需要考察EGCG添加量過(guò)大反而會(huì)引起魚(yú)糜品質(zhì)劣化的原因，及應(yīng)用其他新技術(shù)分析EGCG對(duì)魚(yú)糜的抗凍作用機(jī)理。